Name: Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Découvrez la coloration immunofluorescente pour visualiser les agrégats d'hétérochromatine dans les cellules polyploides de Drosophila. Cette méthode permet d'évaluer l'impact des mutations génétiques sur l'organisation chromatinienne.

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Nous remercions Marco Antonio Rosales Vega et Abel Segura d’avoir pris certaines des images confocales, Carmen Muñoz pour la préparation des médias et le Dr Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui et le Dr Chris Wood de la LMNA pour des conseils sur l’utilisation des microscopes.

1. Culture de larves du troisième stade
<ol><li>Préparez 1 litre de milieux standards en ajoutant 100 g de levure, 100 g de sucre de canne entier non raffiné, 16 g de gélose, 10 mL d’acide propionique et 14 g de gélatine. Dissoudre tous les ingrédients sauf la levure dans 800 mL d’eau du robinet, puis dissoudre la levure. Autoclave immédiatement pendant 30 minutes.<ol>
<li>Ensuite, laissez le support refroidir à 60 °C et ajoutez l’acide propionique à une concentration finale de 0,01 %. Laissez la bouteille reposer jusqu’à ce que la gélatine soit formée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour optimiser la culture de larves de 3o stades, collectez d’abord des adultes âgés de 5 à 10 jours et placez-en 50 (25 mâles et 25 femelles) dans une large bouteille à col de milieux standard.</li>
	<li>Placez la bouteille avec les mouches dans un incubateur à température contrôlée à 25 °C jusqu’à ce que le nombre d’œufs pondus soit de 50 (environ 12 heures pour la souche de type sauvage).</li>
	<li>Une fois le temps d’incubation terminé, retirez les adultes et transférez-les dans une nouvelle bouteille pour répéter la procédure. Laisser les embryons grandir à 18 °C pendant 72 heures REMARQUE : Pour en savoir plus sur les conditions de maintien du stock de drosophiles, voir Tennessen &Thymmel13.</li>
</ol>2. Collecte de larves
<ol><li>Pour la collecte des larves, choisissez les larves errantes qui n’ont pas de spiracles everted. Après l’éversion des spiracles, la larve entre dans la phase prépupale, tout en conservant d’excellents chromosomes polytènes adaptés à l’analyse. Ce n’est qu’après 12 heures que les cellules de la glande salivaire commencent à se préparer à la mort cellulaire programmée14,15.</li>
	<li>Prenez quinze larves de 3° et mettez-les dans un verre de montre pour les laver. Puis les transférer dans une solution saline glacée ou PBS (1x PBS : NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mMNa2HPO4,2 mMKH2PO4,ajuster le pH à 7,4).</li>
	<li>Disséquer 15 à 30 paires de glandes salivaires (ou autant que possible en 30 minutes) dans du PBS froid avec des inhibiteurs de la protéase au microscope stéréoscopique. Transférer les glandes salivaires dans un tube de 1,5 mL avec du PBS glacé.</li>
	<li>Laver une fois avec 1 mL de PBS plus inhibiteurs de la protéase. Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.</li>
	<li>Après le lavage, retirez le PBS avec une pipette de 1000 μL. Veillez à ne pas toucher le tissu.<ol>
<li>Alternativement, disséquer les glandes salivaires dans 5 mL de PBS pour éliminer le besoin de cette étape de lavage et passer à l’étape 3 en transférant les glandes salivaires à 0,5 mL du tampon de fixation Ruvkun décrit ci-dessous.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fixation des tissus des glandes salivaires
<ol><li>Après avoir retiré le PBS de la dernière étape, ajouter directement 0,5 mL de tampon de fixation Ruvkun 1x, avec 50% de méthanol (ajouter 0,5 mL de méthanol) et 2% de formaldéhyde. REMARQUE: 2x la solution de Ruvkun est 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES à pH 7,4.</li>
	<li>Incuber pendant 2 heures à 4 °C avec une rotation douce.</li>
</ol>4. Lavage des tissus des glandes salivaires
<ol><li>Effectuer un lavage par rotation de 5 minutes avec 1 mL de tampon Tris/Triton (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 et 1 mM EDTA). REMARQUE: Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.</li>
</ol>5. Perméabilisation
<ol><li>Incuber les glandes salivaires dans 1 mL de Tris/Triton X-100 (le même que ci-dessus). Pour certaines protéines, il peut être nécessaire d’ajouter 1% β-mercaptoéthanol.</li>
	<li>Incuber pendant 2 heures à 37 ° C avec une légère secousse (300 rpm).</li>
</ol>6. Étape de préservation (facultatif)
REMARQUE: Si vous ne procèdez pas immédiatement à l’incubation avec l’anticorps, conservez le tissu comme suit.
<ol><li>Laver avec 1 mL de tamponBO3 (0,01 MH3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) puis incuber dansBO3/10mM de TNT à 37°C avec de légères secousses (300 rpm) pendant 15 minutes.</li>
	<li>A la fin de la période d’incubation, effectuer un lavage avec 1 mL de tamponBO3 seul. REMARQUE: Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS. Conservez le tissu de cette solution à 4 °C jusqu’à 72 heures, puis passez à l’étape suivante. Cette étape est particulièrement utile lorsque vous travaillez avec différentes souches mutantes qui peuvent présenter un cycle de vie retardé, de sorte que l’immunodétection peut être effectuée en même temps avec les contrôles.</li>
</ol>7. Blocage des tissus
<ol><li>Incuber les glandes salivaires dans 1 mL de tampon B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) pendant 2 heures à température ambiante avec rotation.</li>
</ol>8. Immunomarquage
<ol><li>Retirez tout le tampon B et ajoutez le tampon A (PBS + BSA 0,1%) plus l’anticorps d’intérêt. REMARQUE: Nous utilisons le HP1a C1A9c (anticorps concentré) de Hybridoma Bank jusqu’à 1:3000. Lors de l’utilisation des C1A9 (surnageant), nous avons essayé de 1:100 à une dilution de 1:500 et toute dilution entre ce rang fonctionne bien) pendant la nuit à 4 oC avec rotation. À ce stade, il est important que la secousse ne soulève pas de bulles qui pourraient endommager l’anticorps.</li>
</ol>9. Lavage immunomarquage
<ol><li>Effectuer des lavages de 3 x 15 minutes avec tampon B sous agitation à température ambiante en utilisant 1 mL à chaque fois.</li>
	<li>Transférer les glandes au tampon B avec l’anticorps secondaire couplé à un fluorophore pendant 2 heures sous rotation à 4 oC (l’anticorps secondaire Alexa fluor 568 Invitrogen a été utilisé 1:3000).<ol>
<li>Couvrez le tube avec une feuille de papier d’aluminium pour protéger l’anticorps secondaire de la lumière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer des lavages de 2 x 15 minutes à température ambiante en rotation avec 1 mL de tampon B.</li>
	<li>Incuber avec un marqueur d’ADN tel que Sytox (prendre 2 μL de stock de 5 mM et dissoudre dans 1 mL de tampon B) ou Hoechst (prendre 1 μL de stock de 10 mg/mL et dissoudre dans 1 mL de tampon B) pendant 10 minutes à température ambiante avec rotation.</li>
	<li>Effectuer un lavage avec le tampon B et une fois avec du PBS, chaque lavage durant 10 minutes tout en tournant à température ambiante. REMARQUE: N’oubliez pas de le protéger de la lumière.</li>
</ol>10. Imagerie
<ol><li>Montez les glandes salivaires sur un toboggan, en faisant une piscine avec une lamelle.</li>
	<li>Mettez les glandes salivaires au milieu de la piscine et couvrez de citifluor AF1 pour éviter la formation de bulles prolongeant le liquide visqueux partout. Ensuite, scellez tous les côtés avec du vernis à ongles clair.</li>
	<li>Observer sous un microscope à fluorescence ou confocal. Si l’échantillon ne doit pas être observé le même jour, conserver à l’abri de la lumière à 4 °C.</li>
	<li>Utilisez GraphPad Prism 6 pour générer tous les graphiques et analyses statistiques.</li>
	<li>Analyser les données de la distribution de HP1a dans les glandes salivaires en utilisant le test de Kruskal-Wallis. La signification statistique a été fixée à (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

La fonction cellulaire des organismes eucaryotes peut définir la structure 3D dans le noyau, qui est soutenue par des interactions entre différentes protéines avec la chromatine et diverses molécules, y compris l’ARN. Au cours des trois dernières années, les condensats biologiques qui ont eu de la pertinence, y compris l’hétérochromatine, ont joué un rôle fondamental dans la détermination de la séparation de phase favorisant l’organisation spatiale nucléaire distincte de la chromatine active et répressive <sup class="xre...

Depuis les premières études d’Emil Heitz1,l’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur important des processus cellulaires tels que l’expression des gènes, la séparation méiotique et mitotique des chromosomes et le maintien de la stabilité du génome2,3,4.
L’hétérochromatine est principalement divisée en deux types: l’hétérochromatine constitutive qui définit de manière caractéristique les séquences répétitives, et les éléments transposables qui sont présents à des sites chromosomiques spécifiques tels que les télomères et les centromères. Ce type d’hétérochromatine est principalement défini épigénétiquement par des marques d’histones spécifiques telles que la di ou tri-méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) et la liaison de la protéine hétérochromatine 1a (HP1a)5,6. D’autre part, l’hétérochromatine facultative se localise à travers les bras du chromosome et se compose principalement de gènes7,8. L’immunomarquage de blocs d’hétérochromatine dans les cellules métaphases, ou l’observation d’agrégats d’hétérochromatine dans les cellules interphases, a dévoilé beaucoup de lumière dans la compréhension de la formation et de la fonction des régions hétérochromatiques9.
L’utilisation de la drosophile comme système modèle a permis le développement d’outils essentiels pour étudier l’hétérochromatine sans l’utilisation de la microscopie électronique10. Depuis la description de la panachation de l’effet de position et la découverte de protéines associées à l’hétérochromatine, telles que HP1a, et de modifications post-traductionnelles des histones, de nombreux groupes ont développé plusieurs techniques immunohistochimiques qui permettent la visualisation de ces régions hétérochromatiques10,11.
Ces techniques sont basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques qui reconnaissent les protéines associées à l’hétérochromatine ou les marques d’histones. Pour chaque type de cellule et anticorps, les conditions de fixation et de perméabilisation doivent être déterminées empiriquement. En outre, les conditions peuvent varier si des procédés mécaniques supplémentaires tels que des techniques d’écrasement sont utilisés. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation des glandes salivaires de drosophile d’étudier les foyers hétérochromatiques. Les glandes salivaires ont des cellules polyténisées qui contiennent plus de 1 000 copies du génome, fournissant ainsi une vue amplifiée de la plupart des caractéristiques de la chromatine, à l’exception de l’ADN satellite et de certaines régions hétérochromatiques qui sont sous-répliquées. Néanmoins, les régions d’hétérochromatine sont facilement visualisées dans des préparations de chromosome de polytène, mais les techniques d’écrasement peuvent parfois perturber des complexes caractéristiques liés à la chromatine ou l’architecture de chromatine. Par conséquent, l’immunolocalisation des protéines dans le tissu entier des glandes salivaires peut dépasser ces effets indésirables. Nous avons utilisé ce protocole pour détecter plusieurs protéines liées à la chromatine, et nous avons démontré que ce protocole combiné avec des stocks de drosophile mutants peut être utilisé pour étudier la perturbation de l’hétérochromatine12.

<table><tbody><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Axygen MCT-150-C</td><td>11351904</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>16 % formaldéhyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>AF1 Citifluor</td><td>Ted pella</td><td>19470</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>BSA, biologie moléculaire Qualité</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>Complet, inhibiteurs de protéase Ultra sans EDTA protéase inhibiteurs</td><td>Merck</td><td>5892953001</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Corning</td><td>CLS285022-200EA</td><td>22x22, marque non critique</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>d9779</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td></td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>Glissière en verre</td> Gold <td>seal</td><td>3011</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Baker</td><td>0084-01</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>8889</td><td></td></tr><tr><td>HP1a</td><td>Hybridoma Bank</td><td>C1A9</td><td>Forme du produit&nbsp ; Concentré 0,1 mL</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Baker</td><td>3040-01</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Baker</td><td>9070-03</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>marque NaOH</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr> marque <tr><td>PIPES</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>&nbsp ; Labquake Tube Shaker</td></tr><tr><td>Thermo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>SmartBlock 1,5 mL</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Milipore</td><td>648311</td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>100 mL, marque non critique</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>25 mL, marque non critique</td></tr></tbody></table>

coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

La visualisation des agrégats d’hétérochromatine par immunostaining peut être provocante. De nombreux composants mammifères de la chromatine sont conservés chez Drosophila melanogaster. Par conséquent, c’est un excellent modèle pour étudier la formation et l’entretien de l’hétérochromatine. Les cellules polyténisées, telles que celles trouvées dans les glandes salivaires des larves de D. melanogaster du troisième stade, fournissent un excellent outil pour observer la chromatine amplifiée près de mille fois et ont permis aux chercheurs d’étudier les changements dans la distribution de l’hétérochromatine dans le noyau. Bien que l’observation des composants de l’hétérochromatine puisse être effectuée directement dans des préparations chromosomiques polytènes, la localisation de certaines protéines peut être modifiée par la gravité du traitement. Par conséquent, la visualisation directe de l’hétérochromatine dans les cellules complète ce type d’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les techniques immunostaining utilisées pour ce tissu, l’utilisation des anticorps fluorescents secondaires, et la microscopie confocale d’observer ces agrégats d’hétérochromatine avec une plus grande précision et détail.

Les résultats représentatifs de l’immunomarquage de HP1a dans les glandes salivaires de la drosophile sont illustrés à la figure 1. Un résultat positif est d’observer un point focal(figure 1a)(agrégat ou condensat hétérochromatique). Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé, c’est-à-dire avec un point double (Figure 1c), mais il se produit généralement en...

Ce protocole vise à visualiser les agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de polytène de drosophile.

Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Le but de ce protocole est de visualiser des agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de drosophile. Pour ce faire, nous utilisons des cellules polyténes qui se trouvent dans les glandes salivaires des larves du troisième stade Le génome de ces cellules est amplifié près de mille fois, et les chromosomes conservent les caractéristiques des cellules d’interface. Ils ont des télomères bien définis, et des ponts appelés chromocentres dans lesquels tous les centromères s’agrègent, et c’est principalement hétérochromatique.L’utilisation du tissu de larves du troisième stade nous permet également d’évaluer le changement dans les agrégats hétérochromatiques dans le fond de différents mutants génétiques. Pour optimiser la culture des larves du troisième stade, vous devrez d’abord collecter des adultes âgés de 5 à 10 jours et en mettre environ 50 dans une bouteille à col large d’un milieu standard. 25 hommes et 25 femmes.Placez la bouteille dans un incubateur à température contrôlée à 25 degrés Celsius pendant 12 heures. Une fois le temps d’incubation terminé, retirez les adultes et transférez-les dans une nouvelle bouteille pour répéter la procédure. Laissez les embryons pousser à 18 degrés Celsius pendant 22 heures.Pour la collecte des larves, assurez-vous de choisir les larves errantes, qui n’ont pas de sphériques. Disséquer 15 paires de glandes salivaires, ou autant que vous le pouvez en période de 30 minutes dans le PBS froid avec des inhibiteurs de protestation au microscope. Transférer les glandes salivaires dans un autre tube avec pbs glacé.Laver une fois avec du PBS froid et des inhibiteurs de protestation. Rappelez-vous, attendez toujours que le tissu atteigne le fond du tube. Après avoir retiré le PBS de la dernière étape, ajouter directement 0,5 millilitres d’un tampon de fixation des gencives du groupe X et 50% méthanol plus 2% formaldéhyde.Incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Effectuez un lavage de rotation de cinq minutes avec un tampon Tris-Triton, en ajoutant un millilitre. Attendez toujours que le tissu atteigne le fond du tube.Remarque: attendez que le tissu atteigne le fond du tube. Incuber les glandes salivaires avec Tris-Triton, le même que ci-dessus, plus 1% de bêta mercaptoéthanol pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec de légères secousses. Laver avec un tampon BO3 et incuber avec BO3 plus 10 millimolaires de TNT à 37 degrés Celsius avec une légère secousse pendant 15 minutes.À la fin de la période d’incubation, effectuez un lavage avec un millilitre de tampon BO3 seul. Incuber les glandes salivaires dans un millilitre de tampon B pendant deux heures à température ambiante avec rotation. Enlevez tout le tampon B et ajoutez le tampon A plus l’anticorps d’intérêt.Dans ce cas, nous utilisons HP one, A C 1 8 9 de la banque Iridium. 1 sur 3 000 pendant la nuit à quatre degrés avec rotation. À ce stade, il est important que la secousse ne soulève pas de bulles, ce qui pourrait endommager l’anticorps.Donner traiter par lavage de 15 minutes avec le tampon B, sous agitation à température ambiante en utilisant un millimètre à chaque fois. Les glandes sont transférées au tampon B avec le couple antibiotique secondaire à un plancher se référer pendant deux heures, sous rotation à quatre degrés. À cette étape, il est important de recouvrir le tube de papier d’aluminium pour protéger l’anticorps secondaire de la lumière.Effectuer des rondelles de 2x15 minutes à température ambiante, tout en rotation avec un millilitre de tampon B.Incuber avec un marqueur d’ADN tel que Sydox ou OH, et dissoudre dans un millilitre de tampon B pendant 10 minutes à température ambiante avec rotation. Effectuer un lavage avec tampon B et une fois avec PBS, chaque lavage d’une durée de 10 minutes, tout en tournant à température ambiante. Enfin, montez les glandes salivaires sur un toboggan, en faisant une piscine avec un glissement de couverture.Mettez les glandes salivaires au milieu de la piscine et couvrez de Sidiflor. Pour éviter la déformation de la bulle, étendre le liquide visqueux partout. Ensuite, scellez toutes les lames avec du vernis à ongles clair.Observer sous un microscope à fluorescence ou confocal. Si l’échantillon ne doit pas être observé le même jour, conservez-le à partir de la lumière à quatre degrés. Les résultats représentatifs de la monodiverstage hb1 dans les glandes salivaires de drosophile sont montrés dans la figure un.Un résultat positif est d’observer un point focal comme dans A, agrégat chromatique athéro ou condensat. Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé comme un double point en C, mais se produit généralement en plus petites quantités.Pour analyser les données, ils peuvent être représentés sous forme de graphique à barres, en comparant la distribution de HP1 avec différents arrière-plans mutants. Par exemple, dans la figure deux, nous pouvons voir que 98% des noyaux présentent une distribution d’un point. Et 2% de deux foyers en type sauvage.Dans le mutant, la proportion a changé, et la présence de deux foyers a augmenté à 40%La figure trois montre la triméthylation représentative de la lysine 9H3 en monodiverstage. Résultat dans les glandes salivaires de la drosophile observant un point focal dans B, c’est un résultat favorable à l’agrégat chromatique ou au condensat, un signal double ou triple en C peut être vu en de rares occasions, mais en petites quantités. A la fin de ce protocole, vous pourrez voir un condensat diachromatique de protéine HP1 malgré les limitations d’état, ce sera une bonne première approche.

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Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

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