Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae

Cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régulation des gènes cibles candidats via des modifications épigénétiques au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale. La technologie de séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine peut détecter efficacement les segments d’ADN qui interagissent avec les histones et les facteurs de transcription dans l’ensemble du génome. Comparé à d’autres méthodes, il peut améliorer l’efficacité et la résolution.

Commencez par ajouter 100 microlitres de milieu liquide complet aux assiettes Agger de tomates d’avoine à l’aide d’une pipette de 100 microlitres. À l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez le mycélium de la souche de type sauvage et la souche knockout. Recueillir les débris de mycélium et les transférer dans 250 millilitres de milieu liquide complet.

Laver les hyphes fongiques avec 500 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,7 molaire. Ensuite, collectez le mycélium fongique et pesez-le. Ajouter environ un millilitre de solution de perméation enzymatique de lyse par gramme de mycélium fongique.

Placez les hyphes pour le léçage à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre heures en secouant à 150 tr / min. Laver les hyphes poux avec 50 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,7 molaire. Centrifuger l’échantillon et jeter le surnageant avec soin.

Re-suspendre le protoplaste dans 20 millilitres de solution de chlorure de sodium 0,7 molaire. Ajouter 55 microlitres de formaldéhyde à 37% goutte à goutte à deux millilitres de tampon de chlorure de sodium contenant des protoplastes pour la réticulation jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1% Pour éteindre le formaldéhyde non réagi, ajouter 20 microlitres de 10 fois la glycine à chaque tube. Jeter soigneusement le surnageant après centrifugation.

Re-suspendre la pastille dans un millilitre de solution de chlorure de sodium 0,7 molaire. Jetez soigneusement le surnageant après centrifugation et ressusquez la pastille dans 750 microlitres de tampon RIPA. Ajouter 37,5 microlitres de 20 fois l’inhibiteur de la protéase.

Cisaillez la chromatine par sonication pendant huit minutes à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons. Une fois que l’échantillon a été brisé par ultrasons, retirez une partie de l’échantillon comme entrée contenant tout l’ADN et les protéines libérés après la sonique de l’échantillon. Pour analyser la longueur des fragments d’ADN, exécutez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1% après la sonication.

Après centrifugation, transférer le surnageant centrifugé dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et le stocker à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation ultérieure. Avant d’effectuer l’expérience IP, diluez chaque échantillon de chromatine dans un rapport de un à 10 avec un tampon RIPA d’une fois. Pipette 50 microlitres de billes de protéines super paramagnétiques dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres.

Placez les tubes sur un support magnétique et laissez les perles magnétiques précipiter. Retirez ensuite le surnageant. Ajouter un millilitre de tampon RIPA pré-refroidi une fois au tube et laver trois fois les billes de protéines super paramagnétiques.

Placez les tubes sur un support magnétique et retirez le surnageant. Ajoutez 100 microlitres d’un tampon RIPA une fois à chaque tube. Ajouter 30 microlitres de l’échantillon de chromatine, 100 microlitres de perles de protéines super paramagnétiques et quatre microlitres d’anticorps H3K4me3 au tube, en les mélangeant bien.

Placez les échantillons sur un agitateur rotatif pour les incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius à 30 fois G.Lavez l’anticorps de billes de protéine super paramagnétique et le complexe chromatine en resusmettant les perles dans un millilitre d’une fois le tampon RIPA. Lavez l’échantillon avec un millilitre de tampon de lavage complexe immunitaire à faible teneur en sel, puis avec un millilitre de tampon de lavage complexe immunitaire à haute teneur en sel. Rincez les billes avec un millilitre de tampon de chlorure de lithium et retirez le surnageant.

Ajoutez ensuite un millilitre de tampon TE au tube. Replacez le tube avec un millilitre de tampon TE et retirez le surnageant avec une pipette. Ajouter 100 microlitres de tampon d’élution à chaque tube de centrifugeuse.

Effectuez l’élution à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Centrifuger pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius et recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes de centrifugeuse. Ajouter huit microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires à tous les tubes et incuber à 65 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures ou pendant la nuit pour inverser les liaisons croisées des protéines de l’ADN.

Ajouter un microlitre de Rnase A et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter quatre microlitres de protéinase K à chaque tube et incuber à 45 degrés Celsius pendant une à deux heures. Ajouter 550 microlitres du mélange de chloroforme fénal et d’alcool isoamylique dans le tube de centrifugeuse.

Centrifuger pendant 15 minutes à 10 000 fois G et aspirer le surnageant. Ajouter 1/10 volume de solution d’acétate de sodium à trois molaires, 2,5 volumes d’éthanol absolu et trois microlitres de glycogène dans le tube. Placez l’échantillon dans un réfrigérateur à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit pour les précipitations.

Le lendemain, centrifugez les tubes et jetez le surnageant. Laver la pastille trois fois avec un millilitre d’éthanol 75% fraîchement préparé à 10 000 fois G.Ajouter 50 microlitres d’eau désionisée stérile pour dissoudre suffisamment le précipité. Réparez les extrémités de l’ADN pour générer de l’ADN émoussé à l’aide d’un kit de réparation de l’extrémité de l’ADN et des instructions mentionnées dans le manuscrit textuel.

Pour ajouter une base d’adénine aux trois extrémités principales, ajoutez 30 microlitres d’ADN, deux microlitres d’eau, cinq microlitres de 10 fois le tampon Taq, 10 microlitres d’un dATP millimolaire et trois microlitres d’ADN polymérase Taq à un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 microlitre. Mélangez-les et réagissez dans un appareil pcr à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuer la ligature de liaison en mélangeant 10 microlitres d’ADN, 9,9 microlitres d’eau, 2,5 microlitres de tampon d’ADN ligase T4, 0,1 microlitre de mélange oligo d’adaptateur et 2,5 microlitres d’ADN ligase T4 dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 microlitre.

Incuber le tube à 16 degrés Celsius pendant quatre heures. Pour amplifier l’ADN à l’aide d’amorces PCR, ajoutez 10,5 microlitres d’ADN, 12,5 microlitres de mélange maître deux fois haute fidélité. un microlitre d’apprêt PCR PE 1.0 et un microlitre d’apprêt PCR PE 2.0 à un tube centrifuge PCR PCR de 0,2 microlitre et bien mélanger.

Les signaux H3K4me3 des mutants de délétion mobre2, mospp1 et moswd2 ont été significativement diminués dans ses régions cibles fonctionnelles. Par rapport à la souche de type sauvage P131, les signaux des lectures enrichies de séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine H3K4me3 chez les mutants de délétion mobre2, mospp1 et moswd2 ont été largement diminués. En suivant cette procédure, puce sur puce et puce qPCR peuvent être effectués.

Ils sont généralement utilisés pour dépister le gène cible en aval d’une protéine et étudier les interactions de l’ADN protéique sur des sites de liaison au génome connus.