Name: 15 ans N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Apprenez à utiliser la dispersion de relaxation CPMG 15N pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines à l'échelle microseconde-millisecondes. Cette méthode RMN fournit des informations cinétiques et thermodynamiques détaillées sans préparation d'échantillon spécialisée.

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Ce travail a été soutenu par des fonds du NIGMS R35GM133488 et du Roy J. Carver Charitable Trust à V.V.

1. Préparation de l’échantillon RMN
<ol><li>Exprimer et purifier un échantillon 2H,15N-labled de la protéine d’intérêt. REMARQUE: Bien qu’un échantillon de protéines marqué 15N puisse être utilisé pour l’acquisition de l’expérience CPMG RD, la perdeutérisation (dans la mesure du possible) augmente considérablement la qualité des données obtenues. Des protocoles pour la production de protéines perdeutérérées sont disponibles dans la littérature13.</li>
	<li>Le tampon échange l’échantillon de protéine purifiée dans un tampon RMN dégazé.</li>
	<li>Transférer l’échantillon RMN dans le tube RMN. REMARQUE: La concentration de l’échantillon RMN doit être soigneusement optimisée afin de maximiser le rapport signal sur bruit et de minimiser l’apparition d’interactions protéine-protéine. En général, la plage de concentration typique pour les expériences cpmg est de 0,1-1,0 mM.</li>
</ol>2. Première mise en place de l’expérience RMN
<ol><li>Téléchargez et décompressez les fichiers supplémentaires.</li>
	<li>Copiez les fichiers bits.vv et trosy_15N_cpmg.vv (situés dans le dossier nommé pulseprogram) dans le répertoire du programme pulse (<path>/exp/stan/nmr/lists/pp/user). Remarque : Assurez-vous que le chemin d’accès à bits.vv répertorié sur la première ligne du fichier trosy_15N_cpmg.vv est correct.</path></li>
	<li>Ouvrez un logiciel d’acquisition et copiezune expérienceH-15HSQC précédemment exécutée dans une nouvelle expérience à l’aide de la commande edc.</li>
	<li>À l’aide de la commande pulprog, chargez le programme d’impulsions trosy_15N_cpmg.vv dans l’expérience nouvellement créée.</li>
	<li>Configurez l’expérience CPMG en suivant les instructions fournies à la fin du fichier de programme d’impulsions (trosy_15N_cpmg.vv).</li>
</ol>3. Mise en place de routine de l’expérience RMN
<ol><li>Introduire l’échantillon dans l’aimant et effectuer toutes les étapes de base pour l’acquisition de toute expérience RMN: verrouiller et caler l’échantillon; match et accordez les canaux 1H et 15N.</li>
	<li>Réglez p1 et p7 sur la durée des impulsions dures de 90°1 H et 15N, respectivement. REMARQUE: Pour des résultats optimaux, il est important d’étalonner l’impulsion de 15N 90 ° avec le plus grand soin. L’étalonnage est généralement effectué à l’aide d’un échantillon de 100 mM d’urée 15N-marqués dans le DMSO, tel que décrit dans le manuel du spectromètre. De plus, il est possible de revérifier l’étalonnage directement sur l’échantillon RMN de travail en acquérant le premier incrément d’unspectre HSQC de 1 H-15 N dans lequel l’impulsion de 15N 90° du premier bloc INEPT est commutée sur une impulsion de 180°. Si l’étalonnage est correct, une valeur nulle doit être obtenue.</li>
	<li>Dans la fenêtre d’acquisition, définissez le centre et la largeur spectrale pour les dimensions 1H et 15N. REMARQUE: Centrez le spectre 1H à la fréquence du signal d’eau pour une suppression optimale de l’eau.</li>
	<li>Réglez le délai de relaxation (d30) égal à 0,7T2,oùT2 est le temps de relaxation transversale attendu de 15N de votre protéine. Remarque : la valeur de d30 peut être optimisée empiriquement pour obtenir les meilleurs résultats.</li>
	<li>Utilisez la commande vclist pour créer une liste de nombres entiers correspondant au paramètre n de la figure 1A et de la figure 1B. Assurez-vous que chaque entrée de la liste correspond à un champ CPMG différent (νcpmg) selon νcpmg = 4 x n / d30. Assurez-vous que le premier nombre de la liste est 0 (cela correspond à l’expérience de référence pour laquelle le bloc CPMG est ignoré et d30 = 0 s) et de ne pas utiliser de nombres supérieurs à 1 000 x d30 / 4. Des nombres supérieurs à ce seuil entraînent une&gt; 1 kHz et peuvent endommager la sonde.</li>
	<li>Définissez l8 sur le nombre d’entrées dans la liste vclist, l3 sur le nombre de points réels pour la dimension indirecte (généralement une plage de 64-200 est définie pour l3) et 1 td égal à l8 x l3 x 2. REMARQUE: Effectuez les étapes 3.7-3.11 pour optimiser la suppression de l’eau.</li>
	<li>Réglez le gain du récepteur (rg) sur 1; ouvrez le fichier de programme pulse (edcpul), passez à la ligne 91, supprimez le point-virgule précédant goto 999et enregistrez le fichier.</li>
	<li>À l’aide de la commande gs, ajustez les paramètres spdb0 (ou spdw0) afin de minimiser l’intensité du signal FID.</li>
	<li>Réintroduire le point-virgule à la ligne 91 du fichier programme pulse et enregistrer le fichier.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.7-3.9 pour optimiser spdb11 (ligne 168 du fichier de programme d’impulsion), spdb2 (ligne 179 du fichier de programme d’impulsion) et pldb2 (ligne 184 du fichier de programme d’impulsion).</li>
	<li>Exécutez la commande rga pour optimiser le gain du récepteur.</li>
	<li>Définissez le nombre d’analyses (ns) sur un multiple de 8.</li>
	<li>Exécutez la commande zg pour démarrer l’expérience.</li>
</ol>4. Traitement et analyse des données RMN
<ol><li>Copiez le dossier nommé Process (Supplemental Files) dans le répertoire contenant le fichier ser.</li>
	<li>Utilisez les fichiers sep_fid.com et ft2D.com pour traiter les données RMN. Remarque : instruction sur la façon de modifier les scripts de traitement est fourni dans les fichiers sep_fid.com et ft2D.com.</li>
	<li>Ouvrez les fichiers ucsf contenus dans le répertoire CPMG_Sparky_files dans Sparky. Remarque : les fichiers ucsf sont créés par les scripts de traitement. Il y a un fichier ucsf pour chaque entrée dans la liste vclist. Le premier fichier ucsf (test_1.ucsf) contient l’expérience de référence. Les fichiers ucsf suivants (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) sont classés de la valeur la plus basse à la plus grande de νcpmg.</li>
	<li>Choisissez les crêtes croisées RMN sur le spectre RMN de référence (test_1.ucsf).</li>
	<li>Sélectionnez tous les pics croisés sélectionnés à l’aide de la commande Sparky pa.</li>
	<li>Exécutez la commande Sparky rh. Cette commande ouvre une fenêtre de dialogue. Sélectionnez les hauteurs d’option à la même position dans chaque spectre. Cliquez sur Configuration et vérifiez tous les spectres RMN. Cliquez sur Mettre à jour et enregistrez le fichier de sortie dans le répertoire de travail. Le fichier de sortie contient la matrice des intensités de signal sur tous les spectres RMN ouverts. REMARQUE: Des protocoles plus précis qui utilisent l’ajustement de forme de ligne pour récupérer des intensités à partir d’expériences pseudo-3D entrelacées ont été décrits dans la littérature14. Un logiciel disponible gratuitement pour l’ajustement de la forme de ligne est disponible chez https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), et dans NMRPipe (module nLinLS) et SPARKY (module informatique).</li>
	<li>Pour chaque champ CPMG, convertissez les intensités de signal en débitsR2 à l’aide de la formule <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg"> , où I0 et Id30 sont l’intensité des spectres RMN de référence (vc = 0) et détendus (vc &gt; 0), respectivement. Remarque : dans les fichiers supplémentaires, un modèle du fichier de feuille de calcul (R2_calc.xls) utilisé pour convertir les intensités de signal en débits R2 et pour visualiser les profils RD est fourni.</li>
	<li>Lisez le niveau de bruit dans le spectre de référence à l’aide de la commande Sparky st et propagez l’erreur sur les débits R2. REMARQUE : Dans les fichiers supplémentaires, un modèle du fichier de feuille de calcul (R2_calc.xls) utilisé pour propager l’erreur sur les taux R2 mesurés est fourni.</li>
</ol>5. Ajustement des courbes RD
<ol><li>Copiez le dossier nommé RD_fitting (Fichiers supplémentaires) dans le répertoire de travail.</li>
	<li>Pour chaque pic RMN attribué, estimer Rex en calculant le <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg"> . et sont les taux <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> R2 mesurés au taux νcpmg le plus bas et le plus élevé dans la listevclist.
</li>
	<li>Inspectez visuellement les courbes RD avec Rex supérieur à deux fois l’erreur estimée et ignorez toutes les courbes RD trop bruyantes pour être modélisées avec précision. REMARQUE: Le bruit sur Rex peut être propagé à partir des erreurs sur <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> et <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> .</li>
	<li>Préparez un fichier d’entrée pour le script d’ajustement à l’aide de toutes les courbes RD avec Rex supérieur à deux fois l’erreur estimée. REMARQUE: Des instructions détaillées sur la préparation des fichiers d’entrée sont fournies dans les scripts d’ajustement. Des exemples de fichiers d’entrée sont fournis en tant que fichiers supplémentaires. Généralement, les données RD sont mesurées à deux champs statiques différents et ajustées simultanément. Dans ce protocole, deux fichiers d’entrée différents sont requis(Fichiers supplémentaires).</li>
	<li>Ajustez les données RD à l’aide des scripts fournis dans Fichiers supplémentaires. Remarque : deux scripts différents sont fournis pour effectuer un ajustement basé sur les résidus ou global des courbes RD, respectivement. Les deux scripts ajustent les courbes RD à l’aide d’un modèle d’échange à deux sites et de l’équation de Carver-Richards. Des instructions plus détaillées sont fournies dans les scripts d’ajustement. Des progiciels supplémentaires tels que Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) et CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) sont disponibles pour effectuer l’ajustement des données à l’aide des équations de Block-McConnell.</li>
	<li>Tester la fiabilité des paramètres ajustés estimant le χ2 réduit en fonction de pb et kex. Remarque : le χ2 réduit est fourni dans le fichier de sortie. pb et kex peuvent être limités à des valeurs spécifiques en utilisant des limites inférieure et supérieure dans les procédures de montage. Dans nos scripts, les limites inférieure et supérieure de pb sont lb(2) et ub(2), respectivement. Les bornes inférieure et supérieure pour kex sont lb(3) et ub(3), respectivement.</li>
	<li>Estimez l’erreur sur les paramètres ajustés. Pour ce faire, définissez la valeur de MC_fac dans le script sur 1 et répétez l’ajustement plusieurs fois (généralement &gt;20 répétitions). L’erreur sur chaque paramètre est estimée comme l’écart type de la distribution. Remarque : la définition de MC_fac sur 1 génère un jeu de données synthétique dans lequel une erreur distribuée gaussienne (calculée en fonction de l’erreur expérimentale) est ajoutée aux données expérimentales.</li>
</ol>

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<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
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<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
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<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit. Nous ne déclarons aucun conflit d’intérêts.

Ce manuscrit décrit le protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de données 15N RD sur les protéines. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mesure des données RMN et l’analyse des profils RD sont couvertes. Ci-dessous, certains aspects importants concernant l’acquisition et l’analyse des expériences de RD sont discutés. Cependant, pour une description plus approfondie de l’expérience et de l’analyse des données, une étude minutieuse de la ...

Les expériences de dispersion de relaxation (RD) de Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) sont utilisées sur une base de routine pour caractériser les équilibres conformationnels se produisant sur l’échelle de temps μs-ms par spectroscopie RMN en solution1,2,3,4,5. Comparativement à d’autres méthodes d’étude de la dynamique conformationnelle, les techniques cpmg sont relativement faciles à mettre en œuvre sur les spectromètres RMN modernes, ne nécessitent pas d’étapes spécialisées de préparation d’échantillon (c.-à-d. cristallisation, congélation ou alignement d’échantillon, et/ou conjugaison covalente avec une étiquette fluorescente ou paramagnétique), et fournissent une caractérisation complète des équilibres conformationnels renvoyant des informations structurelles, cinétiques et thermodynamiques sur les processus d’échange. Pour qu’une expérience CPMG rende compte d’un équilibre conformationnel, deux conditions doivent s’appliquer : (i) les spins RMN observés doivent posséder différents décalages chimiques dans les états subissant un échange conformationnel (micro-états) et (ii) l’échange doit se produire à une échelle de temps allant de ~50 μs à ~10 ms. Dans ces conditions, le taux de relaxation transversale observé ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) est la somme duR2 intrinsèque (leR2 mesuré en l’absence de dynamique μs-ms, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ) et de la contribution d’échange à la relaxation transversale (Rex). La contribution Rex àR2obs peut être progressivement trempée en réduisant l’espacement entre les impulsions de 180° constituant le bloc CPMG de la séquence d’impulsions, et les courbes RD résultantes peuvent être modélisées en utilisant la théorie de Bloch-McConnell pour obtenir la différence de décalage chimique entre les micro-états, la population fractionnaire de chaque micro-état, et les taux d’échange entre les micro-états(Figure 1)1,2,3.
Plusieurs séquences d’impulsions et protocoles d’analyse différents ont été rapportés dans la littérature pour 15expériences cpmg de N. Ici, le protocole mis en œuvre en laboratoire est décrit. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mise en place et l’acquisition des expériences RMN, ainsi que le traitement et l’analyse des données RMN seront introduites (Figure 2). Pour faciliter le transfert du protocole à d’autres laboratoires, le programme d’impulsions, les scripts de traitement et d’analyse et un exemple d’ensemble de données sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires et peuvent être téléchargés à l’adresse (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). La séquence d’impulsions fournie intègre un cycle de phase en quatre étapes dans le bloc CPMG pour la suppression des artefacts dépendants du décalage6 et elle est codée pour l’acquisition de plusieurs expériences entrelacées. Ces expériences entrelacées ont une période de relaxation identique mais des nombres différents d’impulsions recentrantes afin d’obtenir différents champs CPMG7. Il est également important de noter que le programme d’impulsions décrit mesure les 15N R2 de la composante TROSY du signal RMN8. Dans l’ensemble, le protocole a été appliqué avec succès pour la caractérisation des échanges conformationnels dans des protéines de taille moyenne et grande4,5,9,10. Pour les systèmes plus petits (&lt;20 kDa), l’utilisation d’une séquence d’impulsions11, 12 basée sur la cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC) est recommandée.

<table><tbody><tr><td>Cryosonde</td><td>Bruker</td><td>5mm TCI 800 H-C/N-D Cryosonde</td><td>Améliorer la sensibilité</td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822-1</td><td>>99,8 % pur, utilisé dans la préparation d’échantillons RMN et de cultures deutérées</td></tr><tr><td>Centrifugeuse manuelle</td><td>United Scientific supply</td><td>CENTFG1</td><td>Utilisé pour éliminer les bulles d’air ou le liquide résiduel collé sur les parois du tube RMN.</td></tr><tr><td>Spectromètre RMN à haut champ</td><td>Bruker Bruker</td><td>Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>Acquisition des données RMN</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>Modélisation des données RMN</td></tr><tr><td>Pipette pasteur RMN Corning</td><td>Incorporation</td><td>7095D-NMR</td><td>Pipette pastuer en verre Pyrex pour transférer l’échantillon liquide dans un tube RMN</td></tr><tr><td>Tube RMN</td><td>Willmad Precision</td><td>535-PP-7</td><td>Tube cylindrique en verre 7'' à paroi mince de 5 mm</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>le traitement des données RMN</td></tr><tr><td>SPARKY</td><td>University of California, San Francisco</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td> <td>Analyse des données RMN</td></tr><tr><td>Tospin 3.2 (ou plus récent)</td><td>Bruker</td><td>Logiciel</td><td>d’acquisition</td> https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</tr></tbody></table>

15 ans n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the μs-ms timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

La dynamique conformationnelle des protéines joue un rôle fondamental dans la régulation de la catalyse enzymatique, de la liaison au ligand, de l’allostery et de la signalisation, qui sont des processus biologiques importants. Comprendre comment l’équilibre entre la structure et la dynamique régit la fonction biologique est une nouvelle frontière dans la biologie structurale moderne et a déclenché plusieurs développements techniques et méthodologiques. Parmi ceux-ci, les méthodes RMN de la solution de dispersion de relaxation CPMG fournissent des informations uniques de résolution atomique sur la structure, la cinétique et la thermodynamique des équilibres conformationnels des protéines se produisant sur l’échelle de temps μs-ms. Ici, l’étude présente des protocoles détaillés pour l’acquisition et l’analyse d’une expérience de dispersion de relaxation de 15N. À titre d’exemple, le pipeline pour l’analyse de la dynamique μs-ms dans le domaine C-terminal des bactéries enzyme I est montré.

Le protocole décrit ici entraîne l’acquisition de profils RD pour chaque pic du spectre TROSY 1H-15N (Figure 3A). A partir des profils RD acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de 15N de chaque groupe amide de la dorsale(figure 3A,3B). En traçant le Rex sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les régions structurelles ...

Ici, une description détaillée du protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de profils de dispersion de relaxation de 15N par spectroscopie RMN en solution est fournie.

15 ans N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Ce protocole peut être utilisé pour la détection et la caractérisation de la dynamique conformationnelle des protéines, qui sont essentielles pour comprendre une grande variété de processus cellulaires. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode ne nécessite pas d’étapes spécialisées dans la préparation de l’échantillon et fournit une caractérisation complète de la cinétique, de la thermodynamique et des aspects structurels de l’équilibre de confirmation. La dispersion de relaxation CPMG peut être appliquée plus largement pour la caractérisation de la dynamique de confirmation dans les acides nucléiques et autres biomolécules, ainsi que pour la caractérisation des interactions entre les nanoparticules de ligands.Notre protocole s’adresse aux nouveaux utilisateurs de CPMG. C’est donc un bon point de départ. Cependant, nous nous attendons à ce que les utilisateurs connaissent les étapes de base pour exécuter des expériences RMN conventionnelles.Pour configurer une expérience RMN pour la première fois, commencez par télécharger et décompressez ces fichiers supplémentaires. Copiez les bits. vv et trosy_15N_CPMG.vv dans le dossier du programme pulse dans le répertoire du programme pulse. Ouvrez le logiciel d’acquisition et utilisez la commande EDC pour copier une expérience HSQC d’azote 15 d’hydrogène précédemment exécutée dans une nouvelle expérience. Utilisez la commande pulse program pour charger le trosy_15N_CPMG.vv pulse fichier de programme dans l’expérience nouvellement créée. Utilisez ensuite les instructions de la fin du fichier de programme d’impulsions pour configurer l’expérience CPMG. Pour mettre en place une expérience RMN de routine, introduisez l’échantillon dans l’aimant et effectuez toutes les étapes d’acquisition RMN de base.Réglez P1 sur la durée des impulsions dures à l’hydrogène de 90 degrés et P7 sur la durée des impulsions dures de 90 degrés de l’azote 15. Dans la fenêtre d’acquisition, définissez le centre et la largeur spectrale pour les dimensions 15 de l’hydrogène et de l’azote. Placez le retard de relaxation à 0,7 T2 et utilisez la commande de liste de circuit virtuel pour créer une liste de nombres entiers correspondant à N.Après avoir confirmé que chaque entrée dans la liste correspond à un champ cpmg différent selon CPMG classé est égal à des fois 4N divisés par D30, vérifiez que le premier nombre dans la liste est zéro.Définissez L8 sur le nombre d’entrées dans la liste VC, L3 sur le nombre de points réels pour la dimension indirecte et 1TD sur L8 fois L3 fois deux. Pour optimiser la suppression de l’eau, réglez le gain du récepteur sur un et tapez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme d’impulsions. À la ligne 91, supprimez le point-virgule précédant la commande 999 et enregistrez le fichier.À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB0 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduire un point-virgule à la ligne 91 du fichier programme d’impulsions et enregistrer le fichier. Pour optimiser SPDB11, définissez le gain du récepteur sur un et le type EDC pull pour ouvrir le fichier programme pulse.À la ligne 168, supprimez le point-virgule précédant go à 999 et enregistrez le fichier. À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB11 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduisez le point-virgule à la ligne 168 et enregistrez le fichier.Pour optimiser SPDB2, définissez le gain du récepteur sur un et entrez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme pulse. À la ligne 179, supprimez le point-virgule précédant le mot « 999 » et enregistrez le fichier. À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB2 pour minimiser l’intensité du signal FID.Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduisez le point-virgule à la ligne 179 du fichier de programme d’impulsions et enregistrez le fichier. Pour optimiser PLDB2, réglez le gain du récepteur sur un et entrez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme pulse. À la ligne 184, supprimez le point-virgule précédant l’option 999 et enregistrez le fichier.À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres PLDB2 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduire le point-virgule à la ligne 184 du fichier de programme d’impulsions et enregistrer le fichier. Exécutez la commande RGA pour optimiser le gain du récepteur.Exécutez ensuite la commande ZG pour démarrer l’expérience. Sur cette figure, on peut observer les résultats des profils de dispersion de relaxation acquis pour chaque pic du spectre de Trosy de l’azote hydrogène 15. À partir des profils de dispersion de relaxation acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de l’azote 15 de chaque groupe AMI de base.En traçant la relaxation transversale sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les régions structurelles subissant un échange de confirmation sur l’échelle de temps de la microseconde milliseconde. La modélisation des courbes de dispersion de relaxation à l’aide des équations de Carver-Richards renvoie les paramètres thermodynamiques et cinétiques du processus d’échange, tels que les populations fractionnaires des états en équilibre et le taux d’échange entre ces états. La dépendance à la température de ces paramètres thermodynamiques et cinétiques peut ensuite être modélisée à l’aide des équations van’t Hoff et I-ring, respectivement, pour obtenir des informations détaillées sur l’énergie de l’échange de confirmation.Il est crucial d’optimiser soigneusement tous les paramètres d’acquisition, en particulier P7. Il est également important de produire des échantillons très purs et homogènes pour éviter les dispersions parasites. Les paramètres cinétiques, thermodynamiques et chimiques des puces obtenus à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour dériver des informations énergétiques et structurelles sur les espèces subissant l’échange de confirmation. La caractérisation de la dynamique de confirmation des protéines obtenue par les méthodes CPMG fournit des informations cruciales pour comprendre la signalisation et l’activité enzymatique, ainsi que de nouvelles perspectives pour la conception des médicaments.

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^{15 ans} N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale

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