Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Cette méthodologie fournit une approche de perte de fonction pour les études du développement de la rétine chez le poussin. Cette technique favorise la suppression rapide et persistante des gènes cibles dans une zone spécifique de la rétine. Cette approche peut également être appliquée à d’autres parties de l’embryon de poussin, y compris les tissus neuraux et non neuraux.

Pour l’électroporation in ovo, préparez une solution Fast Green à 0,25 % en dissolvant 25 milligrammes de Fast Green FCF dans 10 millilitres de PBS, puis filtrez la solution à l’aide d’un filtre seringue de 0,2 micron. Ensuite, préparez la solution d’injection de cocktail d’ADN en mélangeant le plasmide GFP émeraude microARN avec le plasmide d’expression de la transposase Tol2 dans un rapport de deux à un. Ajoutez ensuite la solution Fast Green préparée au cocktail d’ADN dans un rapport de un à 10 pour la visualisation de la zone injectée.

Ensuite, configurez l’appareil de micro-injection. L’appareil se compose d’une seringue Hamilton, d’une aiguille de deux pouces de calibre 18, d’un tube en polychlorure de vinyle de deux centimètres de long et d’une aiguille de micropipette. Remplissez la seringue Hamilton d’huile minérale lourde, puis fixez l’aiguille de calibre 18 à la seringue et remplissez l’espace intérieur de l’aiguille d’huile en appuyant sur le piston de la seringue.

Ensuite, fixez le tube en polychlorure de vinyle à l’extrémité de l’aiguille et remplissez le tube avec l’huile. Fixez l’aiguille de la micropipette tirée sur le tube. Puis sous le microscope à dissection à l’aide d’une pince fine, cassez la pointe de l’aiguille à un diamètre de 10 à 20 micromètres pour faire une petite ouverture.

Remplissez toute l’aiguille d’huile. Ensuite, mettez cinq microlitres du cocktail d’ADN coloré sur une boîte de Pétri. Sous le microscope à dissection, placez la pointe de l’aiguille de la micropipette dans la solution d’ADN sur la boîte de Pétri et aspirez lentement la solution dans l’aiguille.

Une fois que la pression s’est équilibrée à l’intérieur et à l’extérieur de l’aiguille, retirez la pointe de l’aiguille de la solution d’ADN et maintenez-la immergée dans du PBS stérile dans un petit bécher jusqu’à l’injection. Ensuite, pour mettre en place l’appareil d’électroporation, placez fermement une paire d’électrodes en platine avec un porte-électrode sur un micromanipulateur. Ajustez l’espacement entre la pointe des électrodes à deux millimètres et connectez les électrodes à un générateur d’impulsions à onde carrée avec des câbles.

Ensuite, pour la micro-injection d’ADN, retirez un œuf de Leghorn blanc fécondé de l’incubateur et essuyez la surface de l’œuf avec du papier de soie imbibé d’éthanol à 70 %. Attachez ensuite une aiguille de calibre 18 à une seringue de 10 millilitres et insérez l’aiguille dans l’extrémité émoussée de l’œuf, inclinée vers le bas pour éviter d’endommager le jaune. Après avoir retiré deux à trois millilitres d’albumine de l’œuf, scellez le trou avec un morceau de ruban adhésif et allumez une bougie sur l’œuf pour vous assurer que l’embryon et la membrane vitelline sont détachés de la coquille.

Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez un morceau de coquille d’œuf du haut de l’œuf, exposant ainsi l’embryon. Ne fendez pas plus de cinq ovules à la fois pour éviter le dessèchement des embryons pendant l’électroporation. Insérez la pointe de l’aiguille dans la vésicule optique à partir de son côté proximal à un angle de 45 degrés et injectez le cocktail d’ADN en appuyant lentement sur le piston jusqu’à ce que la solution de couleur bleue remplisse la lumière.

Retirez l’aiguille et replacez sa pointe dans le PBS. Pour l’électroporation, réglez la tension d’impulsion sur 15 volts, la longueur d’impulsion sur 15 millisecondes, l’intervalle d’impulsion sur 915 millisecondes et le nombre d’impulsions sur cinq. Après avoir ajouté quelques gouttes d’HBSS sur la membrane vitelline sur l’embryon, utilisez le micromanipulateur pour abaisser les électrodes dans l’HBSS perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Placez les électrodes de part et d’autre de la vésicule optique, en veillant à ce que les électrodes ne touchent pas l’embryon ou les vaisseaux sanguins, puis appliquez des champs électriques pulsés. Une fois l’électroporation terminée, retirez les électrodes et nettoyez-les délicatement avec un coton-tige stérile imbibé d’eau pour éviter l’accumulation d’albumine. Scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et réincubez l’embryon jusqu’au stade de développement souhaité.

La transfection de séquences individuelles de pré-microARN dans des cellules de Nel AP exprimant HEK293T a entraîné une suppression significative de l’expression de Nel par des constructions contre les nucléotides 482 à 502, 910 à 930 et 2461 à 2481. Le chaînage de deux séquences de microARN a considérablement amélioré l’efficacité du knockdown. Les trois combinaisons ont montré des activités de suppression améliorées par rapport aux séquences individuelles de pré-microARN non chaînées.

Une suppression robuste a été observée au moins 13 jours après la transfection. Lorsqu’une construction pré-microARN de Nel ciblant les nucléotides 482 à 502 et 2461 à 2481 a été co-transfectée avec le vecteur d’expression de la transposase dans la rétine du poulet, l’expression de Nel dans l’épithélium pigmentaire rétinien a été significativement réduite dans les cellules exprimant la GFP émeraude au jour embryonnaire 4.5. Chez les embryons âgés de huit jours, l’expression de Nel a également diminué dans les cellules ganglionnaires de la rétine.

En revanche, l’expression de Nel dans la rétine n’a pas été affectée par l’introduction de microARN témoin. À la suite de cette procédure, les effets sur la suppression des gènes cibles peuvent être examinés à l’aide de diverses méthodes telles que les examens de la prolifération et de la différenciation cellulaires, la mort cellulaire et le traçage des cellules et des axones.