^{15 ans} N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale

Ici, une description détaillée du protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de profils de dispersion de relaxation ^{de 15}N par spectroscopie RMN en solution est fournie.

Ce protocole peut être utilisé pour la détection et la caractérisation de la dynamique conformationnelle des protéines, qui sont essentielles pour comprendre une grande variété de processus cellulaires. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode ne nécessite pas d’étapes spécialisées dans la préparation de l’échantillon et fournit une caractérisation complète de la cinétique, de la thermodynamique et des aspects structurels de l’équilibre de confirmation. La dispersion de relaxation CPMG peut être appliquée plus largement pour la caractérisation de la dynamique de confirmation dans les acides nucléiques et autres biomolécules, ainsi que pour la caractérisation des interactions entre les nanoparticules de ligands.

Notre protocole s’adresse aux nouveaux utilisateurs de CPMG. C’est donc un bon point de départ. Cependant, nous nous attendons à ce que les utilisateurs connaissent les étapes de base pour exécuter des expériences RMN conventionnelles.

Pour configurer une expérience RMN pour la première fois, commencez par télécharger et décompressez ces fichiers supplémentaires. Copiez les bits. vv et trosy_15N_CPMG.

vv dans le dossier du programme pulse dans le répertoire du programme pulse. Ouvrez le logiciel d’acquisition et utilisez la commande EDC pour copier une expérience HSQC d’azote 15 d’hydrogène précédemment exécutée dans une nouvelle expérience. Utilisez la commande pulse program pour charger le trosy_15N_CPMG.

vv pulse fichier de programme dans l’expérience nouvellement créée. Utilisez ensuite les instructions de la fin du fichier de programme d’impulsions pour configurer l’expérience CPMG. Pour mettre en place une expérience RMN de routine, introduisez l’échantillon dans l’aimant et effectuez toutes les étapes d’acquisition RMN de base.

Réglez P1 sur la durée des impulsions dures à l’hydrogène de 90 degrés et P7 sur la durée des impulsions dures de 90 degrés de l’azote 15. Dans la fenêtre d’acquisition, définissez le centre et la largeur spectrale pour les dimensions 15 de l’hydrogène et de l’azote. Placez le retard de relaxation à 0,7 T2 et utilisez la commande de liste de circuit virtuel pour créer une liste de nombres entiers correspondant à N.Après avoir confirmé que chaque entrée dans la liste correspond à un champ cpmg différent selon CPMG classé est égal à des fois 4N divisés par D30, vérifiez que le premier nombre dans la liste est zéro.

Définissez L8 sur le nombre d’entrées dans la liste VC, L3 sur le nombre de points réels pour la dimension indirecte et 1TD sur L8 fois L3 fois deux. Pour optimiser la suppression de l’eau, réglez le gain du récepteur sur un et tapez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme d’impulsions. À la ligne 91, supprimez le point-virgule précédant la commande 999 et enregistrez le fichier.

À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB0 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduire un point-virgule à la ligne 91 du fichier programme d’impulsions et enregistrer le fichier. Pour optimiser SPDB11, définissez le gain du récepteur sur un et le type EDC pull pour ouvrir le fichier programme pulse.

À la ligne 168, supprimez le point-virgule précédant go à 999 et enregistrez le fichier. À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB11 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduisez le point-virgule à la ligne 168 et enregistrez le fichier.

Pour optimiser SPDB2, définissez le gain du récepteur sur un et entrez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme pulse. À la ligne 179, supprimez le point-virgule précédant le mot « 999 » et enregistrez le fichier. À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB2 pour minimiser l’intensité du signal FID.

Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduisez le point-virgule à la ligne 179 du fichier de programme d’impulsions et enregistrez le fichier. Pour optimiser PLDB2, réglez le gain du récepteur sur un et entrez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme pulse. À la ligne 184, supprimez le point-virgule précédant l’option 999 et enregistrez le fichier.

À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres PLDB2 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduire le point-virgule à la ligne 184 du fichier de programme d’impulsions et enregistrer le fichier. Exécutez la commande RGA pour optimiser le gain du récepteur.

Exécutez ensuite la commande ZG pour démarrer l’expérience. Sur cette figure, on peut observer les résultats des profils de dispersion de relaxation acquis pour chaque pic du spectre de Trosy de l’azote hydrogène 15. À partir des profils de dispersion de relaxation acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de l’azote 15 de chaque groupe AMI de base.

En traçant la relaxation transversale sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les régions structurelles subissant un échange de confirmation sur l’échelle de temps de la microseconde milliseconde. La modélisation des courbes de dispersion de relaxation à l’aide des équations de Carver-Richards renvoie les paramètres thermodynamiques et cinétiques du processus d’échange, tels que les populations fractionnaires des états en équilibre et le taux d’échange entre ces états. La dépendance à la température de ces paramètres thermodynamiques et cinétiques peut ensuite être modélisée à l’aide des équations van’t Hoff et I-ring, respectivement, pour obtenir des informations détaillées sur l’énergie de l’échange de confirmation.

Il est crucial d’optimiser soigneusement tous les paramètres d’acquisition, en particulier P7. Il est également important de produire des échantillons très purs et homogènes pour éviter les dispersions parasites. Les paramètres cinétiques, thermodynamiques et chimiques des puces obtenus à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour dériver des informations énergétiques et structurelles sur les espèces subissant l’échange de confirmation. La caractérisation de la dynamique de confirmation des protéines obtenue par les méthodes CPMG fournit des informations cruciales pour comprendre la signalisation et l’activité enzymatique, ainsi que de nouvelles perspectives pour la conception des médicaments.