Name: Surveillance de la croissance dynamique des vaisseaux rétiniens dans un modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Apprenez à préparer des montages plats rétiniens murins et à réaliser un marquage immunofluorescent pour observer la croissance dynamique des vaisseaux dans un modèle de rétinopathie induite par l'oxygène.

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Nous remercions tous les membres de notre laboratoire et du laboratoire ophtalmique vétérinaire du centre ophtalmique de Zhongshan pour leur assistance technique. Nous remercions également le professeur Chunqiao Liu pour son soutien expérimental. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC: 81670872; Beijing, Chine), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, Chine (subvention no 2019A1515011347) et le projet de construction d’un hôpital de haut niveau du Laboratoire clé d’État d’ophtalmologie du Centre ophtalmique de Zhongshan (subvention no 303020103; Guangzhou, province du Guangdong, Chine).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La sensibilité des souris à l’OIR est affectée par de nombreux facteurs. Les petits de différents antécédents génétiques et souches ne peuvent pas être comparés. Chez les souris albinos BALB/c, les vaisseaux repoussent rapidement dans la zone VO avec une réduction significative des touffes néovasculaires38, ce qui entraîne certaines difficultés pour la recherche. Chez les souris C57BL/6, les lésions photorécepteurs sont accrues par rapport à la souche39,40<sup cl...

La néovascularisation rétinienne (RNV), qui est définie comme un état où de nouveaux vaisseaux pathologiques proviennent des veines rétiniennes existantes, s’étend généralement le long de la surface interne de la rétine et se développe dans l’espace vitré (ou sous-rétinien dans certaines conditions)1. C’est une caractéristique caractéristique et une caractéristique commune de nombreuses rétinopathies ischémiques, y compris la rétinopathie du prématuré (RDP), l’occlusion veineuse rétinienne (OVR) et la rétinopathie diabétique proliférative (PDR)2.
De nombreuses observations cliniques et expérimentales ont indiqué que l’ischémie est la principale cause de néovascularisation rétinienne 3,4. Dans la RDP, les nouveau-nés sont exposés à un niveau élevé d’oxygène dans des incubateurs fermés pour augmenter les taux de survie, ce qui est également un facteur important pour l’arrêt de la croissance vasculaire. Une fois le traitement terminé, les rétines des nouveau-nés connaissent une période relativement hypoxique5. D’autres situations sont observées dans l’occlusion des veines rétiniennes centrales ou branchées dans la RVO et des lésions des capillaires rétiniens sont également observées, causées par la microangiopathie dans PDR2. L’hypoxie augmente encore l’expression de facteurs angiogéniques tels que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) par la voie de signalisation du facteur 1α induit par l’hypoxie (HIF-1α) qui, à son tour, guide les cellules endothéliales vasculaires pour se développer dans la zone hypoxique et former de nouveaux vaisseaux 6,7.
La RDP est une sorte de rétinopathie proliférative vasculaire chez les nouveau-nés prématurés et l’une des principales causes de cécité infantile 8,9, caractérisée par une hypoxie rétinienne, une néovascularisation rétinienne et une hyperplasie fibreuse10,11,12. Dans les années 1950, les chercheurs ont découvert qu’une concentration élevée d’oxygène peut améliorer considérablement les symptômes respiratoires des prématurés13,14. En conséquence, l’oxygénothérapie était de plus en plus utilisée chez les prématurés à cette époque15. Cependant, parallèlement à l’utilisation généralisée de l’oxygénothérapie chez les nouveau-nés prématurés, l’incidence de la RDP augmentait d’année en année. Depuis lors, les chercheurs ont lié l’oxygène à la RDP, explorant divers modèles animaux pour comprendre la pathogenèse de la ROP et de la RNV16.
Chez l’homme, la majeure partie du développement vasculaire rétinien est achevée avant la naissance, tandis que chez les rongeurs, le système vasculaire rétinien se développe après la naissance, fournissant un système modèle accessible pour étudier l’angiogenèse dans le système vasculaire rétinien2. Avec les progrès continus de la recherche, les modèles de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) sont devenus des modèles majeurs pour imiter l’angiogenèse pathologique résultant de l’ischémie. Il n’y a pas d’espèce animale spécifique dans l’étude du modèle OIR et le modèle a été développé chez diverses espèces animales, y compris chaton 17, rat18, souris 19, beagle puppy 20 et poisson zèbre 21. Tous les modèles partagent le même mécanisme par lequel ils sont exposés à l’hyperoxie au début du développement rétinien, puis retournés dans l’environnement normoxique. Smith et al. ont observé que l’exposition des bébés souris à l’hyperoxie de P7 pendant 5 jours induisait une forme extrême de régression des vaisseaux dans la rétine centrale et les ramener à l’air ambiant à P12 déclenchait progressivement des touffes néovasculaires, qui se sont développées vers le corps vitré19. Il s’agissait d’un modèle de souris OIR standardisé également nommé modèle Smith. Connor et al. ont encore optimisé le protocole et fourni une méthode universellement applicable pour quantifier la zone de VO (vaso-oblitération) et NV (néovascularisation) en 2009, ce qui a augmenté l’acceptation et l’utilisation du modèle22. Le modèle murin OIR est toujours le modèle le plus largement utilisé aujourd’hui en raison de sa petite taille, de sa reproduction rapide, de son bagage génétique clair, de sa bonne répétabilité et de son taux de réussite élevé.
Chez la souris, la vascularisation rétinienne commence après la naissance avec la croissance des vaisseaux de la tête du nerf optique dans la rétine interne vers l’ora serrata. Au cours du développement rétinien normal, les premiers vaisseaux rétiniens jaillissent de la tête du nerf optique autour de la naissance, formant un réseau en expansion (le plexus primaire) qui atteint la périphérie vers le jour postnatal 7 (P7) 23. Ensuite, les vaisseaux commencent à se développer dans la rétine pour former une couche profonde, pénétrer dans la rétine et établir un réseau laminaire autour de la couche nucléaire interne (INL) comme chez l’homme24. À la fin de la troisième semaine postnatale (P21), le développement plus profond du plexus est presque terminé. Pour le modèle murin OIR, l’occlusion vasculaire apparaît toujours dans la rétine centrale en raison de la dégénérescence rapide d’un grand nombre de réseaux vasculaires immatures dans la région centrale lors de l’exposition à l’hyperoxie. Ainsi, la croissance de la néovascularisation pathologique se produit également dans la rétine périphérique moyenne, qui est la limite de la zone de non-perfusion et de la zone vasculaire. Cependant, les vaisseaux rétiniens humains se sont presque formés avant la naissance. Comme pour les prématurés, la rétine périphérique n’est pas complètement vascularisée lorsqu’elle est exposée à l’hyperoxie25,26. Ainsi, l’occlusion vasculaire et la néovascularisation apparaissent principalement dans la rétine périphérique27,28. Malgré ces différences, le modèle OIR murin récapitule étroitement les événements pathologiques qui se produisent lors de la néovascularisation induite par l’ischémie.
L’induction du modèle OIR peut être divisée en deux phases29 : en phase 1 (phase hyperoxie), le développement vasculaire rétinien est arrêté ou retardé avec occlusion et régression des vaisseaux sanguins à la suite du déclin du VEGF et de l’apoptose des cellules endothéliales 24,30 ; En phase 2 (phase hypoxie), l’apport rétinien en oxygène deviendra insuffisant dans les conditions de l’air ambiant29, ce qui est essentiel pour le développement neuronal et l’homéostasie 19,31. Cette situation ischémique entraîne généralement une néovascularisation anormale non régulée.
Actuellement, la méthode de modélisation couramment utilisée est l’alternance d’une exposition élevée / faible à l’oxygène: les mères et leurs petits sont exposés à 75% d’oxygène pendant 5 jours à P7, suivis de 5 jours dans l’air ambiant jusqu’à ce que P17 ait démontré des résultats comparables22, qui est le critère d’évaluation de l’induction du modèle murin OIR. (Figure 1). En plus de simuler la RDP, cette néovascularisation pathologique médiée par l’ischémie peut également être utilisée pour étudier d’autres maladies ischémiques de la rétine. Les principales mesures de ce modèle comprennent la quantification de la zone de VO et NV, qui sont analysées à partir de supports plats rétiniens par coloration par immunofluorescence ou perfusion FITC-dextrane. Chaque souris ne peut être étudiée qu’une seule fois en raison de l’opération létale. À l’heure actuelle, il existe peu de méthodes pour observer les changements dynamiques du système vasculaire rétinien en continu au cours du processus de régression vasculaire et d’angiogenèse pathologique32. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé d’induction du modèle OIR, l’analyse des montures plates rétiniennes ainsi qu’un flux de travail d’angiographie du fond d’œil à la fluorescéine (FFA) sur des souris, ce qui serait utile pour acquérir une compréhension plus complète des changements dynamiques vasculaires au cours des deux phases du modèle murin OIR.

<table><tbody><tr><td>Seringue stérile de 1 mL</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>Pour la préparation de montages plats rétiniens et l’injection intrapéritonéale</td></tr><tr><td>1&fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp ; FG701-01</td><td>Pour la préparation de supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>2 ml Tube de microcentrifugation</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>Pour la préparation de supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>48 Plaques à puits multiples traitées TC bien claires</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Pour la préparation de supports plats rétiniens Lames de</td></tr><tr><td>microscope adhésives</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour la préparation de supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Dioxyde de carbone</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour le sacrifice</td></tr><tr><td>Lame de couverture</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour la préparation des supports plats rétiniens Pinces</td></tr><tr><td>courbes</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>Pour la préparation des supports plats rétiniens Solution</td></tr><tr><td>de coloration DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>Pour l’étiquetage du noyau sur les supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>Pour la préparation de montures plates rétiniennes</td></tr><tr><td>Fluorescéine sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>&nbsp ; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>Pour l’acquisition d’images de fluorescence de montures plates rétiniennes</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Supports de montage</td><td>SouthernBiotech</td><td>&nbsp ; 0100-01</td><td>Pour la préparation de supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Hydroxypropylméthylcellulose</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Isolectine B4 594 Anticorps</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Pour le marquage du système vasculaire rétinien sur des supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Souris C57/BL6J</td><td>GemPharmatech de la province du Jiangsu Pour l’induction de</td><td>modèles OIR</td>Micro dissection <td></td></tr><tr><td> ciseaux-lame droite</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>Pour la préparation de supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Pince droite n°4</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp ; 501978-6</td><td>Pour la préparation des montures plates rétiniennes Sérum</td></tr><tr><td>d’âne normal</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>Pour la préparation des montures plates rétiniennes</td></tr><tr><td>O2</td><td>Capteur Divers</td><td></td><td>Pour la surveillance du niveau de O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>Pour l’induction du modèle OIR</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Pour la fixation tissulaire</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour l’anesthésie Chaux</td></tr><tr><td>sodée</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour l’absorption de l’excès de CO2 dans la chambre à oxygène</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>Pour l’analyse statistique</td></tr><tr><td>Agitateur de détrempage de tansference</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>Pour la préparation des supports plats rétiniens Boîte de</td></tr><tr><td>culture tissulaire (embout bas)</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>Pour la préparation des supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour la préparation des supports plats rétiniens</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; SLBW6818</td><td>Pour la préparation des montures plates rétiniennes</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour l’imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie ZEN</td><td>ZEISS</td><td>Pour l’acquisition et l’exportation</td><td></td> d’images</tr></tbody></table>

surveillance de la croissance dynamique des vaisseaux rétiniens dans un modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) est largement utilisée pour étudier la croissance anormale des vaisseaux dans les maladies rétiniennes ischémiques, y compris la rétinopathie du prématuré (RDP), la rétinopathie diabétique proliférante (PDR) et l’occlusion veineuse rétinienne (OVR). La plupart des études OIR observent la néovascularisation rétinienne à des moments précis; cependant, la croissance dynamique des vaisseaux chez les souris vivantes le long d’un parcours temporel, ce qui est essentiel pour comprendre les maladies des vaisseaux liées à l’OIR, a été sous-étudiée. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour l’induction du modèle murin OIR, en soulignant les pièges potentiels et en fournissant une méthode améliorée pour quantifier rapidement les zones de vaso-oblitération (VO) et de néovascularisation (NV) en utilisant la coloration par immunofluorescence. Plus important encore, nous avons surveillé la repousse des vaisseaux chez des souris vivantes de P15 à P25 en effectuant une angiographie du fond d’œil à la fluorescéine (FFA) dans le modèle murin OIR. L’application de FFA au modèle murin OIR nous permet d’observer le processus de remodelage pendant la repousse des vaisseaux.

Dans le modèle murin OIR, le résultat le plus important et le plus fondamental est la quantification de la zone VO et NV. Après avoir vécu dans l’environnement hyperoxique pendant 5 jours à partir de P7, la rétine centrale des chiots a montré la plus grande zone de non-perfusion. Sous la stimulation de l’hypoxie dans 5 jours supplémentaires, une néovascularisation rétinienne a été progressivement produite qui a fluorescé plus intensément que les vaisseaux normaux environnants. Après P17, le signal de fluorescence de la n...

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la préparation et la coloration par immunofluorescence de supports plats rétiniens de souris et l’analyse. L’utilisation de l’angiographie à la fluorescéine du fond d’œil (FFA) pour les petits de souris et le traitement d’images sont également décrits en détail.

Surveillance de la croissance dynamique des vaisseaux rétiniens dans un modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Ce protocole peut aider les chercheurs à séparer facilement les rétines des souris et à observer les changements dynamiques dans le système vasculaire rétinien du modèle murin OIR. Les principaux avantages de cette méthode sont la préservation de l’intégrité des rétines séparées et la possibilité pour chaque souris de servir de contrôle, ce qui rend les résultats plus comparables. Les chercheurs qui essaient cette méthode pour la première fois peuvent avoir du mal à prendre les cinq images d’orientation, car il est un peu difficile de placer les chiots dans la bonne position.Pour recueillir le tissu pour le montage entier de la rétine, utilisez des ciseaux incurvés pour déconnecter les globes oculaires du tissu orbital d’un chiot C57-Black/6 euthanasié. Ensuite, insérez des pinces incurvées dans la partie postérieure du globe oculaire, en serrant le nerf optique et en soulevant rapidement l’œil de l’orbite. Placez les globes oculaires dans du PBS pré-refroidi pour enlever les poils et le sang de la surface.Lorsque tous les globes oculaires ont été collectés, transférer les globes oculaires nettoyés dans un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant 4% de paraformaldéhyde et

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