Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

L’utilisation de cellules isolées de valve de souris est essentielle pour étudier la voie de signalisation menant à la calcification de valve dans l’utilisation des cellules génétiquement modifiées de souris transgéniques. La digestion en deux étapes est une méthode rapide et efficace. La partie la plus difficile de ce protocole est l’isolement de la valve aortique des souris de huit semaines.

Il est préférable de pratiquer sur des souris plus âgées pour mieux visualiser la valve aortique. Avant de commencer l’expérience, nettoyez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux et l’espace de travail avec de l’éthanol à 70% et autoclavez les instruments chirurgicaux pendant 30 minutes. Lorsque la configuration initiale est prête, commencez par nettoyer la poitrine et la région de l’abdomen d’une souris euthanasiée de huit semaines à l’aide d’éthanol.

À l’aide de ciseaux, ouvrez l’abdomen et la poitrine de la souris, puis coupez entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche avec de petits ciseaux chirurgicaux. Retirez le sang du cœur en perfusant 10 millilitres de PBS froid et coupez le cœur, en gardant trois millimètres de l’aorte ascendante. Sous stéréomicroscope, disséquer la valve aortique en coupant le cœur horizontalement au milieu des ventricules et en coupant le ventricule gauche vers l’aorte, puis disséquer soigneusement la valve aortique.

Regroupez les valves dans un petit plat de culture de tissus de 35 millimètres. Laver les valves isolées dans un plat de culture cellulaire de 75 millilitres avec cinq millilitres de HEPES froid 10 millimolaires fraîchement préparés complétés par des antibiotiques et incuber dans cinq millilitres de collagénase de type un pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec une secousse continue. Après incubation, centrifuger le tube pendant cinq minutes, à 150 fois G et laver la pastille une fois avec deux millilitres de 10 millilitres d’HEPES 10 millimolaires avec vortex à grande vitesse pendant 30 secondes.

Recueillir la suspension résultante du tube dans un plat de culture de 35 millimètres et utiliser une pince à épiler mince pour transférer soigneusement les fragments de tissu dans un tube frais. Incuber ensuite le culot dans un tube de 15 millilitres avec cinq millilitres de collagénase de type un à 37 degrés Celsius sous agitation continue pendant 35 minutes. Séparer les cellules en les ressuscitant à l’aide d’une pipette d’un millilitre et centrifuger à 150 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Nettoyez les cellules deux fois en ressuscitant la pastille séparée dans deux millilitres de DMEM complet et en centrifugant à 150 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Pour le placage, ressusciter le culot dans un millilitre de milieu complet et l’ajouter à un puits d’un plat de culture cellulaire de six puits dans une quantité minimale de milieu. Gardez les plaques intactes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Après trois jours d’incubation, confirmer la croissance près des débris tissulaires en observant les cellules au microscope. Une fois que 1 000 cellules sont visibles, retirez soigneusement les débris tissulaires à l’aide d’une pince autoclavée et changez le milieu. Trypsiniser les cellules après avoir atteint 70% de confluence et les transférer dans un plat de culture de tissu de 75 millilitres.

Avant de commencer le test, nettoyez la hotte de biosécurité avec de l’éthanol à 70% et réchauffez le milieu DMEM à 37 degrés Celsius. Ensuite, ensemencez 100 000 cellules par condition dans six plaques de puits en DMEM complet et en culture à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, remplacez le milieu surnageant par le milieu calcifiant et incuber les cellules pendant sept jours à 37 degrés Celsius, en remplaçant le milieu le troisième jour.

Après sept jours, mesurer la concentration de calcium dans une plaque de 96 puits en utilisant le réactif Arsenazo III et en enregistrant l’absorbance à 650 nanomètres. Dans l’analyse représentative, de divers phénotypes de cellules de valve ont été identifiés avec la souillure immunofluorescente après trois à cinq jours de culture. Le VImentin et l’alpha SMA exprimés par vic de souris, les marqueurs significatifs des cellules de valve.

En plus, la souillure immunofluorescente CD31 n’a vérifié aucune contamination des cellules endothéliales dans la culture de VIC. La culture de VIC avec le milieu calcifiant riche en phosphate stimule une calcification en cellules, plus loin confirmée avec la souillure positive rouge pour des noeuds de calcium. Le protocole est basé sur un pool de trois à cinq valves de différentes souris.

L’utilisation de maté de litière et de trois répétitions biologiques différentes est importante pour valider les résultats. L’utilisation de cellules valvulaires de souris est essentielle pour comprendre la voie moléculaire menant à la sténose aortique en isolant les cellules des souris transgéniques. Ce protocole a été employé précédemment pour étudier l’implication de la voie au récepteur dans la régression minérale de la valve aortique calcifiée.