Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

La spectroscopie ultrarapide force-pince est une technique à molécule unique basée sur des pincettes laser qui permet d’étudier la chimiomécanique des moteurs de myosines sous charge avec la résolution temporelle la plus élevée. Cette technique permet de sonder des événements très rapides dans la production de force en maintenant la force constante pendant chaque phase de l’interaction motrice avec un contrôle total de la directionnalité de la force. En effectuant les ajustements appropriés, ce protocole pourrait être facilement appliqué à d’autres types de moteurs de process, y compris les kinésines et les dynéines, pour découvrir la régulation par la force.

Après avoir monté un jeu de déflecteurs acousto-optiques sur un traducteur linéaire, prenez un iris et ajustez son ouverture pour s’adapter à la taille de l’ouverture arrière de l’objectif. Remplacez l’objectif par le diaphragme centré sur le boîtier fileté de l’objectif. Déplacez le traducteur vers le faisceau laser jusqu’à ce que la partie du faisceau bloquée par le cristal piézoélectrique soit visible après l’iris, et tournez le traducteur légèrement vers l’arrière jusqu’à ce que le faisceau remplisse complètement l’ouverture de l’iris.

Pour préparer des billes de silice dans de l’acétate de pentyle, diluez d’abord 20 microlitres de billes de silice solide à 1,2 micron à 10% dans 1-1,5 millilitres d’acétone avec vortex et 30 secondes de sonication. Après sonication, recueillir les billes par centrifugation et remettre en suspension la pastille de bille dans 1 millilitre d’acétone fraîche pour un deuxième lavage. Après le deuxième lavage à l’acétone, laver les billes trois fois dans 1 millilitre d’acétate de pentyle frais par lavage dans les mêmes conditions de centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de 1% de nitrocellulose et 900 microlitres d’acétate de pentyle.

Ensuite, utilisez un morceau de mouchoir en papier imbibé d’éthanol pur pour essuyer soigneusement un couvercle de verre de 24 x 24 millimètres avant d’utiliser une pince à épiler propre pour rincer le verre directement dans l’éthanol et laisser sécher le couvercle sous un léger flux d’azote. Vortex et soniquer le stock de billes de silice préparées pendant 30 secondes et utiliser une lamelle de couverture de 24 x 60 millimètres nettoyée à l’éthanol pour étaler 2 microlitres de solution de billes de silice sur la surface de la plus petite lamelle de couverture. Pendant que les billes sèchent, nettoyez une lame de 26 x 76 millimètres comme démontré et placez deux lignes de 60 à 100 microns d’épaisseur de 3 millimètres recto-verso collées sur les longs bords de la glissière.

À l’aide d’une pince à épiler propre, placez le couvercle recouvert de perles sur le ruban avec les perles tournées vers l’intérieur de la chambre coulissante et remplissez la chambre avec un tampon phosphate de 15 millimolaires et une solution flottante de billes de polystyrène. Ensuite, scellez la chambre avec de la graisse de silicium. Pour calibrer le rapport pixel/nanomètre de la caméra à fond clair, acquérir une première image d’une bille de silice sur la surface de la lamelle de couverture à environ 5 microns du centre du champ de vision.

Déplacez la scène pour déplacer la perle de 10 microns vers le centre du champ de vision et prenez une deuxième image. Calculez la constante d’étalonnage de la caméra en mesurant la distance en pixels entre deux positions du cordon. Pour calibrer la position du piège, piéger une seule particule flottante dans un piège et déplacer les déflecteurs acousto-optiques par pas de 0,2 mégahertz, en acquérant une image de la particule et la fréquence correspondante des déflecteurs pour chaque étape.

Ensuite, répétez l’étalonnage pour le deuxième piège de la même manière. Pour calibrer la puissance et la rigidité du piège, piéger une seule particule dans chaque piège et déplacer les deux pièges à l’aide des déflecteurs acousto-optiques par pas de 0,2 mégahertz, en enregistrant un mouvement brownien de la particule dans les deux pièges avec des détecteurs de photodiodes quadrant et la fréquence correspondante des déflecteurs acousto-optiques. Obtenir des constantes d’étalonnage en ajustant une fonction lorentzienne à un spectre de puissance du mouvement brownien enregistré.

Pour assembler un échantillon à mesurer, ajouter 1 milligramme par millilitre de BSA biotinylé dans une nouvelle chambre avec des billes de silice sur la surface de la lamelle de couverture. Après 5 minutes, laver la chambre avec un tampon AB et ajouter 1 milligramme par millilitre de streptavidine dans la chambre. Après 5 minutes, laver la chambre comme démontré et ajouter 3 nanomolaires biotinylées de méromyosine lourde 5B dans un tampon M5B complété par 2 micromolaires Calmodulin.

Après 5 minutes, laver la chambre trois fois avec 1 milligramme par millilitre de BSA biotinylé complété par 2 micromolaires Calmodulin dans un tampon AB et attendre 3 minutes après le lavage final. Écoulement du mélange réactionnel et sceller la chambre avec de la graisse de silicium. Pour mesurer l’échantillon, placez la chambre sur la platine du microscope et déplacez l’objectif jusqu’à ce que les billes flottantes d’alpha-actinine soient mises au point.

Allumez un piège et piègez une perle. Une fois le premier piège occupé, déplacez le traducteur pour positionner le cordon piégé près de la surface de la glissière de couverture pour éviter de piéger plusieurs perles et piéger une perle dans le deuxième piège. Déplacer l’échantillon à travers les traducteurs à longue portée pour localiser les filaments d’actine d’au moins 5 microns de longueur dans la solution.

Lorsqu’un filament a été repéré, déplacez l’échantillon pour laisser une perle piégée s’approcher d’une extrémité du filament. Une fois le filament fixé, ajustez la distance du cordon à la longueur approximative du filament et déplacez la platine pour créer un écoulement dans la direction du cordon non lié. Le filament sera étiré par l’écoulement et finira par se lier à la deuxième perle.

Le complexe résultant est appelé haltère"Pour établir le contact actine-myosine, séparez doucement les deux pièges et réglez le filament à des niveaux de prétension allant jusqu’à environ 3 piconewtons. Pour sonder la rigidité de l’haltère, faire osciller un piège dans une onde triangulaire en changeant la fréquence d’un déflecteur acousto-optique et en vérifiant la transmission conséquente du mouvement au cordon de fuite par son signal de position. Déplacez la scène pour positionner l’haltère à proximité d’une perle de silice sur piédestal et ajustez la hauteur de l’haltère de sorte que le filament d’actine entre en contact avec la surface de la bille de silice.

Comme observé dans cet enregistrement de position représentative, lorsque le moteur de myosine n’interagit pas avec le filament d’actine, les billes piégées se déplacent à une vitesse constante contre la force de traînée visqueuse de la solution. Une fois que le moteur de myosine commence à interagir avec le filament, la force transportée par le filament en mouvement est très rapidement transférée à la protéine, et la vitesse du système tombe à zéro, les événements de pas se produisant sous force constante jusqu’à la fin de la course. La force est commutée de la direction positive à la direction négative par le système de rétroaction, qui commute la direction de la force lorsque la bille atteint le bord de la plage d’oscillation définie par l’utilisateur.

Lorsque la myosine se lie et déplace le filament vers la direction positive, elle pousse le cordon vers le bord supérieur de la plage d’oscillation. Si cela se produit sous force d’assistance, la course de la myosine sera interrompue par l’inversion de la direction de la force au bord de l’oscillation, limitant la durée de la course à l’amplitude de l’oscillation de l’haltère. Un alignement précis du système optique est nécessaire pour obtenir la résolution spatiale et temporelle optimale, tandis qu’un étalonnage précis est nécessaire pour déterminer avec précision les valeurs des forces appliquées.

Cette technique a été adaptée pour étudier la recherche glissante et ciblée des facteurs de transcription dans l’ADN ainsi que les interactions dynamiques entre les protéines de mécanotransduction induisant sur les filaments de microtubules.