Name: Modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Découvrez un modèle de poisson-zèbre pour étudier les métastases du neuroblastome par surexpression de MYCN et LMO1. Cette méthode permet l'imagerie in vivo en temps réel de la dissémination tumorale et le criblage de nouvelles thérapies anticancéreuses.

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Ce travail a été soutenu par une subvention R01 CA240323 (S.Z.) de l’Institut national du cancer; une subvention W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) du Département de la Défense des États-Unis (DoD); un prix V Scholar de la V Foundation for Cancer Research (S.Z.) et une subvention de plateforme du Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); et le soutien du Mayo Clinic Cancer Center et du Center for Individualized Medicine (S.Z.).

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le poisson-zèbre est couramment utilisé dans la recherche depuis quelques décennies, en particulier dans la recherche sur le cancer, pour des raisons évidentes, telles que sa facilité d’entretien, sa reproduction robuste et ses avantages évidents pour l’imagerie in vivo1,28. Le modèle du poisson-zèbre peut être facilement manipulé embryonnairement en raison de sa fécondation externe et de son développement, ce qui complète bien les organismes modèles de ...

Le poisson-zèbre a été largement utilisé et appliqué à plusieurs domaines de recherche, en particulier dans le cancer. Ce modèle offre de nombreux avantages, tels que sa reproduction robuste, son entretien rentable et sa visualisation polyvalente de la croissance tumorale et des métastases, qui font du poisson-zèbre un outil puissant pour étudier et étudier les bases cellulaires et moléculaires de la tumorigenèse et des métastases. De nouvelles techniques de cartographie du génome à grande échelle, de transgénèse, de surexpression ou d’assommation des gènes, de transplantation cellulaire et de criblages chimiques ont considérablement augmenté la puissance du modèle du poisson-zèbre1. Au cours des dernières années, de nombreuses lignées de poissons-zèbres ont été développées pour étudier la tumorigenèse et les métastases d’une variété de cancers humains, y compris, mais sans s’y limiter, la leucémie, le mélanome, le rhabdomyosarcome et le carcinome hépatocellulaire2,3,4,5. De plus, le premier modèle de poisson-zèbre de neuroblastome (NB) a été généré en surexprimant MYCN, un oncogène, dans le système nerveux sympathique périphérique (PSNS) sous le contrôle du promoteur de la dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). Avec ce modèle, il a été démontré que l’ALK activé peut créer une synergie avec MYCN pour accélérer l’apparition de la tumeur et augmenter la pénétrance tumorale in vivo6.
NB est dérivé de la lignée sympatho-surrénale des cellules de la crête neurale et est un cancer hautement métastatique chez les enfants7. Il est responsable de 10 % des décès liés au cancer pédiatrique8. Largement métastasé au moment du diagnostic, nb peut être cliniquement présenté comme des tumeurs provenant principalement le long de la chaîne des ganglions sympathiques et de la médullosurrénale de PSNS9,10. L’amplification du MYCN est généralement associée à de mauvais résultats chez les patients atteints de NB11,12. De plus, l’OVM1 a été identifié comme un gène critique de susceptibilité au NB dans les cas à haut risque13,14. Des études ont montré que la coexpression transgénique de MYCN et de LMO1 dans le PSNS du modèle du poisson-zèbre favorise non seulement l’apparition précoce du NB, mais induit également des métastases généralisées dans les tissus et les organes qui sont similaires aux sites couramment observés chez les patients atteints de NB13 à haut risque. Très récemment, un autre phénotype métastatique de NB a également été observé dans un nouveau modèle de POISSON-zèbre de NB, dans lequel MYCN et Lin28B, codant pour une protéine de liaison à l’ARN, sont surexprimés sous le contrôle du promoteur dβh16.
L’approche transgénique stable chez le poisson-zèbre est souvent utilisée pour étudier si la surexpression d’un gène d’intérêt pourrait contribuer au développement normal et à la pathogenèse de la maladie14,15. Cette technique a été utilisée avec succès pour démontrer l’importance de plusieurs gènes et voies pour la tumorigenèse NB6,16,17,18,19,20. Cet article présentera comment la lignée de poissons transgénique qui surexprime à la fois MYCN et LMO1 dans le PSNS a été créée et comment il a été démontré que la coopération de ces deux oncogènes accélère l’apparition de la tumorigenèse NB et des métastases13. Tout d’abord, la lignée transgénique qui surexprime EGFP-MYCN sous le contrôle du promoteur dβh (lignée MYCN désignée) a été développée en injectant la construction dβh-EGFP-MYCN dans une étape unicellulaire d’embryons AB de type sauvage (WT), comme décrit précédemment6,17. Une lignée transgénique distincte qui surexprime LMO1 dans la PSNS (lignée désignée LMO1) a été développée en cojectant deux constructions d’ADN, dβh-LMO1 et dβh-mCherry, dans des embryons WT au stade unicellulaire13. Il a déjà été démontré que les constructions à double ADN co-projetées peuvent être cointégrées dans le génome du poisson; par conséquent, LMO1 et mCherry sont coexprimés dans les cellules PSNS des animaux transgéniques. Une fois que les embryons F0 injectés ont atteint la maturité sexuelle, ils ont ensuite été croisés avec des poissons WT pour l’identification de poissons positifs avec intégration transgénique(s). En bref, la progéniture F1 a d’abord été examinée par microscopie fluorescente pour l’expression de mCherry dans les cellules PSNS. L’intégration germinale du LMO1 chez les poissons mCherry-positifs a été confirmée par PCR génomique et séquençage. Après identification réussie de chaque lignée transgénique, la descendance de poissons transgéniques hétérozygotes MYCN et LMO1 a été croisée pour générer une lignée de poissons composée exprimant à la fois MYCN et LMO1 (désigné MYCN; Ligne LMO1). MYCN porteur de tumeur; Les poissons LMO1 ont été surveillés par microscopie fluorescente toutes les deux semaines pour détecter la présence de tumeurs métastatiques dans les régions éloignées du site primaire, région de la glande interrénale (IRG, équivalent poisson-zèbre de la glande surrénale humaine)13. Confirmer la métastase des tumeurs dans MYCN; Des analyses LMO1, histologiques et immunohistochimiques ont été appliquées.

<table><tbody><tr><td>3,3'-diaminobenzidine (DAB) Kit vectoriel</td><td>Vecteur</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher Scientific / Acros Organic</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Agarose GP2</td><td>Midwest Scientific</td><td>009012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Kit de blocage de l’avidine/biotine</td><td>Vecteur</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>BOND Détection R intense Leica</td><td>Biosystems</td><td>DS9263</td><td></td></tr><tr><td>Diluant d’anticorps primaire BOND</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>Instrument BOND-MAX IHC Leica</td><td>Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>N/A</td><td>Système de coloration IHC entièrement automatisé</td></tr><tr><td>CH211-270H11 Clone BAC</td> Centre de <td>ressources BACPAC (BRFC)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope composé équipé d’une caméra DP71</td><td>Olympus</td><td>AX70</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL (support de montage à base de xylène)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>prêt à l’emploi (aucune préparation nécessaire)</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Carolina</td><td>86-1263</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II mélange d’enzymes</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II mélange d’enzymes</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-Rb de chèvre (biotinylé)</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>HHS-32-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP Avidin D</td><td>Vector</td><td>A-2004</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Aqua Solutions</td><td>4360-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène, 3 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme I-SceI</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694L</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Teknova, Inc.</td><td>K2150</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de lithium</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Microtome pour la coupe</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chimiquement compétent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>p3E-polyA</td><td>&nbsp ;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>un don généreux (Veuillez vous référer à la page Web http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page pour obtenir du matériel, qui est librement distribué comme décrit.)</td></tr><tr><td>Cire de paraffine</td><td>Surgipath Paraplast</td><td>39603002</td><td>Parrafin à paraffine</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>vecteur pDEST (vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-SceI)</td><td>Dr. C. Grabher, Institut de technologie de Karlsruhe, Karlsruhe, Allemagne</td><td>N/A</td><td>un don généreux</td></tr><tr><td>pDONR 221 passerelle vecteur donneur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12536-017</td><td></td></tr><tr><td>vecteur donneur pDONRP4-P1R</td><td>&nbsp ;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>un don généreux</td></tr><tr><td>Rouge de phénol, 0,5 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp ; P0290</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10X</td><td>BioRad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirrius kit de coloration rouge</td><td>Polysciences</td><td>24901-250</td><td></td></tr><tr><td>pME-mCherry</td><td>Addgene</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K, recombinante, qualité PCR</td><td>Roche</td><td>21712520</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>RDO Détartrant rapide</td><td>Apex Enginerring</td><td>RDO04</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence stéréoscopique</td><td>Leica</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence stéréoscopique équipé d’un viseur numérique Appareil photo DS-U1 pour l’imagerie</td><td>Nikon</td><td>SMZ-1500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymérase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP&reg ; &nbsp ; 6 AI Processeur d’infiltration sous vide</td><td>Sakura</td><td>N/A</td><td>Modèle # : VIP-6-A1</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical Incorporated</td><td>20513</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Le poisson-zèbre est devenu un modèle animal important pour étudier les maladies humaines, en particulier le cancer. Outre les technologies robustes d’édition transgénique et du génome appliquées à la modélisation du poisson-zèbre, la facilité d’entretien, la productivité à haut rendement et la puissante imagerie vivante font du poisson-zèbre un système modèle précieux pour étudier les métastases et les bases cellulaires et moléculaires sous-jacentes à ce processus in vivo. Le premier modèle de métastases du neuroblastome du poisson-zèbre (NB) a été développé en surexprimant deux oncogènes, MYCN et LMO1, sous contrôle du promoteur dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). MyCN et LMO1 co-surexprimés ont conduit à la réduction de la latence et à l’augmentation de la pénétrance de la neuroblastomagenèse, ainsi qu’à une métastase à distance accélérée des cellules tumorales. Ce nouveau modèle réitère de manière fiable de nombreuses caractéristiques clés du NB métastatique humain, y compris l’implication d’altérations génétiques cliniquement pertinentes et associées aux métastases; développement naturel et spontané de métastases in vivo; et les sites conservés de métastases. Par conséquent, le modèle du poisson-zèbre possède des avantages uniques pour disséquer le processus complexe de métastases tumorales in vivo.

Pour déterminer si le LMO1 est en synergie avec le MYCN pour affecter la pathogenèse du NB, des constructions transgéniques qui déterminent l’expression de LMO1 (dβh:LMO1 et dβh:mCherry) ou de MYCN (dβh:EGFP-MYCN) dans les cellules PSNS sous contrôle du promoteur dβh ont été injectées dans des embryons de poisson-zèbre13. Comme l’illustre la figure 1A, après le développement de lignées transgéniqu...

Cet article présente la méthode de développement, de caractérisation et de suivi en temps réel des métastases tumorales dans le modèle de poisson zèbre du neuroblastome, en particulier dans la ligne transgénique de poisson-zèbre avec surexpression de MYCN et LMO1, qui développe des métastases spontanément.

Modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Ces méthodes ont été utilisées pour développer le premier modèle de poisson zèbre de métastases de neuroblastome. Et de démontrer que ce modèle peut récapituler fidèlement de nombreuses caractéristiques des métastases observées chez les patients présentant un risque élevé de neuroblastome. Le principal avantage de ce modèle métastatique de poisson-zèbre est l’imagerie in vivo en temps réel de la dissémination tumorale pour mieux comprendre quand, et éventuellement comment les métastases se produisent.Cette technique n’est pas spécifique au neuroblastome. Il peut être appliqué à des modèles de poisson-zèbre de divers types de cancers tant que les cellules tumorales peuvent être identifiées et suivies, ce qui ouvre un éventail de possibilités. Pour commencer, développer une lignée de poissons transgénique hétérozygote surexprimant à la fois MYCN et LMO1 en croisant les lignées transgéniques MYCN et LMO1.Un jour après la fécondation, utilisez un microscope à fluorescence stéréoscopique pour trier la progéniture de l’outcross pour l’expression de l’EGFP, qui se présente comme des points positifs de l’EGFP. Après le tri, isolez les embryons criblés dans des boîtes de Pétri séparées et étiquetez les plats comme MYCN positif ou MYCN négatif. Visualisez et triez les embryons des deux groupes pour l’expression de LMO1 trois à quatre jours après la fécondation.Recherchez des taches de fluorescence rouges dans le ganglion cervical supérieur et les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS, en particulier dans la moelle oblongée du cerveau postérieur. Effectuez le dépistage avant que les embryons n’atteignent cinq jours après la fécondation. Ensuite, isolez les poissons triés en quatre groupes de génotypes différents et étiquetez comme MYCN seulement, LMO1 seulement, MYCN et LMO1 à la fois et de type sauvage.Élevez-les dans des conditions identiques selon les protocoles standard. Visualisez les tumeurs avec un microscope à fluorescence stéréoscopique en retournant doucement les poissons avec une spatule métallique des deux côtés latéraux pour voir la tumeur. Après avoir identifié les poissons porteurs de tumeurs possibles, isolez-les dans un réservoir séparé avec des étiquettes appropriées qui incluent la date de naissance, la date à laquelle la tumeur a été dépistée et le génotype.Six semaines après la fécondation, répétez les étapes précédentes pour dépister les poissons porteurs de tumeurs et les poissons non porteurs de tumeurs afin de confirmer la présence de tumeurs pour les poissons précédemment dépistés ou d’identifier de nouveaux poissons porteurs de tumeurs. Recherchez la taille soutenue ou augmentée de la masse positive de fluorescence et des poissons porteurs de tumeurs confirmés. Après avoir identifié les poissons porteurs de tumeurs, surveillez-les toutes les deux semaines pour détecter des signes de migration des cellules tumorales, qui se présentent sous la forme de minuscules masses tumorales EGFP ou mCherry positives loin du site primaire de la genèse tumorale.Isolez ces poissons dans des réservoirs séparés au besoin et étiquetez de manière appropriée pour indiquer les métastases possibles. Après avoir interprété le MYCN hétérozygote chez les poissons LMO1, et lors du tri de leur progéniture, l’expression de l’EGFP MYCN était importante dans les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS un jour après la fécondation. En revanche, l’expression de LMO1 était importante dans les cellules PSNS et les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS.Des masses tumorales fluorescentes positives ont été détectées dans les tissus des organes, éloignés du site tumoral primaire dans le poisson transgénique composé avec surexpression de MYCN et de LMO1, mais pas chez les poissons transgéniques avec l’expression de MYCN seul. La coloration H & E des sections chirurgicales montre que la tumeur primaire est née de la région de la glande interrénale, l’équivalent du poisson zèbre de la glande surrénale humaine qui est le site le plus commun de la maladie primaire chez le patient atteint de neuroblastome. Des masses tumorales éloignées de la glande internatale ont été détectées dans plusieurs régions, y compris la partie distale du rein, l’orbite, les branchies, la rate et la paroi interne de la chambre auriculaire du cœur.La lignée de neuroblastes PSNS des cellules tumorales au niveau de la tumeur primaire et de tous les sites métastatiques a été confirmée. Des quantités significativement amplifiées et une épaisseur accrue de fibres de collagène colorées par PSR ont été trouvées dans les tumeurs MYCN LMO1 par rapport aux tumeurs exprimant MYCN seul. Après avoir utilisé cette procédure, le dépistage de médicaments et le test de nouvelles thérapies anticancéreuses peuvent être appliqués, ce qui peut potentiellement conduire au développement d’agents alternatifs pour prévenir et traiter les cancers métastatiques.

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Découvrez un modèle de poisson-zèbre pour étudier les métastases du neuroblastome par surexpression de MYCN et LMO1. Cette méthode permet l'imagerie in vivo en temps réel de la dissémination tumorale et le criblage de nouvelles thérapies anticancéreuses.

Modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome

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