Protocole de dissection automatisé pour l’enrichissement des tumeurs dans les tissus à faible teneur tumorale

L’isolement ou l’enrichissement de petites régions dispersées d’intérêt à partir de FFPE, ou de matières fraîches congelées, peut être réalisé avec une dissection automatisée plus rapidement et plus efficacement qu’avec des méthodes traditionnelles. L’extraction de matériel génomique à partir de FFPE, ou de tissus frais congelés, est une exigence pour de nombreux laboratoires de recherche clinique et translationnelle. La dissection automatisée comble un écart important entre la macro dissection et la micro dissection par capture laser.

Pour commencer, annotez les images de diapositives numérisées pour les régions tumorales d’intérêt, à l’aide d’une plate-forme de visualisation fournie par le fournisseur ou d’une visionneuse open source. Placez la lame de tissu d’échantillon non colorée sur la scène en position de la première à la quatrième diapositive lorsque vous utilisez une référence de diapositive numérique. Créez une tâche de fraisage à l’aide du logiciel automatisé de dissection de tissus en ouvrant la liste Des tâches, puis sélectionnez Créer une nouvelle tâche, puis entrez l’ID et le nom de la casse pour entrer le nom de la tâche.

Accédez à Epaisseur, puis sélectionnez l’épaisseur de section à l’aide de l’onglet flèche haut ou bas. Ensuite, allez dans Préparation des tissus et sélectionnez Paraffinisé ou Déparaffinisé. Sélectionnez Image de référence"À partir du fichier, puis Importer l’image.

Ensuite, sélectionnez le fichier à importer dans la liste déroulante en tant que référence numérique. Scannez la scène en sélectionnant le bouton Scan stage dans le coin inférieur droit pour capturer chaque diapositive de tissu d’échantillon en première et quatrième position. Pour la référence sur scène, faites glisser la zone pour créer une zone rectangulaire sur le tissu, puis sélectionnez la bulle circulaire sous la zone rectangulaire pour capturer l’image de référence de la scène.

Copiez ce champ rectangulaire sur les diapositives de tissu d’échantillon restantes dans les deuxième à quatrième positions de diapositive en sélectionnant l’option de copie dans le coin supérieur droit de l’image de référence. Ensuite, alignez et redimensionnez si nécessaire. Pour l’image de référence numérique, superposez l’image sur la zone rectangulaire sélectionnée.

Ensuite, redimensionnez et alignez la référence numérique grossièrement, bien sûr, zoomez, pour correspondre au mieux à la taille et à la position sur le tissu de l’échantillon. Copiez ce champ rectangulaire sur les diapositives de tissu d’échantillon restantes dans les deuxième à quatrième positions de diapositive en sélectionnant l’option de copie dans le coin supérieur droit de l’image de référence. Ensuite, alignez et redimensionnez si nécessaire.

Sélectionnez le bouton Scan stage"dans le coin inférieur droit pour passer à l’étape de réglage fin. Sélectionnez la position de la première étape et l’icône de l’outil Transformation dans la barre d’outils de droite pour effectuer des ajustements d’alignement et de zoom précis de la référence afin de correspondre au mieux à la superposition de diapositives d’échantillon. Utilisez la référence à la barre coulissante de l’échantillon en bas de l’écran, en basculant entre les images de référence et d’exemple.

Et la fonction de zoom avant et de zoom arrière pour ajuster et obtenir l’alignement de chaque position de diapositive. Une fois la superposition d’échantillon optimale obtenue, dessinez les désignations de tracé de fraisage sur la partie colorée de l’image de référence masquée en sélectionnant l’icône de l’outil de sélecteur de couleurs dans la barre d’outils de droite. Dessinez les tracés de fraisage sur les diapositives d’exemple en sélectionnant le bouton Obtenir des annotations dans le coin inférieur droit de l’écran.

Capturez et collectez la région annotée d’intérêt avec quatre pointes de fraisage ou moins lorsque le chemin de fraisage est calculé. L’utilisation de la pointe de fraisage dans le coin supérieur gauche est calculée en fonction de la zone couverte et de la taille de la pointe sélectionnée. La taille de la pointe peut être modifiée sous la flèche de la pointe de fraisage et l’utilisation de la pointe sera recalculée.

Lorsque le tracé de fraisage est sélectionné dans la première position de diapositive, il est copié sur les positions de diapositive restantes. Sélectionnez le bouton « Étape de configuration » dans le coin inférieur droit de l’écran pour charger rapidement les embouts de fraisage des tubes de collecte dans leur désignation appropriée sur la scène. Remplissez le réservoir avec trois millilitres de tampon de dissection approprié pour le type de tissu et pour l’extraction d’acides nucléiques en aval.

Ensuite, sélectionnez le bouton Dissect"dans le coin inférieur droit de l’écran. Après la dissection automatisée, retirez les tubes de prélèvement et les lames d’échantillon disséquées de la scène. Placez les tubes de collecte dans le porte-tubes et les glissières dans le porte-lames.

Le formol coloré H & E, la paraffine fixe incorporée et les sections de foie de souris fraîchement congelées contenant un cancer colorectal métastatique dans des xénogreffes ont été scannés sur un imageur de diapositives entières à un grossissement de 20x et utilisés comme diapositives de référence. Les lames de référence colorées H & E ont été annotées et masquées numériquement pour les régions tumorales pour la dissection et l’extraction des acides nucléiques. Les lames d’échantillon post-disséquées ont été colorées H & E pour confirmer les zones de dissection dans des lames de 10 micromètres et 20 micromètres.

Les mesures capturées ont démontré le succès de la dissection automatisée et de l’extraction des acides nucléiques. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit qu’il est important d’obtenir une superposition relativement précise d’annotations sur les diapositives non colorées pour isoler les zones d’intérêt.