Réalisation d’un criblage efficace des fragments dans l’installation de XChem à Diamond Light Source
29 mai 2021
Cet article décrit le processus complet de XChem pour le criblage de fragments à base de cristaux, à partir de la demande d’accès et de toutes les étapes ultérieures jusqu’à la diffusion des données.
L’installation XChem de Diamond Light Source fournit un criblage de routine à grande échelle des fragments graphiques cristallins, prenant en charge l’ensemble du processus de dépôt de cristaux. La cristallographie aux rayons X est un élément essentiel de la boîte à outils FBDD. Il est suffisamment sensible pour identifier les liants faibles et fournit directement des informations structurelles sur les interactions au niveau moléculaire.
La découverte de médicaments à partir de fragments est une stratégie largement utilisée pour la découverte de prospects. Elle a livré six médicaments à usage clinique et plus de 50 molécules ont fait l’objet d’essais cliniques. L’impact des avancées et de l’efficacité fournies par la plate-forme XChem par rapport aux méthodes traditionnelles de trempage, de collecte et d’analyse des données est mieux démontré visuellement.
Commencez par choisir l’emplacement des cristaux et du composé. Ouvrez TextRank à partir d’un PC et sélectionnez le plateau en cristal, soit dans la liste en bas à droite, soit en tapant le code-barres dans la case en haut à gauche. Sélectionnez le format d’image approprié et la vue à puits unique.
Pour ajouter du solvant ou des composés à une goutte sans toucher le cristal, cliquez avec le bouton droit de la souris à l’intérieur de la goutte, mais loin du cristal lorsqu’un cristal approprié pour une expérience est trouvé en vous déplaçant dans les images de la goutte. Ouvrez le logiciel Echo et sélectionnez de nouvelles solutions pour distribuer à l’aide du distributeur acoustique. Choisissez la bonne plaque de puits source et la classe de liquide.
Assurez-vous que le type de plaque correct est sélectionné comme plaque de destination. Cochez ensuite la case personnalisée et continuez. Sélectionnez Importer, puis choisissez le fichier batch approprié.
Effectuez ensuite les étapes d’importation comme demandé par le logiciel. Utilisez les cartes des plaques pour vérifier la solution à distribuer et les emplacements de destination. Exécutez ensuite le protocole en suivant les invites au fur et à mesure qu’elles s’affichent.
Les solutions de la plaque source seront distribuées dans les gouttes de cristal choisies. Conservez l’assiette dans l’incubateur pendant le temps requis. Pour récolter les cristaux à l’aide du dispositif semi-automatique de récolte de cristaux, appuyez sur le bouton de démarrage du flux de travail pour passer à la première position de puits sélectionnée.
Si le cristal a survécu, montez-le dans la boucle et plongez-le dans l’azote liquide, en le plaçant en position 1 dans la première rondelle de la liste. Sélectionnez la description appropriée pour le cristal dans l’interface. S’il s’agit d’un trempage composé, notez la description de l’état composé.
Si le cristal a été monté avec succès, sélectionnez monté, sinon, sélectionnez échec. Une fois que les cristaux ont été récoltés, apportez les rondelles au lecteur de codes-barres et placez-les dans le support une à la fois pour scanner la rondelle et épingler les codes-barres. Une fois le balayage terminé, placez les couvercles sur les rondelles et stockez-les dans un réservoir de stockage d’azote liquide.
Pour vous souvenir des échantillons mal centrés, examinez la vue du passeur d’échantillons dans ISPyB et sélectionnez Classer en fonction de la résolution AP pour classer les échantillons en fonction de la résolution du traitement automatique dans une gradation de couleur allant du vert au rouge. Cliquez sur les échantillons pour vérifier s’il y a des échantillons rouges ou jaunes. Vérifiez ensuite les instantanés du cristal pour voir si le cristal a été centré.
Pour récupérer et analyser les résultats du traitement automatique de Diamond via XChem Explorer ou XCE, dans un terminal, allez dans le sous-dossier processing et utilisez l’alias XCE pour ouvrir XChem Explorer. Sélectionnez le bouton Mettre à jour les tables à partir de la source de données dans l’onglet Vue d’ensemble pour actualiser le résumé des données expérimentales. Sous l’onglet Paramètres, sélectionnez le répertoire de collecte de données, ouvrez l’onglet Jeux de données.
Choisissez la cible dans le menu déroulant Sélectionner une cible, sélectionnez Obtenir de nouveaux résultats à partir du traitement automatique dans le menu déroulant Jeux de données, puis cliquez sur Exécuter. Pour calculer les cartes initiales à l’aide de l’option Fossette, ouvrez l’onglet Cartes, choisissez le modèle de référence dans le menu déroulant et sélectionnez les jeux de données souhaités, puis exécutez l’option Fossette sur les fichiers MTZ sélectionnés. Pour générer des restrictions de ligand, sélectionnez les jeux de données souhaités, puis créez un fichier SCF, PDB ou PNG des composés sélectionnés dans la liste déroulante Cartes et contraintes.
Pour identifier les accès à l’aide de Panda, sélectionnez l’onglet Pandas, assurez-vous que le répertoire de sortie est correctement défini et exécutez panda. Analysez à partir du menu déroulant Identification des résultats. Pour analyser les accès identifiés par Panda, exécutez panda.
Inspectez à partir du menu déroulant Identification de l’accès. Pour ouvrir Coot avec le panneau de configuration Panda. Cartes de charge moyenne et 2mFo-DFc de Dimple pour comparaison avec la carte et le modèle d’événements.
Une fois qu’un ligand a été ajusté, cliquez sur fusionner le ligand avec le modèle et enregistrer le modèle avant de passer à un autre événement pour éviter de perdre les modifications apportées au modèle d’état lié. Annotez l’événement de liaison à l’aide du champ de commentaire d’événement et annotez les sites de liaison à l’aide des informations sur le site d’enregistrement. Une fois que tous les ligands viables ont été modélisés, fusionnés et enregistrés sur la base de la carte des événements, fermez panda.inspect.
Exportez les modèles d’inspection Panda dans le répertoire du projet et lancez un premier tour d’affinement pour les jeux de données sélectionnés, et l’affinement sera désormais visible dans l’onglet d’affinement. Le pipeline XChem pour le criblage de fragments par cristallographie aux rayons X a été considérablement rationalisé, ce qui a permis son adoption par la communauté scientifique. Ce graphique illustre l’adoption et la consolidation du programme utilisateur de 2015 à 2019 avec la création de groupes d’allocation de blocs en 2019 et la résilience de la plateforme pendant la pandémie de COVID-19 en 2020.
Les campagnes réussies permettent d’obtenir une carte tridimensionnelle des sites d’interaction potentiels sur la protéine cible. Un résultat typique est le criblage XChem de la protéase principale du SRAS-CoV-2. Les sites d’intérêt connus, tels que les sites actifs enzymatiques et les sous-poches, sont indiqués en jaune.
Les sites allostériques putatifs, tels que ceux impliqués dans les interactions protéine-protéine, sont représentés en magenta et les interfaces d’empilement cristallin, généralement considérées comme des faux positifs, sont indiquées en vert. Historiquement, l’utilisation de la cristallographie comme crible primaire de fragments a été difficile. Cette étude a documenté les protocoles de pipeline XChem, de la préparation de l’échantillon aux structures finales.
Le criblage de fragments cristallographiques complète d’autres techniques biophysiques et est généralement essentiel pour faire progresser les fragments jusqu’aux composés de plomb. Il peut être appliqué à n’importe quelle classe cible de découverte de médicaments.
Aperçu
Cet article décrit l'ensemble du processus XChem pour le criblage de fragments basé sur les cristaux, en détaillant les étapes allant de la demande d'accès à la diffusion des données. La plateforme XChem du Diamond Light Source améliore la découverte de médicaments par criblage de fragments grâce à une cristallographie aux rayons X efficace.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Découverte de médicaments fondée sur les fragments (FBDD)
- Cristallographie aux rayons X
- Biologie structurale
Contexte
- La découverte de médicaments basée sur les fragments est une stratégie de recherche de composés initiateurs.
- La cristallographie aux rayons X fournit des informations structurales sur les interactions moléculaires.
- Les méthodes traditionnelles d’imprégnation présentent des limites que XChem permet de surmonter.
- La plateforme XChem a fait preuve de résilience pendant la pandémie de COVID-19.
Objectif de l'étude
- Documenter les protocoles du pipeline XChem, de la préparation des échantillons à l'obtention des structures finales.
- Démontrer l'efficacité de la plateforme XChem pour le criblage de fragments.
- Mettre en évidence l'impact du criblage cristallographique de fragments sur la découverte de médicaments.
Méthodes utilisées
- Sélection de cristaux et de composés pour le criblage.
- Utilisation de distributeurs acoustiques pour la distribution de solutions.
- Récupération des cristaux à l'aide de dispositifs semi-automatiques.
- Analyse des données à l'aide des logiciels XChem Explorer et Panda.
Résultats principaux
- Les campagnes réussies produisent des cartes tridimensionnelles des sites d'interaction.
- Recensement de l'utilisation du programme par les utilisateurs de 2015 à 2019.
- Identification de sites allostériques potentiels et de sites actifs sur les protéines.
- Des protocoles simplifiés permettent un accès élargi à la communauté scientifique.
Conclusions
- Le pipeline XChem améliore considérablement l'efficacité du criblage de fragments.
- Le criblage cristallographique de fragments complète d'autres techniques biophysiques.
- Les progrès réalisés sur la plateforme XChem soutiennent les efforts continus de découverte de médicaments.
Questions fréquemment posées
Pertinence stratégique pour l'industrie
La découverte de médicaments basée sur des fragments repose sur la détection sensible d'interactions moléculaires faibles, domaine dans lequel la cristallographie aux rayons X fournit à la fois l'affinité de liaison et des détails structuraux essentiels à l'optimisation des candidats. La plateforme XChem du Diamond Light Source rationalise le criblage cristallographique de fragments, de la préparation des échantillons jusqu'au dépôt des données, permettant l'identification systématique de ligands faibles avec une grande fidélité structurale. Cette capacité soutient la validation précoce des cibles et la progression des « hits » vers des précurseurs thérapeutiques dans divers domaines thérapeutiques, réduisant ainsi les incertitudes mécanistiques dans les voies de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques grâce à l'observation directe des modes de liaison des ligands à une résolution atomique.
- Valeur opérationnelle : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en confirmant l'engagement de la cible et l'accessibilité du site de liaison avant tout investissement dans une campagne.
- Valeur prédictive : Génère des points de départ hautement fiables pour la chimie médicinale en identifiant des fragments présentant des géométries d'interaction définies.
Développement de criblages et de tests
- Préparation aux tests : Fournit des résultats structuraux standardisés et reproductibles permettant une évaluation fiable des composés au cours des campagnes.
- Extensibilité : Permet le criblage à haut débit grâce à une manipulation automatisée des échantillons et à une collecte de données sans surveillance sur la ligne de faisceau I04-1.
- Qualité des données : Génère des cartes de densité électronique quantitatives et des contraintes ligand qui soutiennent la validation des hits et le raffinement ultérieur.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fournit des informations structurales compatibles avec le développement de biomarqueurs en cartographiant les sites d'interaction liés à la fonction.
- Réduction des risques précliniques : Permet un suivi rapide des composés actifs identifiés sur des cibles émergentes, comme démontré lors du criblage de la protéase principale du SARS-CoV-2 avec un délai de 3 semaines.
- Pertinence pour le portefeuille : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des preuves structurales de liaison à travers diverses classes de cibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La plateforme XChem s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés actifs, en fournissant des données structurales qui orientent le choix des hits et les stratégies d'optimisation.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en fournissant des preuves structurales directes des interactions composé-cible, clarifiant ainsi les mécanismes de liaison.
- Tri : Permet la préparation des tests grâce à des procédés automatisés de manipulation des cristaux, de distribution de solvant et de traitement des données, assurant la reproductibilité.
- Analyse : Produit des résultats quantifiables, notamment des cartes d'événements de liaison des ligands, des modèles prêts au raffinement et des annotations de sites, permettant des analyses comparatives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les fragments actifs à la continuité préclinique en fournissant un contexte structural pour l'engagement du cible et la modulation allostérique.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité de tri structural réutilisable, accessible via des voies académiques évaluées par les pairs et des voies industrielles propriétaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à la visualisation directe de la structure des interactions faibles, réduisant ainsi l'ambiguïté dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardisation et reproductibilité grâce à des protocoles simplifiés, à la distribution automatisée et à une gestion centralisée des données via XChem Explorer.
- Valeur stratégique : Décisions améliorées quant au passage ou non à l'étape suivante, grâce à la confirmation structurale des « hits » qui complète le triage par criblage biophysique.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque rendue possible par les données structurales sur la plasticité du site de liaison et les points chauds d'interaction.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cristallographie, en gestion de bibliothèques de fragments et en interprétation de données structurales.
- Dépend de l'accès à des lignes de lumière de synchrotron, à des systèmes de distribution acoustique et à des outils automatisés de récolte de cristaux.
- Implique une standardisation interéquipes pour le suivi des échantillons, la dénomination des données et les protocoles de dépôt via ISPyB et XChem Explorer.
- Implique des adaptations en fonction de la qualité des cristaux, de la compatibilité des solvants et des conditions d'imbibition spécifiques à la cible.
- Les limitations pratiques incluent la dépendance à l'obtention de cristaux et à la sensibilité aux rayons X de certaines cibles, comme indiqué dans l'étude.
