Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

Le but de ce protocole est de visualiser des agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de drosophile. Pour ce faire, nous utilisons des cellules polyténes qui se trouvent dans les glandes salivaires des larves du troisième stade Le génome de ces cellules est amplifié près de mille fois, et les chromosomes conservent les caractéristiques des cellules d’interface. Ils ont des télomères bien définis, et des ponts appelés chromocentres dans lesquels tous les centromères s’agrègent, et c’est principalement hétérochromatique.

L’utilisation du tissu de larves du troisième stade nous permet également d’évaluer le changement dans les agrégats hétérochromatiques dans le fond de différents mutants génétiques. Pour optimiser la culture des larves du troisième stade, vous devrez d’abord collecter des adultes âgés de 5 à 10 jours et en mettre environ 50 dans une bouteille à col large d’un milieu standard. 25 hommes et 25 femmes.

Placez la bouteille dans un incubateur à température contrôlée à 25 degrés Celsius pendant 12 heures. Une fois le temps d’incubation terminé, retirez les adultes et transférez-les dans une nouvelle bouteille pour répéter la procédure. Laissez les embryons pousser à 18 degrés Celsius pendant 22 heures.

Pour la collecte des larves, assurez-vous de choisir les larves errantes, qui n’ont pas de sphériques. Disséquer 15 paires de glandes salivaires, ou autant que vous le pouvez en période de 30 minutes dans le PBS froid avec des inhibiteurs de protestation au microscope. Transférer les glandes salivaires dans un autre tube avec pbs glacé.

Laver une fois avec du PBS froid et des inhibiteurs de protestation. Rappelez-vous, attendez toujours que le tissu atteigne le fond du tube. Après avoir retiré le PBS de la dernière étape, ajouter directement 0,5 millilitres d’un tampon de fixation des gencives du groupe X et 50% méthanol plus 2% formaldéhyde.

Incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius avec une rotation douce. Effectuez un lavage de rotation de cinq minutes avec un tampon Tris-Triton, en ajoutant un millilitre. Attendez toujours que le tissu atteigne le fond du tube.

Remarque: attendez que le tissu atteigne le fond du tube. Incuber les glandes salivaires avec Tris-Triton, le même que ci-dessus, plus 1% de bêta mercaptoéthanol pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec de légères secousses. Laver avec un tampon BO3 et incuber avec BO3 plus 10 millimolaires de TNT à 37 degrés Celsius avec une légère secousse pendant 15 minutes.

À la fin de la période d’incubation, effectuez un lavage avec un millilitre de tampon BO3 seul. Incuber les glandes salivaires dans un millilitre de tampon B pendant deux heures à température ambiante avec rotation. Enlevez tout le tampon B et ajoutez le tampon A plus l’anticorps d’intérêt.

Dans ce cas, nous utilisons HP one, A C 1 8 9 de la banque Iridium. 1 sur 3 000 pendant la nuit à quatre degrés avec rotation. À ce stade, il est important que la secousse ne soulève pas de bulles, ce qui pourrait endommager l’anticorps.

Donner traiter par lavage de 15 minutes avec le tampon B, sous agitation à température ambiante en utilisant un millimètre à chaque fois. Les glandes sont transférées au tampon B avec le couple antibiotique secondaire à un plancher se référer pendant deux heures, sous rotation à quatre degrés. À cette étape, il est important de recouvrir le tube de papier d’aluminium pour protéger l’anticorps secondaire de la lumière.

Effectuer des rondelles de 2x15 minutes à température ambiante, tout en rotation avec un millilitre de tampon B.Incuber avec un marqueur d’ADN tel que Sydox ou OH, et dissoudre dans un millilitre de tampon B pendant 10 minutes à température ambiante avec rotation. Effectuer un lavage avec tampon B et une fois avec PBS, chaque lavage d’une durée de 10 minutes, tout en tournant à température ambiante. Enfin, montez les glandes salivaires sur un toboggan, en faisant une piscine avec un glissement de couverture.

Mettez les glandes salivaires au milieu de la piscine et couvrez de Sidiflor. Pour éviter la déformation de la bulle, étendre le liquide visqueux partout. Ensuite, scellez toutes les lames avec du vernis à ongles clair.

Observer sous un microscope à fluorescence ou confocal. Si l’échantillon ne doit pas être observé le même jour, conservez-le à partir de la lumière à quatre degrés. Les résultats représentatifs de la monodiverstage hb1 dans les glandes salivaires de drosophile sont montrés dans la figure un.

Un résultat positif est d’observer un point focal comme dans A, agrégat chromatique athéro ou condensat. Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé comme un double point en C, mais se produit généralement en plus petites quantités.

Pour analyser les données, ils peuvent être représentés sous forme de graphique à barres, en comparant la distribution de HP1 avec différents arrière-plans mutants. Par exemple, dans la figure deux, nous pouvons voir que 98% des noyaux présentent une distribution d’un point. Et 2% de deux foyers en type sauvage.

Dans le mutant, la proportion a changé, et la présence de deux foyers a augmenté à 40%La figure trois montre la triméthylation représentative de la lysine 9H3 en monodiverstage. Résultat dans les glandes salivaires de la drosophile observant un point focal dans B, c’est un résultat favorable à l’agrégat chromatique ou au condensat, un signal double ou triple en C peut être vu en de rares occasions, mais en petites quantités. A la fin de ce protocole, vous pourrez voir un condensat diachromatique de protéine HP1 malgré les limitations d’état, ce sera une bonne première approche.