Microinjection de cicadelle de maïs, Peregrinus maidis, embryons pour l’édition du génome CRISPR / Cas9

À ce jour, CRISPR n’a été utilisé que chez une poignée d’hémiptères. Le protocole décrit ici pourrait aider les chercheurs à appliquer CRISPR et la transformation germinale chez d’autres espèces d’hémiptères. Ce protocole a été développé spécifiquement pour les embryons d’insectes sensibles à la dessiccation.

De nombreuses étapes du protocole pourraient potentiellement améliorer les résultats chez d’autres espèces d’insectes. La capacité de générer des cicadelles transgéniques ouvre la porte à de nouvelles méthodes de lutte, telles que la création d’insectes qui ne peuvent plus transmettre de virus. Cette technique sera révolutionnaire pour étudier la fonction des gènes chez d’autres ravageurs, tels que les thrips des fleurs de l’Ouest.

Nous avons adapté cette technique CRISPR pour les embryons de thrips avec des résultats prometteurs. Nous constatons que la pratique dans ce système est essentielle au succès. Les méthodes présentées ici, lorsqu’elles sont appliquées régulièrement, devraient permettre une utilisation flexible dans divers contextes.

Pour faire une chambre pour contenir les insectes adultes Peregrinus maidis, coupez un trou dans le fond d’une tasse d’une once et collez un écran sur le trou pour l’échange d’air. Pour la sélection d’insectes femelles adultes âgés d’une semaine, aspirez la colonie dans un tube conique de 15 millilitres pendant une heure, avant de refroidir brièvement les insectes sur de la glace. Identifiez les femelles par la présence de l’ovipositeur, qui est généralement plus foncé que le reste de l’abdomen, sur la face ventrale de l’abdomen.

Transférez les femelles dans la tasse au fur et à mesure qu’elles sont collectées. Lorsque 15 femelles ont été sélectionnées, scellez la tasse avec un morceau de film de cire de paraffine de cinq centimètres sur cinq. Appliquez 400 microlitres d’une solution de saccharose à 10% sur le dessus du film et placez un deuxième morceau de film de cinq centimètres sur cinq sur la solution.

Placez la chambre adulte sur un plat de collecte d’œufs avec le côté du film de cire de paraffine plastique en contact direct avec le milieu de ponte et enveloppez toute la chambre de ponte avec une pellicule de plastique sans couvrir les trous d’air. Ensuite, placez la chambre à 25 degrés Celsius avec 70% d’humidité et 14 heures de lumière, 10 heures de cycle d’obscurité. Pour le prélèvement d’embryons, après la période de ponte souhaitée, appliquer une bande de ruban adhésif double face d’un millimètre sur 15 millimètres sur un couvercle de 22 millimètres sur 30 millimètres et placer le couvercle sur le milieu de ponte de la chambre de ponte.

À l’aide d’un pinceau fin et d’un microscope à dissection, déplacer les embryons semi-transparents individuels de la surface de la gélose vers le ruban adhésif double face. Lorsqu’environ 25 embryons ont été sélectionnés, disposer les embryons en forme de banane sur leurs côtés avec les extrémités les plus grandes collées sur la bande. Pour la micro-injection des embryons, placez d’abord le couvercle sur une boîte de Petri de 100 millilitres sur 15 millilitres avec 1% de gélose sous un microscope à dissection à l’intérieur d’un capot humidifié.

Pour vérifier la pression d’injection, placez la pointe d’une aiguille d’injection de quartz dans une goutte d’eau et lancez le cycle d’injection. Après avoir confirmé le réglage de la pression, en s’approchant du côté gauche du couvercle, insérez l’aiguille dans la plus grande extrémité d’un embryon. Livrez la solution d’injection dans l’œuf et retirez rapidement l’aiguille.

Lorsque tous les œufs ont été injectés, placez le couvercle sur la surface d’un nouveau plat de gélose à 1% et placez le plat dans une chambre d’humidité. Après six jours, utilisez de l’eau propre et une brosse fine pour transférer les embryons survivants dans une boîte de Petri de 35 millimètres sur 10 contenant du papier filtre humidifié à l’eau. Scellez la boîte de Petri avec un film de cire de paraffine plastique et placez la chambre d’éclosion dans un incubateur à 25 degrés Celsius.

Après six à huit jours, utilisez un pinceau fin pour transférer les nymphes émergentes du premier stade dans une boîte de Pétri de coupures de feuilles et scellez la boîte avec un film de cire de paraffine plastique. Après 48 heures à 25 degrés Celsius, utilisez une brosse fine pour transférer toutes les nymphes de deux jours dans une cage d’élevage avec des plants de maïs. Si les personnes injectées avec un phénotype visible sont récupérées en nombre suffisant, mettre ces insectes en cage séparément afin de maximiser le rétablissement du caractère cible dans la génération suivante.

Élever les insectes dans les conditions de température et d’humidité appropriées avec des transferts réguliers vers des plants de maïs frais au besoin, et dépister régulièrement la descendance pour les phénotypes prévus, en plaçant les individus présentant le phénotype désiré dans leurs propres cages pour établir des lignées homozygotes. Dans cette analyse représentative, un total de 6 483 œufs ont été prélevés sur un total de 645 femelles en quatre semaines. Les femelles commencent généralement à pondre après deux jours et fournissent la plupart des œufs du quatrième au sixième jour, l’activité de ponte ralentissant au neuvième jour.

L’injection de Cas9 neuf n’affecte pas le développement de P. maidis, car les taux de développement des embryons traités avec un tampon injectable, un tampon d’injection complété par Cas9 et un tampon d’injection complété par Cas9 et trois ARN guides sont similaires. Les taux de hachure pour les contrôles Buffer et Cas9 sont également similaires. Cependant, les taux d’éclosion des individus recevant la combinaison de trois guides sont généralement relativement plus faibles.

Dans cette expérience représentative, sur les 71 individus ayant reçu une injection guidée qui se sont développés, 23 ont montré un certain degré de perte de pigment et neuf ont éclos, ce qui a entraîné un taux d’élimination d’environ 30%. Le mélange à trois guides devrait éliminer environ 180 paires de bases du locus blanc, comme observé dans les produits PCR amplifiés à partir d’ADN génomique isolé d’individus injectés, ainsi que dans les données de séquence associées générées à partir de ces produits. Nous recommandons l’utilisation d’aiguilles biseautées pour minimiser les traumatismes liés à l’injection. Si les embryons semblent fuir après l’injection, examinez les pointes de vos aiguilles pour de meilleurs résultats.

La poursuite de la pratique augmentera la survie de l’embryon. À ce jour, il n’existe aucune publication décrivant la transformation de la lignée germinale chez les hémiptères. Cependant, nous avons utilisé ce protocole pour fabriquer des cicadelles exprimant Cas9.

Dans l’ensemble, la capacité d’effectuer la transformation de la lignée germinale chez les hémiptères ouvre la porte à un large éventail de stratégies de lutte antiparasitaire génétique, réduisant ainsi l’utilisation d’insecticides.