Name: Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie en haute résolution pour étudier les agrégats de Pseudomonas aeruginosa dans un milieu de mucus synthétique. Cette approche permet d'évaluer l'efficacité des traitements antimicrobiens sur les bactéries résistantes aux antibiotiques.

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S.E.D est soutenu par des fonds de démarrage fournis par le Département de médecine moléculaire, l’Université de Floride du Sud, ainsi que par une subvention de recherche CFF (DARCH19G0), le N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) et l’USF Institute on Microbiomes. Nous remercions le laboratoire Whiteley pour sa collaboration continue impliquant des ensembles de données liés à ce manuscrit. Nous remercions le Dr Charles Szekeres d’avoir facilité le tri FACS. Les figures ont été créées par A.D.G et S.E.D à l’aide de Biorender.com.

1. Préparer un milieu synthétique de fibrose kystique (SCFM2)
NOTE: La préparation de SCFM2 comprend trois étapes principales décrites ci-dessous (Figure 2). Pour plus de détails et de références, voir9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> Figure 2: Préparation et inoculation du milieu SCFM2. (A) La base tamponnée est préparée à l’aide des sels et des acides aminés énumérés dans les tableaux 1 et 2. La base tamponnée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 30 jours, mais doit être protégée de l’exposition à la lumière. (B) La mucine et l’ADN sont ajoutés à une aliquote de base tamponnée et dissous en solution pendant la nuit à 4 °C. (C) Des lipides et des stocks supplémentaires sont ajoutés à la solution de nuit et incubés à 37 °C avec agitation à 250 tr/min pendant 20 min. Le SFCM2 est ensuite inoculé avec des cellules lavées en phase logarithmique à un OD600 = 0,05. Abréviations : SCFM2 = milieu d’expectorations synthétiques de la fibrose kystique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Stérilisation de la mucine porcine<ol>
<li>Préparer la mucine stérile à une concentration finale de 5 mg/mL dans scFM2. Par exemple, pour un volume de 5 mL de SCFM2, peser 25 mg de mucine de type II dans une boîte de Petri stérile et placer dans un stérilisateur ultraviolet (UV) pendant 4 h, en agitant doucement toutes les heures.</li>
		<li>Après 4 h, transférer la mucine traitée aux UV dans des tubes autoclavés de 1,7 mL dans des conditions stériles et conserver à -20 °C.</li>
		<li>Pour confirmer la stérilisation complète, dissoudre un échantillon de mucine dans un liquide stérile, tel que de l’eau ou du bouillon Luria Bertani (LB), et observer au microscope. REMARQUE: La mucine stérilisée peut être conservée à -20 ° C jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la base tamponnée<ol>
<li>Préparer des solutions de sel et d’acides aminés en ajoutant les quantités appropriées en poids à l’eau désionisée indiquée dans le tableau 1. Filtrer-stériliser toutes les solutions mères à l’aide d’un filtre de 0,22 μm, envelopper dans du papier d’aluminium pour protéger de la dégradation par la lumière et conserver à 4 °C jusqu’à un mois.</li>
		<li>Préparer la base tamponnée en combinant 190 mL d’eau désionisée avec des solutions d’acides aminés et de sels par volumes indiqués dans le tableau 1. Ajustez la solution à un pH de 6,8 et augmentez jusqu’à un volume final de 250 mL. Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 30 jours.</li>
		<li>La veille de l’expérience, aliquoter la quantité souhaitée de base tamponnée dans une fiole de culture en verre et ajouter de la mucine (5 mg/mL comme décrit à l’étape 1.1.1) et de l’ADN purifié de spermatozoïdes de saumon (0,6 mg/mL). Agiter doucement, envelopper dans du papier d’aluminium et laisser agir à 4 °C pendant la nuit pour permettre à la mucine et à l’ADN de se dissoudre en solution. REMARQUE: Les aliquotes d’ADN de sperme de saumon doivent être décongelées sur de la glace, tourbillonnées et ajoutées à la base tamponnée et à la mucine. Les solutions stock de tryptophane, d’asparagine et de tyrosine doivent être préparées dans des solutions de NaOH (voir le tableau 1 pour les concentrations) au lieu d’eau désionisée. Gardez la base tamponnée et toutes les solutions de base enveloppées dans du papier d’aluminium pour les protéger de l’exposition à la lumière. La plupart des actions seront stables jusqu’à un mois. Les stocks qui se décolorent ne doivent pas être utilisés et doivent être remplacés avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajout de stocks supplémentaires<ol>
<li>Le jour de l’expérience, ajouter les stocks énumérés dans le tableau 2 à la base tamponnée contenant de la mucine et de l’ADN. REMARQUE: Préparez une solution fraîche de FeSO4 le jour de l’expérience, mais tous les autres stocks peuvent être préparés à l’avance et conservés pendant 30 jours à 4 ° C. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) contient du chloroforme. Manipuler avec prudence et ne pas utiliser près des flammes nues. Après l’ajout de DOPC, incuber SCFM2 à 37 °C en agitant (250 tr/min) pendant au moins 20 min (pour une culture de 5 mL). Cette période d’incubation permet au chloroforme du DOPC de s’évaporer. La fiole ne doit pas être étanche à l’air; au lieu de cela, couvrez l’ouverture de la fiole lâchement avec du papier d’aluminium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Évaluation en temps réel de la tolérance aux antimicrobiens dans les agrégats bactériens
<ol><li>Préparer des cultures du jour au lendemain<ol>
<li>La veille de l’expérience, inoculer 5 mL de bouillon LB avec plusieurs colonies de Pa PAO1-pMRP9-113 à partir d’une plaque de gélose LB contenant un antibiotique (carbénicilline 300 μg/mL). Cultiver toute la nuit à 37 °C avec agitation à 250 tr/min. REMARQUE: Cultivez des cultures pendant la nuit avec l’ajout d’antibiotiques nécessaires à la sélection des plasmides requis (ici, le plasmide d’expression de la protéine fluorescente verte (GFP), pMRP9-1). Notez que les cellules Pa doivent être lavées avant que SCFM2 ne soit inoculé. Lb peut être substitué à d’autres milieux de laboratoire riches pour les cultures de nuit. Tous les isolats bactériens doivent être manipulés en utilisant les lignes directrices BSL-2 appropriées tout au long de ce protocole.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculer SCFM2<ol>
<li>Le jour de l’expérience, diluer pendant la nuit des cultures de Pa 1:10 (culture : milieu liquide) en inoculant 500 μL dans 5 mL de bouillon LB frais. Cultiver les cellules jusqu’à la phase logarithmique (60-90 min) à 37 °C avec agitation à 250 tr/min.</li>
		<li>Cultures de phase log centrifugeuse à 10 000 × g pendant 5 min. Laver les cellules en retirant le surnageant et en le réapposant dans 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate stérilisée par filtre (PBS, pH 7,0). Répétez deux fois et resuspendez la pastille dans un volume final de 1 mL de PBS.</li>
		<li>Mesurer l’absorbance des cellules lavées à l’aide d’un spectrophotomètre à 600 nm (OD600), et calculer le volume de culture requis pour un OD600 de départ de 0,05 dans 5 mL de SCFM2. Inoculez pa dans le SCFM2 et vortexez doucement pour répartir les cellules partout. Pipetter 1 mL du SCFM2 inoculé dans chaque chambre d’un fond en verre à 4 puits, parabole optique, et incuber pendant 4 h statiquement à 37 °C. REMARQUE: Le temps de doublement des cultures de Pa dépend de la souche et de la disponibilité de l’oxygène. Dans SCFM2, dans les conditions décrites ici, le temps de doublement de Pa est d’environ 1,4 h10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Visualisation des agrégats pendant le traitement antibiotique avec la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)
REMARQUE: Cette section décrit l’utilisation du microscope à balayage laser confocal et du logiciel de capture d’image pour l’imagerie des agrégats Pa dans SCFM2. L’objectif est d’observer et de caractériser la biomasse bactérienne restante (tolérante) après traitement aux antibiotiques. Les étapes décrites peuvent être effectuées avec succès sur d’autres microscopes confocaux, bien que le manuel d’utilisation de l’instrument doive être référencé pour des conseils spécifiques.
<ol><li>Images de cultures Pa utilisant une chambre chauffée ou une microplaque chauffée montée sur l’étage du microscope pour maintenir une température ambiante de 37 °C. Démarrez le module d’incubation au moins 2 heures avant le début de l’expérience pour permettre à tous les appareils d’atteindre la température souhaitée et de réduire l’expansion et les mouvements pendant la collecte des données.</li>
	<li>Après 4 h, transférer les cultures SCFM2 contenant des cellules Pa à l’étage chauffé du microscope. Désigner 3 puits sur 4 comme répliques techniques pour le traitement antibiotique, et considérer le 4e puits comme un contrôle sans traitement, contenant uniquement des cellules Pa dans SCFM2, sans antibiotique. Identifiez les agrégats à l’aide de la microscopie à fond clair dans l’onglet Localiser avant toute excitation des rapporteurs fluorescents. Définissez une zone d’imagerie dans chaque puits et stockez sa position (coordonnées x-y-z) à l’aide du module Positions du logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Utilisez un objectif d’immersion dans l’huile 63x pour visualiser des cultures Pa contenant le plasmide d’expression GFP pMRP9-1 dans SCFM2 avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 509 nm. Prenez des images à l’aide de l’option z-stack dans le module Acquisition à des intervalles de 1 μm (total de 60 tranches). Utilisez le module de moyenne linéaire pour réduire la fluorescence d’arrière-plan dans le canal GFP dans le volume total des images z-stack de 60 μm (1 093,5 mm3). Prenez des images de contrôle de SCFM2 non ininoculé en utilisant des paramètres identiques pour déterminer la fluorescence d’arrière-plan pour l’analyse d’image. REMARQUE: Les images sont acquises en produisant des images de pile z 8 bits de 512 pixels x 512 pixels (0,26 μm x 0,26 pixels) à 60 μm de la base du couvercle.</li>
	<li>Utilisez l’option de série chronologique du logiciel d’imagerie pour capturer 60 tranches à chaque position (puits) à des intervalles de 15 minutes sur une période de 18 h. Utilisez la stratégie de mise au point définie dans le logiciel pour stocker un plan focal pour chaque position, qui est renvoyé à chaque point temporel tout au long de l’expérience.</li>
	<li>Après un total de 4,5 h d’incubation, imagez chaque position en utilisant les paramètres ci-dessus pour déterminer la biomasse agrégée dans chacun des quatre puits avant l’ajout d’antibiotique.</li>
	<li>Après 6 h d’incubation totale, ajouter un antibiotique à une concentration minimale inhibitrice (CMI) inférieure de 2 fois à chaque réplique. Pipettez directement et doucement au milieu du puits, juste en dessous de l’interphase air-liquide. Maintenir toutes les cultures dans la chambre confocale chauffée. REMARQUE: Ici, le sulfate de colistine à une concentration de 140 μg / mL a été utilisé.</li>
	<li>Commencez l’imagerie post-traitement antibiotique en cliquant sur l’option Démarrer l’expérience dans le programme d’imagerie. REMARQUE: La concentration d’antibiotique utilisée dépend de l’antibiotique, de l’isolat de Pa et du fait que l’utilisateur souhaite examiner les effets de destruction ou de tolérance. Cette expérience utilise une dose unique. Des doses supplémentaires peuvent être ajoutées sans perturber les cultures si nécessaire.</li>
</ol>4. Coloration à l’iodure de propidium des agrégats de Pa
REMARQUE: L’iodure de propidium (IP) est couramment utilisé comme réactif de coloration pour identifier les cellules bactériennes non viables (mortes) en culture. Ici, il est utilisé pour identifier les agrégats sensibles au traitement antibiotique appliqué à la section 3. Tout au long de ce protocole, l’expression et la détection de la GFP dans les cellules Pa sont utilisées comme principal indicateur de viabilité cellulaire. Cette dernière étape permet d’utiliser à nouveau l’imagerie confocale pour identifier le positionnement spatial des agrégats vivants/morts les uns par rapport aux autres. De plus, les agrégats sont identifiés comme vivants/morts pour un tri cellulaire plus approfondi en aval dans la section 5.
<ol><li>Après 18 h, ajouter PI à chaque puits de la parabole optique inférieure à quatre chambres contenant des cultures SCFM2. Suivez les instructions du fabricant pour le volume de PI et le temps d’incubation(par exemple,~2 μL par mL de culture, ~20-30 min).</li>
</ol>5. Isoler les cellules vivantes des agrégats à l’aide d’une approche FACS
REMARQUE: FACS présente une plate-forme puissante pour trier et isoler des groupes de cellules selon un phénotype marqué par fluorescence. Ici, le FACS est utilisé pour isoler des agrégats vivants (tolérants aux antibiotiques) à partir d’agrégats non viables.
<ol><li>Après coloration avec de l’iodure de propidium, retirer les cultures de l’incubation et les transférer dans un instrument FACS dans un récipient isotherme pour maintenir 37 ° C.</li>
	<li>Exécutez 1 mL d’aliquotes de SCFM2 contenant des agrégats de Pa au débit le plus bas. REMARQUE : Chaque aliquote contiendra environ 15 000 agrégats.</li>
	<li>Pour détecter la GFP, illuminez les cellules avec un laser de 488 nm et enregistrez la hauteur du signal fluorescent à 530/30 nm. Visualisez la coloration PI par excitation avec un laser de 561 nm et enregistrez la hauteur du signal fluorescent à 610/20 nm. Effectuez le tri à l’aide d’une buse de 70 u. REMARQUE : Les agrégats triés peuvent être regroupés de plusieurs manières en fonction de l’application de l’utilisateur. Dans ce cas, FACS a été utilisé pour trier les agrégats de Pa viables pour le séquençage de l’ARN en aval. Les applications alternatives sont discutées ci-dessous.</li>
</ol>6. Analyse d’images
REMARQUE: La microscopie time-lapse génère de grandes quantités de données. Une expérience de 18 heures pour l’observation des agrégats Pa dans SCFM2 identifie environ 50 000 agrégats au fil du temps, qui ont le potentiel d’être caractérisés pour le volume et le positionnement spatial. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour quantifier la dynamique agrégée dans SCFM2 :
<ol><li>Pour les études agrégées dans SCFM2, quantifier la fluorescence GFP de fond en créant un histogramme des comptes dans le canal GFP qui est produit pour SCFM2 et SCFM2 non inoculés avec la souche Pa PAO1 portant pMRP9-1. Pour vous assurer que les voxels GFP détectés sont en corrélation avec la biomasse Pa, définissez un voxel GFP+ comme ≥1,5 fois la valeur de fond GFP. REMARQUE: La fluorescence de fond est définie comme la valeur de voxel la plus élevée de trois positions choisies au hasard, moyenne. Les nombres d’arrière-plans sont, en tant que mesure standard, soustraits de tous les pixels des images expérimentales par le logiciel d’analyse d’images.</li>
	<li>Après soustraction d’arrière-plan dans le module Surpass, produisez des isosurfaces pour tous les voxels restants.</li>
	<li>Pour détecter des agrégats individuels, activez l’option Fractionner les objets et définissez les agrégats comme des objets avec des volumes de ≥5 μm3. Utilisez le module Vantage du logiciel d’analyse d’images pour calculer le volume, x-y-z et la somme des voxels GFP pour chaque objet individuel. Exportez ces données vers une plateforme statistique externe. REMARQUE: Certains logiciels d’analyse d’images permettent l’exportation de plusieurs phentoypes quantitatifs à la fois, ce qui permet de calculer des corrélations.</li>
	<li>Filtrer les données exportées du module Vantage par taille pour s’assurer qu’il ne reste aucun objet de &lt;0,5 μm3 (biomasse dispersée). Pour chaque objet individuel dans l’image, calculez la distance par rapport à d’autres objets (agrégats) à l’aide du module Vantage du logiciel d’analyse d’images ou manuellement avec l’équation suivante. d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1)</li>
	<li>Utilisez les calculs SUM et MOYENNE pour trouver la biomasse totale et le volume agrégé moyen. Alternativement, exporter les données vers d’autres plates-formes ou scripts statistiques, par exemple,la distribution des agrégats à travers la biomasse comme discuté dans les résultats représentatifs (script non publié en collaboration avec le laboratoire Whiteley, Georgia Institute of Technology).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Ce travail a introduit des méthodologies qui peuvent être combinées pour étudier les populations bactériennes agrégées en présence et en l’absence de traitement antibiotique. Le CLSM haute résolution permet de visualiser les changements dans la biomasse agrégée et l’orientation structurelle des agrégats en temps réel lorsqu’ils sont exposés à des antibiotiques. En outre, les caractéristiques physiques et structurelles de la biomasse qui restent après le traitement avec des antibiotiques peuvent être quantifiées, dans le ...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un agent pathogène opportuniste qui établit des infections chroniques chez les personnes immunodéprimées. Pour les personnes atteintes de la maladie génétique de la fibrose kystique (FK), ces infections peuvent s’étendre sur toute une vie. La mucoviscidose provoque l’accumulation d’expectorations visqueuses et riches en nutriments dans les voies respiratoires, qui deviennent colonisées par une variété d’agents pathogènes microbiens au fil du temps. Le Pa est l’un des agents pathogènes les plus répandus de la FK, colonisant les voies respiratoires dans la petite enfance et établissant des infections difficiles à traiter1. L’AP demeure un problème clinique important et est considérée comme l’une des principales causes de mortalité chez les personnes atteintes de mucoviscidose, malgré l’amélioration des schémas thérapeutiques au cours des dernières années2,3. Ce phénotype persistance et l’augmentation de la tolérance aux antibiotiques ont valu à Pa une place dans un groupe d’agents pathogènes identifiés par les Centers for Disease Control (CDC) et l’Organisation mondiale de la santé (OMS) comme des priorités de recherche pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques - les agents pathogènes ESKAPE4.
Comme d’autres agents pathogènes ESKAPE, la résistance aux antibiotiques acquise est courante dans le Pa,mais il existe également de nombreuses propriétés intrinsèques qui contribuent à la tolérance aux antimicrobiens du Pa. Parmi ceux-ci se trouve la capacité de Pa à former des agrégats-grappes très denses d’environ 10 à 1 000 cellules, qui peuvent être observées dans de multiples infections, y compris les expectorations des patients atteints de mucoviscidose5,6. Semblables à Pa étudiés dans d’autres systèmes de biofilm, les agrégats de Pa présentent des phénotypes cliniquement pertinents tels qu’une résistance accrue aux antibiotiques et l’activation de la communication cellule-cellule (quorum sensing (QS)). Par exemple, il a été démontré que les agrégats de Pa utilisent des comportements régulés par QS pour lutter contre d’autres microbes et tolèrent des traitements antimicrobiens tels que la production de pyocyanine7. La capacité d’étudier de tels comportements offre un aperçu passionnant des écosystèmes bactériens dans un environnement similaire à celui dans lequel ils existent dans le corps humain.
L’un des plus grands défis de l’étude de la façon dont les agrégats de Pa réagissent à l’environnement changeant des expectorations est le manque de systèmes pertinents et robustes sur le plan nutritionnel qui favorisent la formation d’agrégats. Une grande partie de ce que l’on sait sur le Pa a été découverte à l’aide de systèmes in vitro dans lesquels les cellules se développent planctoniquement ou dans une architecture caractéristique de « champignon » attachée à la surface qui n’a pas été observée in vivo8. Alors que les modèles classiques de croissance du biofilm, tels que les cellules d’écoulement ou la gélose solide, ont fourni des connaissances approfondies et précieuses sur les comportements bactériens et les mécanismes de tolérance aux antibiotiques, ces résultats ne se traduisent pas toujours in vivo. De nombreux modèles in vitro ont une capacité limitée à imiter l’environnement de croissance du site d’infection humaine, ce qui nécessite des études in vivo coûteuses. À leur tour, de nombreux modèles in vivo n’ont pas la flexibilité et la résolution offertes par les techniques in vitro. 
Les expectorations synthétiques de fibrose kystique (SCFM2) sont conçues pour fournir un environnement de croissance de l’AP similaire à celui ressenti lors d’une infection chronique dans le poumon de la FK. SCFM2 comprend des sources nutritionnelles identifiées dans la sputa de FK expectorée en plus de la mucine, des lipides et de l’ADN. La croissance du Pa dans SCFM2 nécessite un ensemble de gènes presque identique à celui requis pour la croissance des expectorations réelles et soutient la formation naturelle d’agrégats de Pa 9,10. Après l’inoculation, les cellules planctoniques forment des agrégats dont la taille augmente par expansion. Les cellules individuelles (appelées migrants) sont libérées des agrégats, migrent vers des zones non colonisées et forment de nouveaux agrégats10. Cette histoire de vie peut être observée à l’aide de CLSM et de l’analyse d’images à la résolution d’une seule cellule. Les agrégats de Pa formés dans SCFM2 sont de tailles similaires à celles observées dans le poumon CF10. Ce modèle permet l’observation de multiples agrégats de taille variable en temps réel et en trois dimensions à l’échelle du micron. La microscopie en accéléré permet de suivre des milliers (~ 50 000) d’agrégats en une seule expérience. L’utilisation d’un logiciel d’analyse d’images permet de quantifier les phénotypes agrégés à partir de micrographies, y compris le volume agrégé, la surface et la position en trois dimensions au 0,1 μm le plus proche, à la fois au niveau de l’agrégat individuel et au niveau de la population. Avoir la capacité de regrouper les agrégats par phénotype et position permet la différenciation des agrégats à différents stades de développement avec précision, ainsi que leur réponse à un microenvironnement changeant6,11.
L’application de SCFM2 pour étudier les agrégats de Pa dans des essais à faible volume et à haut débit en fait un modèle flexible et rentable. En tant que milieu défini, SCFM2 offre uniformité et reproductibilité sur plusieurs plates-formes, fournissant une méthode nutritionnellement et physiquement pertinente pour étudier les agrégats de Pa in vitro9. Les applications incluent son utilisation en combinaison avec CLSM pour observer l’organisation spatiale et la tolérance aux antibiotiques à haute résolution (comme décrit dans ce document sur les méthodes). La capacité d’effectuer des expériences qui fournissent des données en temps réel à l’échelle du micron permet d’étudier les interactions intra-espèces et inter-espèces telles qu’elles peuvent se produire in vivo. Par exemple, SCFM2 a déjà été utilisé pour étudier la dynamique spatiale de la communication cellule-cellule dans des populations agrégées via un réseau de systèmes utilisés par Pa pour réguler plusieurs gènes qui contribuent à la virulence et à la pathogenèse6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figure 1: Représentation graphique des principales étapes expérimentales. (A) SCFM2 est inoculé avec des cellules Pa et autorisé à former des agrégats dans une boîte de culture à fond de verre. (B) Les agrégats sont transférés au microscope confocal et un antibiotique est ajouté. Trois répliques techniques (chambres 1 à 3) et un puits de contrôle (4) de SCFM2 inoculé sans traitement antibiotique sont représentés. Les agrégats sont imagés à l’aide de CLSM au cours de 18 h. (C) Après l’imagerie initiale de 18 heures, les agrégats sont traités avec de l’iodure de propidium pour visualiser les cellules mortes et imagés à l’aide de CLSM (D) Les agrégats avec le phénotype souhaité sont séparés de SCFM2 à l’aide de FACS. Abréviations : SCFM2 = milieu d’expectorations synthétiques de fibrose kystique; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopie confocale à balayage laser; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ici, l’utilité de SCFM2 pour étudier l’impact du traitement antibiotique sur les agrégats pa en temps réel est démontrée, suivie de l’utilisation d’une approche de tri cellulaire pour isoler des populations d’agrégats avec des phénotypes distincts pour une analyse en aval(Figure 1).

<table><tbody><tr><td>Acides</td><td></td><td></td><td></td>aminés</tr><tr><td>Alanine</td><td>Acros Organics</td><td>56-41-7</td><td></td></tr><tr><td>Arginine HCl</td><td>MP</td><td>1119-34-2</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Acros Organics</td><td>56-84-8</td><td>Préparé en 0,5 M NaOH</td></tr><tr><td>Cystine HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06328</td><td></td></tr><tr><td>Acide glutamique HCl</td><td>Acros Organics</td><td>138-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Acros Organics</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Histidine HCl H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17627</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Acros Organics</td><td>73-32-5</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12311</td><td></td></tr><tr><td>Lysine HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62099</td><td></td></tr><tr><td>Méthionine</td><td>Acros Organics</td><td>63-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Ornithine HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Phénylalanine</td><td>Acros Organics</td><td>63-91-2</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10199</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11179</td><td></td></tr><tr><td>Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophane</td><td>Acros Organics</td><td>73-22-3</td><td>Préparé en 0,2 m NaOH</td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11141</td><td>Préparé en 1,0 m NaOH</td></tr><tr><td>Valine</td><td>Acros</td><td>Organics 72-18-4</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Alfa Aesar</td><td>J6194903</td><td></td></tr><tr><td>Stocks</td><td></td><td></td><td></td>du jour</tr><tr><td>CaCl2 * 2H2O</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-glucose)</td><td>Fisher Chemical</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td><td>4235-95-4</td><td>agiter 15-20 min à 37 &deg ; C pour évaporer le chloroforme</td></tr><tr><td>FeSO4 * 7H2O</td><td>Acros Organics</td><td>7782-63-0</td><td>ce stock équivaut à 1 mg/mL, DOIT faire de</td></tr><tr><td>l’acide L-lactique</td> frais <td>Alfa Aesar</td><td>L13242</td><td>pH stock à 7 avec NaOH</td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylglucosamine</td><td>&nbsp ; TCI</td><td>A0092</td><td></td></tr><tr><td>Solides</td><td></td><td></td><td></td>préparés</tr><tr><td>Mucine</td><td>porcine Sigma</td><td>M1778-100G</td><td>Stérilisation UV</td></tr><tr><td>Spermatozoïde de saumon ADN</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Teinture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66764MC</td><td></td></tr><tr><td>Sels K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2SO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13975</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64189</td><td>ajouter le solide directement à la base tamponnée</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Acros Organics</td><td>7757-79-1</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td>ajouter le solide directement à la base tamponnée</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td>ajouter le solide directement sur la base tamponnée</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>RPI</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>RPI</td><td>S23120-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Acros Organics</td><td>12125-02-9</td><td>ajouter du solide directement à la base tampon</td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques (15 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques (50 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture avec bouchon d’air</td><td>Olympus plastics</td><td>21-129</td><td></td></tr><tr><td>Plat à quatre chambres à fond de verre de 35 mm</td><td>CellVis</td><td>NC0600518</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) bouillon</td><td>Genessee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (p200)</td><td>Olympus plastics</td><td>23-150RL</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (p1000)</td><td>Olympus plastics</td><td>23-165RL</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (5 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (25 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (50 mL)</td><td>Plastiques Olympus</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultrapure (sans RNase/DNase) ; eau nanopure</td><td>Genessee Scientific</td><td>18-194</td><td>Eau nanopure utilisée pour la préparation des solutions du tableau 1</td></tr><tr><td>Seringues (10 mL)</td><td>BD</td><td>794412</td><td></td></tr><tr><td>Seringues (50 mL)</td><td>Filtre</td> à seringue BD <td>309653</td><td></td></tr><tr><td>0,22 mm PES</td><td></td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>PS cuvette semi-mico</td><td>Olympus plastics</td><td>91-408</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Pour préparer les figurines</td></tr><tr><td>FacsDiva6.1.3</td><td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>version 9.6</td></tr><tr><td>Zen Noir</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FacsAriallu</td><td>Becton Dickinson, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à pseudomonas aeruginosa

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est l’un des agents pathogènes opportunistes les plus courants associés à la fibrose kystique (FK). Une fois la colonisation pa établie, une grande partie des bactéries infectieuses forment des biofilms dans les expectorations des voies respiratoires. Il a été démontré que les biofilms de Pa isolés des expectorations de la FK se développent en petits agrégats denses d’environ 10 à 1 000 cellules qui sont organisés spatialement et présentent des phénotypes cliniquement pertinents tels que la tolérance aux antimicrobiens. L’un des plus grands défis de l’étude de la façon dont les agrégats de Pa réagissent à l’environnement changeant des expectorations est le manque de systèmes pertinents et robustes sur le plan nutritionnel qui favorisent la formation d’agrégats. À l’aide d’un milieu synthétique d’expectorations CF (SCFM2), l’histoire de vie des agrégats de Pa peut être observée à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et de l’analyse d’images à la résolution d’une seule cellule. Ce système in vitro permet l’observation de milliers d’agrégats de taille variable en temps réel, en trois dimensions et à l’échelle du micron. Au niveau individuel et au niveau de la population, la capacité de regrouper les agrégats par phénotype et par position facilite l’observation des agrégats à différents stades de développement et leur réponse aux changements dans le microenvironnement, tels que le traitement antibiotique, à différencier avec précision.

Ce travail détaille les méthodes permettant d’observer les agrégats de Pa à haute résolution et dans un environnement similaire à celui de l’infection chronique du poumon CF9,10,12. SCFM2 fournit un système in vitro qui favorise l’agrégation naturelle des cellules Pa dans des tailles similaires à celles observées lors de l’infection réelle10. L’adaptabilité de SCFM2 en tant que ...

Les expectorations synthétiques de la fibrose kystique (SCFM2) peuvent être utilisées en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et le tri cellulaire activé par fluorescence pour observer les agrégats bactériens à haute résolution. Cet article détaille les méthodes permettant d’évaluer les populations agrégées pendant le traitement antimicrobien en tant que plate-forme pour de futures études.

Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Notre protocole nous permet d’étudier les bactéries résistantes aux antibiotiques dans un environnement nutritionnel et physique similaire à la façon dont elles existent probablement in vivo. L’un des plus grands avantages de cette technique est la capacité de capturer des images haute résolution et des données phénotypiques de bactéries dans des tailles de population pertinentes pour l’infection. C’est des agrégats d’environ 10 à 1 000 cellules.Alexa Gannon, une assistante de recherche diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, stérilisez le milieu contenant de la mucine sous la lumière ultraviolette pendant quatre heures. Transférer la mucine traitée aux UV dans des tubes stériles de 1,7 millilitre dans des conditions stériles et stocker les tubes à moins 20 degrés Celsius.Après avoir préparé la base tamponnée, ajoutez la solution stock de mucine dans la base tamponnée contenant de l’ADN comme décrit dans le manuscrit textuel. La veille de l’expérience, inoculez cinq millilitres de bouillon LB avec plusieurs colonies de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 à partir d’un antibiotique contenant une plaque de gélose LB et culturez la bactérie pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une agitation à 250 tours par minute. Le lendemain matin, au moins deux heures avant le début de l’expérience, allumez le microscope à balayage laser confocal et ouvrez le module d’incubation dans le logiciel d’imagerie associé.Diluer 500 microlitres de la culture dans cinq millilitres de bouillon LB frais et incuber la suspension bactérienne à 37 degrés Celsius et 250 tours par minute pendant 60 à 90 minutes. Lorsque les bactéries sont entrées dans la phase logarithmique, a granuler les cellules bactériennes par centrifugation et laver les cellules trois fois avec du PBS stérilisé par filtre. Après le dernier lavage, resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS.Mesurer l’absorbance de la suspension cellulaire bactérienne à 600 nanomètres pour déterminer le volume de culture requis pour une densité optique de 0,05 dans cinq millilitres d’expectorations synthétiques de fibrose kystique milieu deux. Inoculer doucement le volume calculé de suspension de cellules bactériennes dans le milieu et le vortex avant d’ajouter un millilitre de cellules à chaque chambre d’une boîte de culture optique à quatre chambres, puis incuber les bactéries pendant quatre heures dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius. Pour imager les agrégats de Pseudomonas aeruginosa au microscope confocal à balayage laser, à la fin de l’incubation, désignez trois puits de la plaque de culture comme réplique le traitement antibiotique et un puits comme contrôle sans traitement et placez la plaque sur la scène chauffée dans le microscope.Sélectionnez un objectif d’immersion dans l’huile 63X et ouvrez la languette de localisation pour identifier les agrégats bactériens dans le champ lumineux. Définissez une zone d’imagerie dans chaque puits et utilisez le module positions pour stocker la position de la zone. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 509 nanomètres.Dans le module d’acquisition, sélectionnez l’option Z-stack pour acquérir les images et utilisez le module de moyenne linéaire pour réduire la fluorescence d’arrière-plan dans le canal GFP dans le volume total des images Z-stack. Définissez l’option de série chronologique pour capturer 60 tranches dans chaque puits à des intervalles de 15 minutes pendant 18 heures et utilisez la stratégie de mise au point définie pour stocker un plan focal pour chaque position qui sera ré-imagé à chaque point temporel tout au long de l’expérience. 4-1/2 heures après la mise en place de l’expérience d’imagerie, imagez chaque position pour déterminer la biomasse agrégée dans chacun des quatre puits avant l’ajout de l’antibiotique.Après six heures, ajoutez doucement un antibiotique à deux fois en dessous de la concentration minimale inhibitrice au milieu de chaque puits, soufflez simplement l’interface air liquide et cliquez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’imagerie post-traitement antibiotique. Pour isoler les cellules vivantes, à la fin de la période d’imagerie de 18 heures, étiqueter les bactéries dans chaque puits avec le volume approprié d’iodure de propidium selon les recommandations du fabricant. À la fin de l’incubation, utilisez un récipient isolé pour transférer la plaque au cytomètre en flux et réglez le cytomètre pour détecter la GFP et l’iodure de propidium à l’aide d’une buse de 70 microns, puis exécutez un millilitre d’aliquotes de chaque surnageant de culture au débit le plus bas pour trier les agrégats viables de Pseudomonas aeruginosa négatifs à l’iodure de propidium positifs et non viables.Pour quantifier la dynamique agrégée, chargez les images dans un logiciel d’analyse d’images approprié et créez des histogrammes des comptes produits pour les cultures témoins non traitées et traitées aux antibiotiques dans le canal GFP afin de permettre la quantification de la fluorescence de fond. Pour vous assurer que les voxels GFP détectés sont corrélés à la biomasse bactérienne, définissez un voxel GFP positif comme étant supérieur ou égal à 1,5 fois la valeur de fond du GFP. Produisez les surfaces ISO pour tous les voxels restants et pour détecter des agrégats individuels, activez l’option fractionner les objets et définissez les agrégats en tant qu’objets.Utilisez le module vantage pour calculer le volume XYZ et la somme des voxels GFP pour chaque objet individuel. Exportez ces données vers une plateforme statistique externe. Filtrez les données exportées par taille pour définir des objets dont les volumes sont supérieurs ou égaux à cinq micromètres cubes.Retirez tous les objets de moins de 0,5 micromètre cube et utilisez le module vantage pour calculer la distance de chaque objet par rapport aux autres objets de chaque image. Alternativement, la distance peut être calculée à l’aide de la formule, puis utiliser la somme et les calculs moyens pour déterminer la biomasse totale dans le volume agrégé moyen. Bien qu’il reste plusieurs agrégats bactériens viables après quatre heures d’application d’antibiotiques, la biomasse totale des populations agrégées dans les cultures traitées aux antibiotiques est considérablement réduite par rapport à celle des cultures non traitées.La microscopie de séries chronologiques peut être utilisée pour déterminer les modèles spatiaux entre les agrégats sensibles à l’iodure de propidium positifs et les agrégats tolérants gFP positifs après un traitement antibiotique. En calculant comment les agrégats de différentes tailles contribuent à la population globale, il est possible d’identifier des modèles de la façon dont les agrégats répondent au traitement antibiotique en fonction de leur taille, de leur forme et de leur position. Après un traitement antibiotique, les agrégats viables et non viables peuvent être séparés avec succès en fonction de leur expression de signal fluorescent.Nous espérons que ce protocole inspirera d’autres chercheurs à étudier l’organisme de leur choix à une résolution similaire. Notre objectif est de trouver des fil conducteurs communs dans ces communautés complexes, quel que soit le site de l’infection.

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Source : Chen, Y., et al. Évaluation de la virulence et de la pathogenèse de l’infection par Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre un test de survie utilisant C. elegans pour modéliser la pathogenèse d’Aeromonas , où l’ingestion orale de la bactérie entraîne une infection intestinale et une mortalité, permettant une évaluation quantitative de la virulence bactérienne dans un système hôte vivant.

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Cette vidéo présente une technique in vitro pour étudier l’impact du traitement antimicrobien sur les agrégats de Pseudomonas aeruginosa (Pa). Les cellules Pa marquées par fluorescence sont cultivées sous forme d’agrégats, imitant le modèle de croissance pendant l’infection. Après avoir testé les agrégats avec une concentration sublétale de colistine, l’évaluation en temps réel de l’interaction bactérie-antibiotique est effectuée par microscopie à fluorescence.

Une technique in vitro pour étudier les traitements antimicrobiens sur des agrégats bactériens

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