Name: Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez l'analyse à l'échelle du génome des modifications des histones chez Magnaporthe oryzae par séquençage ChIP-seq. Cette méthode permet d'identifier les gènes cibles impliqués dans la pathogénèse fongique et la régulation épigénétique.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31871638), le projet spécial de recherche scientifique de l’Université d’agriculture de Beijing (YQ201603), le projet scientifique du Comité éducatif de Beijing (KM201610020005), le projet de culture de recherche scientifique de haut niveau de BUA (GJB2021005).

1. Préparation de protoplastes de M. oryzae
<ol><li>Préparez la gélose à l’avoine-tomate (OTA).<ol>
<li>Peser 30-50 g de flocons d’avoine et les faire bouillir dans 800 mL d’eau (ddH2O) pendant 20 min. Filtrer à travers deux couches de gaze et prendre le filtrat.</li>
		<li>Cueillez des tomates mûres et pelez-les. Presser le jus et filtrer à travers deux couches de gaze pour recueillir 150 mL du jus filtré.</li>
		<li>Mélanger soigneusement tout le jus de tomate et le filtrat d’avoine préparé et ajouter ddH2O jusqu’à 1000 mL.</li>
		<li>Ajouter 250 mL d’OTA et 2,5 g de poudre de gélose dans une fiole conique de 500 mL et autoclaver pendant 20 min. Conserver à 25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versez 25 mL de l’OTA autoclavé dans une boîte de Petri en verre de 5 cm x 5 cm. Préparez 10 de ces boîtes de Petri au total. Une fois que l’OTA s’est solidifié sur les boîtes de Pétri, conservez les plats à l’envers à 25 °C.</li>
	<li>Utilisez un cure-dent stérilisé pour extraire un petit morceau de mycélium de M. oryzae (la souche de type sauvage P131, les souches knockout Δmobre2, Δmospp1 et Δmoswd2)et placez-les sur les plats OTA préparés. Culturez-les pendant 4 à 6 jours à 28 °C dans des conditions de lumière. REMARQUE: Tournez la boîte de Petri à l’envers pour éviter la pollution.</li>
	<li>Ajouter 1000 μL de milieu complet liquide (CM) (0,6% d’extrait de levure, 0,3% d’hydrolysat de caséine enzymatique, 0,3% d’hydrolysat de caséine acide, 1% de glucose) aux plats OTA à l’aide d’une pipette de 1000 μL. REMARQUE: Les hyphes ont poussé sur les plats OTA pendant 4-6 jours.</li>
	<li>Gratter le mycélium de la souche de type sauvage et knockout avec une boucle d’inoculation.</li>
	<li>Recueillir les débris de mycélium et les transférer dans 250 mL de liquide En milieu complet (CM).</li>
	<li>Faire pousser les débris fongiques dans une fiole triangulaire à 28 °C pendant 36 h en agitant à 150 tr/min.</li>
	<li>Utilisez un entonnoir pour filtrer et collecter les hyphes fongiques.</li>
	<li>Laver les hyphes fongiques avec 500 mL de solution de NaCl de 0,7 M.</li>
	<li>Recueillez le mycélium fongique et pesez-le. REMARQUE: Le mycélium n’a pas besoin d’être séché avant la pesée.</li>
	<li>Ajouter ~1 mL de solution de perméation enzymatique de lyse pour 1 g de mycélium fongique.<ol>
<li>Préparer la solution de perméation enzymatique de lyse à 20 mg/mL en dissolvant l’enzyme de lyse de Trichoderma harzianum dans 0,7 M de NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les hyphes pour les lyser à 28 °C pendant 3-4 h en agitant à 150 tr/min.</li>
	<li>Laver les hyphes lysés avec 50 mL de solution de NaCl de 0,7 M.</li>
	<li>Recueillir les protoplastes et centrifuger pendant 15 min à 2 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Après centrifugation, jeter soigneusement le surnageant. Resuspendez les protoplastes dans 20 mL de tampon NaCI de 0,7 M à 4 °C.</li>
</ol>2. Réticulation et sonication in vivo
<ol><li>Ajouter 55 μL de formaldéhyde à 37 % (ajouter le formaldéhyde goutte à goutte jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1 %) à 2 mL de tampon NaCI contenant du protoplaste pour la réticulation.</li>
	<li>Incuber les protoplastes à 25 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de 10x glycine à chaque tube pour éteindre le formaldéhyde non réagi.</li>
	<li>Faire tourbillonner pour mélanger et incuber à 25 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifuger pendant 15 min à 2 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Après centrifugation, jeter soigneusement le surnageant. Resuspendez la pastille dans 1 mL de solution naci de 0,7 M.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Après centrifugation, jeter soigneusement le surnageant. Resuspendez la pastille dans 750 μL de tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS et inhibiteurs de la protéase).</li>
	<li>Ajouter 37,5 μL d’inhibiteur de protéase 20x.</li>
	<li>Transférer les protoplastes de l’étape précédente dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.</li>
	<li>Effectuer la sonication (25% W, sortie 3 s, arrêt 5 s, 4 °C) immédiatement avec un sonicateur pendant environ 10 min. Le but de cette étape est de soniquer le lysate réticulé pendant un certain temps afin de déterminer les meilleures conditions. REMARQUE: Le lysate peut être congelé à -80 ° C à cette étape.</li>
	<li>Si les conditions optimales de sonication ont déjà été déterminées, passez à l’étape suivante.</li>
	<li>Si vous le souhaitez, retirez 5 μL de protoplastes pour l’analyse du gel d’agarose (ADN non râlé).</li>
	<li>Cisaillez la chromatine par sonication avec un homogénéisateur à ultrasons pendant 8 min (25% W, sortie 3 s, arrêt 5 s, 4 °C).</li>
	<li>Une fois que l’échantillon est brisé par ultrasons, retirez une partie de l’échantillon en tant qu'"entrée ». L’entrée n’effectue pas l’expérience ChIP et contient tout l’ADN et les protéines libérés après la sonique de l’échantillon.</li>
	<li>Après la sonication, exécutez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1% pour analyser la longueur des fragments d’ADN. REMARQUE: Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose montrent que la longueur du fragment d’ADN est de 200 à 500 bp(Figure 4).</li>
	<li>Placez le tube sonique sur la glace pour éviter la dégradation des protéines.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Après centrifugation, transférer le surnageant centrifugé dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 mL et le stocker à -80 °C pour une utilisation ultérieure. La solution de chromatine obtenue dans cette étape peut être utilisée pour la PI ultérieure.</li>
	<li>Avant d’effectuer l’expérience IP, diluez chaque échantillon de chromatine dans un rapport de 1:10 avec 1x tampon RIPA (par exemple, ajoutez 10 μL d’échantillon de chromatine à 1 μL de tampon 1×RIPA).</li>
</ol>3. IP de la protéine/ADN réticulé
<ol><li>Pipeter 50 μL de billes de protéines superparamagnétiques dans un tube de centrifugeuse de 2 mL. Placez les tubes sur un support magnétique. Laissez les perles magnétiques précipiter. Retirez le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 1x tampon RIPA (pré-refroidi sur glace) au tube et laver trois fois les billes de protéines superparamagnétiques. Après le lavage, placez les tubes sur un support magnétique et retirez le surnageant. Ajouter 100 μL de tampon RIPA 1x à chaque tube.</li>
	<li>Ajouter 300 μL d’échantillon de chormatine (2 x 107 cellules ont été utilisées), 100 μL de billes de protéines superparamagnétiques et 4 μL d’anticorps H3K4me3 au tube.</li>
	<li>Utilisez des échantillons avec des IgG de souris comme témoin négatif. REMARQUE: Les IgG de souris utilisées dans ce protocole contiennent 0,01 M de tampon phosphate et 0,15 M de NaCl, et resteront congelées en dessous de 20 ° C (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Après avoir bien mélangé, placer les échantillons sur un agitateur rotatif et incuber pendant la nuit à 4 °C, 30 x g. REMARQUE: Il peut être possible de réduire le temps d’incubation de l’immunoprécipitation (IP). Le temps d’incubation dépend de différents facteurs (par exemple, l’anticorps, la cible du gène, le type de cellule, etc.) et devra être testé empiriquement.</li>
</ol>4. Collecte et rinçage des produits IP
<ol><li>Arquez les billes de protéines superparamagnétiques en les plaçant sur un support magnétique. Aspirer et jeter le surnageant.</li>
	<li>Laver le complexe perle-anticorps/chromatine de protéine superparamagnétique en réutilisant les billes dans 1 mL de tampon RIPA 1x.</li>
	<li>Rincez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant à 30 x g.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage complexe immunitaire faible en sel (0,1 % de FDS, 1 % de Triton X-100, 2 mM d’EDTA, 20 mM de Tris-HCl pH 8,1 et 150 mM de NaCl).</li>
	<li>Rincez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage complexe immunisé à haute teneur en sel (0,1 % de FDS, 1 % de Triton X-100, 2 mM d’EDTA, 20 mM de Tris-HCl pH 8,1 et 500 mM de NaCl) au tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Placez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant.</li>
	<li>Rincer avec 1 mL de LiCl (0,25 M LiCl, 1 % de NP-40, 1 % d’acide désoxycholique, 1 mM d’EDTA et 10 mM de Tris-HCl pH 8,1) dans le tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Placez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant.</li>
	<li>Rincez à nouveau le tube à essai avec 1 mL de tampon LiCI de 0,25 M, retirez le surnageant avec une pipette, puis jetez le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Placez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min à 30 x g.</li>
	<li>Lavez à nouveau le tube avec un tampon TE de 1 mL et retirez le surnageant avec une pipette.</li>
	<li>Ramassez les perles.</li>
</ol>5. Élution des complexes protéine/ADN
<ol><li>Préparer le tampon d’élution (10 μL de FDS à 20 %, 20 μL de 1 MNaHCO3,170 μL deH2O distillé stérile) pour tous les tubes IP et d’entrée.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de tampon d’élution à chaque tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Élution à 65 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g et 4 °C et recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes centrifuges.</li>
	<li>Répétez les étapes 5.2 à 5.4 et combinez les éluats. Ajouter 190 μL de tampon d’élution aux 10 μL de l’ADN d’entrée. (volume total = 200 μL).</li>
</ol>6. Réticulation inverse des complexes protéine/ADN
<ol><li>Ajouter 8 μL de 5 M NaCl à tous les tubes et incuber à 65 °C pendant 4-5 h ou pendant la nuit pour inverser les liaisons croisées ADN-protéine. REMARQUE: Après cette étape, stockez les échantillons à -20 °C et continuez le protocole le lendemain, si nécessaire.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de RNase A et incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Ajouter 4 μL de protéinase K (dissoute dansH2Oà 20 mg/mL et conservée à -20 °C) dans chaque tube et incuber à 45 °C pendant 1-2 h.</li>
</ol>7. Purification et récupération de l’ADN
<ol><li>Ajouter 550 μL de mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (rapport 25:24:1) au tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Bien tourbillonnant le mélange pendant 1 min.</li>
	<li>Centrifuger pendant 15 min à 10 000 x g et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Transférer le surnageant extrait de l’étape précédente dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 1/10 volume de solution d’acétate de sodium 3 M, 2,5 volumes d’éthanol absolu et 3 μL de glycogène (20 mg/mL) dans le tube.</li>
	<li>Placer l’échantillon au réfrigérateur à -20 °C pendant la nuit pour la précipitation.</li>
	<li>Centrifuger pendant 15 min à 10 000 x g et 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant après centrifugation. Lavez la pastille trois fois avec 1 mL d’éthanol à 75 % (doit être préparé frais) à 10 000 x g.</li>
	<li>Placez le précipité lavé sur un banc propre pour laisser sécher l’alcool.</li>
	<li>Ajouter 50 μL deH2O stérile désionisé pour dissoudre suffisamment le précipité.</li>
	<li>Ligaturez l’adaptateur de séquençage au fragment d’ADN et utilisez une plate-forme de séquençage à haut débit pour séquencer l’ADN.</li>
</ol>8. Réparation de l’ADN et construction de la bibliothèque Solexa
<ol><li>Réparez les extrémités de l’ADN pour générer de l’ADN émoussé à l’aide d’un kit de réparation finale de l’ADN (1 à 34 μL d’ADN, 5 μL de tampon de réparation finale 10x, 5 μL de 2,5 mM chacun dNTP, 5 μL de 10 mM d’ATP, 1 μL de mélange d’enzymes de réparation finale et H2O pour ajuster le volume de réaction à 49 μL).</li>
	<li>Utilisez un kit de purification par PCR ou phénol : extraction de chloroforme pour purifier l’ADN. Éluer ou resuspend l’ADN dans 30 μL de 1x TE pH 7,4.</li>
	<li>Ajouter « A » aux extrémités 3' (30 μL d’ADN de l’étape 2, 2 μL deH2O, 5 μL de tampon Taq 10x, 10 μL de 1 mM dATP et 3 μL d’ADN polymérase Taq). Ajouter les réactifs dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 mL, bien mélanger et réagir dans une machine PCR à 72 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Effectuer la ligature de liaison en mélangeant 10 μL d’ADN, 9,9 μL deH2O, 2,5 μL de tampon d’ADN ligase T4, 0,1 μL de mélange oligo adaptateur et 2,5 μL d’ADN ligase T4. Ajouter les réactifs dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 mL et bien mélanger. Les incuber à 16 °C pendant 4 h.</li>
	<li>Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de purification par PCR selon le protocole du fabricant. Éluez avec 20-25 μL de tampon d’élution.</li>
	<li>Avant que la bibliothèque d’ADN ne soit établie, identifiez la concentration de l’ADN purifié pour confirmer son utilisation pour les expériences de séquençage ultérieures.</li>
	<li>Détectez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluoromètre. Après avoir fait fondre l’échantillon sur de la glace, bien mélanger et centrifuger pendant 30 s à 1000 x g et 4 °C. Ensuite, prenez une quantité appropriée d’échantillon et mesurez-la dans un fluoromètre d’une longueur d’onde de 260 nm.</li>
	<li>Placez des échantillons d’ADN de qualité et de concentration qualifiées sur la plate-forme de séquençage Illumina pour le séquençage.</li>
	<li>Avant le séquençage, amplifiez l’ADN à l’aide d’amorces PCR, PE1.0 et PE2.0, et 2x mélange maître haute fidélité (10,5 μL d’ADN, 12,5 μL de 2x mélange maître haute fidélité, 1 μL d’apprêt PCR PE1.0 et 1 μL d’apprêt PCR PE2.0). Ajouter les réactifs dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 mL et bien mélanger.</li>
	<li>Exécuter la réaction PCR dans la machine PCR: prédénaturation à 95 °C pendant 2 min; puis 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, recuit à 60 °C pendant 15 s, extension à 72 °C pendant 5 s ; une dernière prolongation à 72 °C pendant 5 min. Enfin, incuber la réaction à 4 °C.</li>
	<li>Utilisez l’ADN pour la génération de grappes et effectuez le séquençage par synthèse sur un Illumina Hiseq 2000. REMARQUE: Dans ce protocole, les cellules d’écoulement Illumina ont été utilisées pour la génération de clusters. Le séquençage par synthèse a été effectué sur un analyseur de génome Illumina en suivant les instructions du fabricant.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ont déclaré qu’il n’existait pas d’intérêts concurrents.

Récemment, ChIP-seq est devenu une méthode d’analyse génomique largement utilisée pour déterminer les sites de liaison des TF ou des sites d’enrichissement modifiés par des histones spécifiques. Par rapport à la technologie ChIP-seq précédente, la nouvelle technologie ChIP-seq est très sensible et flexible. Les résultats sont fournis en haute résolution sans effets négatifs, tels que le signal de bruit causé par l’hybridation non spécifique des acides nucléiques. Bien qu’il s’agit d’une analyse courante de l’expression g...

L’épigénétique est une branche de la recherche génétique qui fait référence au changement héréditaire de l’expression des gènes sans modifier la séquence nucléotidique des gènes. Un nombre croissant d’études ont montré que la régulation épigénétique joue un rôle important dans la croissance et le développement des cellules eucaryotes, y compris la chromatine qui régule et affecte l’expression des gènes par le processus dynamique de repliement et d’assemblage dans des structures d’ordre supérieur1,2. Le remodelage de la chromatine et la modification covalente des histones affectent et régulent la fonction et la structure de la chromatine par la variation des polymères de chromatine, atteignant ainsi la fonction de régulation del’expressiondes gènes3,4,5,6. Les modifications post-traductionnelles de l’histone comprennent l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation, la monoubiquitination, la sumoylation et la ribosylation ADP7,8,9. La méthylation de l’histone H3K4, en particulier la triméthylation, a été mappée aux sites de départ de la transcription où elle est associée à la réplication de la transcription, à la recombinaison, à la réparation et au traitement de l’ARN chez les eucaryotes10,11.
La technologie ChIP-seq a été introduite en 2007 et est devenue la norme expérimentale pour l’analyse à l’échelle du génome de la régulation transcriptionnelle et des mécanismes épigénétiques12,13. Cette méthode convient à l’échelle du génome et permet d’obtenir des informations sur l’interaction des histones ou des facteurs de transcription, y compris des segments d’ADN de protéines de liaison à l’ADN. Toute séquence d’ADN réticulée à des protéines d’intérêt coprécipitera dans le cadre du complexe chromatine. Des techniques de séquençage de nouvelle génération sont également utilisées pour séquencer 36 à 100 bp d’ADN, qui sont ensuite appariés au génome cible correspondant.
Chez les champignons phytopathogènes, la recherche a récemment commencé à étudier comment les modifications de la méthylation des histones régulent leurs gènes cibles dans le processus de pathogénicité. Certaines études antérieures ont prouvé que la régulation des gènes liés à l’histone méthylase se reflète principalement dans le silençage génique et la catalyse de la production de métabolites secondaires (SM). MoSet1 est la méthylase H3K4 dans M. oryzae. L’élimination de ce gène entraîne la délétion complète de la modification H3K4me314. Par rapport à la souche de type sauvage, l’expression du gène MoCEL7C dans le mutant est inhibée à l’état induit par le CMC et à l’état non induit (glucose ou cellobiose), l’expression du MoCEL7C augmentéede 15. Dans Fusarium graminearum,KMT6 peut catalyser la modification de la méthylation de H3K27me3, réguler le développement normal des champignons et aider à réguler le « génome cryptique » contenant le groupe de gènes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly a rapporté que la méthylation H3K9 et H3K27 régule le processus pathogène des champignons par le biais de métabolites secondaires et de facteurs effecteurs qui régulent l’inhibition des gènes cibles20. Chez Aspergillus,la modification des histones H3K4me2 et H3K4me3 est liée à l’activation des gènes et joue un rôle important dans le contrôle de la régulation du niveau de chromatine des groupes de gènes SM21. Chez M. oryzae,Tig1 (homologue à Tig1 chez les levures et les mammifères) est un HADC (histone désacétylase)22. L’élimination du gène Tig1 entraîne la perte complète de la pathogénicité et de la capacité de production de spores chez le mutant nul. Il est plus sensible à un environnement peroxygénique, qui ne peut pas produire d’hyphes infectieux22.
L’explosion de riz causée par M. oryzae. est l’une des maladies du riz les plus graves dans la plupart des régions rizicoles du monde19. En raison de son processus d’infection représentatif, M. oryzae est similaire au processus d’infection de nombreux champignons pathogènes importants. Comme il peut facilement effectuer des opérations de génétique moléculaire, le champignon est devenu un organisme modèle pour l’étude des interactions fongiques-végétales23. Le blocage de chaque étape du processus d’infection de M. oryzae peut entraîner une infection infructueuse. Les changements morphologiques au cours du processus d’infection sont strictement régulés par l’ensemble de la fonction du génome et la transcription des gènes. Parmi eux, les modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones jouent un rôle essentiel dans la régulation transcriptionnelle des gènes fonctionnels24,25. Cependant, jusqu’à présent, peu d’études ont été réalisées sur le mécanisme moléculaire des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et l’acétylation des histones dans la transcription des gènes de pathogenèse chez M. oryzae. Par conséquent, le développement du mécanisme de régulation épigénétique du champignon de l’explosion du riz tout en recherchant le réseau de régulation en amont et en aval de ces gènes pathogènes aidera à développer des stratégies de prévention et de contrôle de l’explosion du riz.
Avec le développement de la génomique fonctionnelle telle que ChIP-seq, en particulier en épigénétique, cette méthode d’acquisition de données à haut débit a accéléré la recherche sur les chromosomes. En utilisant la technologie expérimentale ChIP-seq, la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (telles que H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) chez M. oryzae et d’autres champignons filamenteux peut être identifiée. Par conséquent, cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la façon dont les modifications épigénétiques régulent leurs gènes cibles candidats au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale.

<table><tbody><tr><td>hydrolysat de caséine acide</td><td>WAKO</td><td>65072-00-6</td><td>Configuration moyenne</td></tr><tr><td></td><td>poudre de gélose scientan</td><td>9002-18-0</td><td>Configuration moyenne</td></tr><tr><td>acide désoxycholique</td><td>MedChemExpress</td><td>83-44-3</td><td>protéine et dissolution</td></tr><tr><td>ADN End-Repair kit</td><td>NovoBiotec</td><td>ER81050</td><td>Réparer l’ADN ou l’ADNc endommagés par cisaillement</td></tr> <tr><td>enzymatique ou mécaniqueDynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>no.100.02D</td><td>Cible de liaison</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>JIMEI</td><td>JC2174</td><td>EDTA membranaire et liquide</td></tr><tr><td></td><td>EDTA ThermoFisher</td><td>AM9912</td><td>inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>hydrolysat enzymatique de caséine</td><td>Sigma</td><td>91079-40-2</td><td>Configuration moyenne</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Glycogène configuration moyenne</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Action précipitante</td></tr><tr><td>Anticorps H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Réponse immunitaire à la protéine H3K4me3</td></tr><tr><td>illumina Analyseur de génome</td><td>illumina</td><td>illumina Hiseq 2000</td><td>Grande configuration</td></tr><tr><td>Illumina PCR amorces</td><td>illumina</td><td>CleanPlex</td><td>Random universal primer</td></tr><tr><td>isoamyl alcool</td><td>chimique livre</td><td>30899-19-5</td><td>ADN purifié</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9480</td><td>élimination spécifique</td></tr><tr><td>de l’ARN enzymes de lyse</td><td>Sigma</td><td>L1412-10G</td><td>tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>IgG de souris</td><td>Yeasen</td><td>36111ES10</td><td>Immunoglobuline normale animale</td></tr><tr><td>solution NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>7647-14-5</td><td>Configuration moyenne</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Seebio</td><td>SH30173.08*</td><td>Préparation d’un éluant complexe protéique</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td>lysat cellulaire pour favoriser la lyse cellulaire</td></tr><tr><td>PCR Kit de purification</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>La procédure de purification élimine les amorces des échantillons d’ADN</td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>ThermoFisher</td><td>A32965</td><td>Un inhibiteur de protéine qui diminue l’activité des protéines</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2546</td><td>Réactif</td></tr> <tr><td>d’extraction d’ADNQubit 4.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33226</td><td>Configuration moyenne</td></tr><tr><td>Tampon RIPA</td><td>ThermoFisher</td><td>9806S</td><td>tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2271</td><td>ADN purifié</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9820</td><td>couvrir les différences de charge solution d’acétate</td></tr> de <tr><td>sodium</td><td>ThermoFisher</td><td>R1181</td><td>Tampon</td></tr> <tr><td>d’acide acétiquedésoxycholate de sodium</td><td>ThermoFisher</td><td>89904</td><td>inhibition de la dégradation de la protéase</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0011</td><td>Sous la condition de l’ATP en tant que coenzyme, ADN ligase</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase tampon</td><td>ThermoFisher</td><td>B69</td><td>Tampon d’ADN ligase</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>ThermoFisher</td><td>1185-53-1</td><td>action tampon</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>HFH10</td><td>maintenir la protéine membranaire stable</td></tr><tr><td>extrait de levure</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Configuration du milieu</td></tr></tbody></table>

analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) est une technique moléculaire puissante et largement utilisée pour cartographier les emplacements du génome entier des facteurs de transcription (TF), des régulateurs de chromatine et des modifications des histones, ainsi que pour détecter des génomes entiers pour découvrir des modèles de liaison TF et des modifications post-traductionnelles des histones. Les activités modifiant la chromatine, telles que la méthylation des histones, sont souvent recrutées dans des séquences de régulation géniques spécifiques, provoquant des changements localisés dans les structures de la chromatine et entraînant des effets transcriptionnels spécifiques. L’explosion de riz est une maladie fongique dévastatrice sur le riz dans le monde entier et est un système modèle pour l’étude de l’interaction champignon-plante. Cependant, les mécanismes moléculaires dans la façon dont les modifications des histones régulent leurs gènes de virulence dans Magnaporthe oryzae restent insaisissables. Plus de chercheurs doivent utiliser ChIP-seq pour étudier comment la modification épigénétique des histones régule leurs gènes cibles. ChIP-seq est également largement utilisé pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN chez les animaux et les plantes, mais il est moins utilisé dans le domaine de la pathologie végétale et n’a pas été bien développé. Dans cet article, nous décrivons le processus expérimental et la méthode de fonctionnement de ChIP-seq pour identifier la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (comme H3K4me3) qui se lie aux gènes cibles fonctionnels de M. oryzae. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.

L’organigramme complet de la méthode ChIP-seq est illustré à la figure 1. Des expériences ChIP-seq ont été réalisées en utilisant des anticorps contre H3K4me3 dans la souche de type sauvage P131 et trois souches mutantes nulles dépourvues du gène mobre2, mospp1et moswd2 pour vérifier le profil pangénomique de la distribution de l’histone H3K4me3 chez M. oryzae. Les protoplastes de la souche de type sauvage, Δmobre2, Δmospp1et Δmoswd2,...

Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.

Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régulation des gènes cibles candidats via des modifications épigénétiques au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale. La technologie de séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine peut détecter efficacement les segments d’ADN qui interagissent avec les histones et les facteurs de transcription dans l’ensemble du génome. Comparé à d’autres méthodes, il peut améliorer l’efficacité et la résolution.Commencez par ajouter 100 microlitres de milieu liquide complet aux assiettes Agger de tomates d’avoine à l’aide d’une pipette de 100 microlitres. À l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez le mycélium de la souche de type sauvage et la souche knockout. Recueillir les débris de mycélium et les transférer dans 250 millilitres de milieu liquide complet.Laver les hyphes fongiques avec 500 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,7 molaire. Ensuite, collectez le mycélium fongique et pesez-le. Ajouter environ un millilitre de solution de perméation enzymatique de lyse par gramme de mycélium fongique.Placez les hyphes pour le léçage à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre heures en secouant à 150 tr / min. Laver les hyphes poux avec 50 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,7 molaire. Centrifuger l’échantillon et jeter le surnageant avec soin.Re-suspendre le protoplaste dans 20 millilitres de solution de chlorure de sodium 0,7 molaire. Ajouter 55 microlitres de formaldéhyde à 37% goutte à goutte à deux millilitres de tampon de chlorure de sodium contenant des protoplastes pour la réticulation jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1% Pour éteindre le formaldéhyde non réagi, ajouter 20 microlitres de 10 fois la glycine à chaque tube. Jeter soigneusement le surnageant après centrifugation.Re-suspendre la pastille dans un millilitre de solution de chlorure de sodium 0,7 molaire. Jetez soigneusement le surnageant après centrifugation et ressusquez la pastille dans 750 microlitres de tampon RIPA. Ajouter 37,5 microlitres de 20 fois l’inhibiteur de la protéase.Cisaillez la chromatine par sonication pendant huit minutes à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons. Une fois que l’échantillon a été brisé par ultrasons, retirez une partie de l’échantillon comme entrée contenant tout l’ADN et les protéines libérés après la sonique de l’échantillon. Pour analyser la longueur des fragments d’ADN, exécutez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1% après la sonication.Après centrifugation, transférer le surnageant centrifugé dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et le stocker à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation ultérieure. Avant d’effectuer l’expérience IP, diluez chaque échantillon de chromatine dans un rapport de un à 10 avec un tampon RIPA d’une fois. Pipette 50 microlitres de billes de protéines super paramagnétiques dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres.Placez les tubes sur un support magnétique et laissez les perles magnétiques précipiter. Retirez ensuite le surnageant. Ajouter un millilitre de tampon RIPA pré-refroidi une fois au tube et laver trois fois les billes de protéines super paramagnétiques.Placez les tubes sur un support magnétique et retirez le surnageant. Ajoutez 100 microlitres d’un tampon RIPA une fois à chaque tube. Ajouter 30 microlitres de l’échantillon de chromatine, 100 microlitres de perles de protéines super paramagnétiques et quatre microlitres d’anticorps H3K4me3 au tube, en les mélangeant bien.Placez les échantillons sur un agitateur rotatif pour les incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius à 30 fois G.Lavez l’anticorps de billes de protéine super paramagnétique et le complexe chromatine en resusmettant les perles dans un millilitre d’une fois le tampon RIPA. Lavez l’échantillon avec un millilitre de tampon de lavage complexe immunitaire à faible teneur en sel, puis avec un millilitre de tampon de lavage complexe immunitaire à haute teneur en sel. Rincez les billes avec un millilitre de tampon de chlorure de lithium et retirez le surnageant.Ajoutez ensuite un millilitre de tampon TE au tube. Replacez le tube avec un millilitre de tampon TE et retirez le surnageant avec une pipette. Ajouter 100 microlitres de tampon d’élution à chaque tube de centrifugeuse.Effectuez l’élution à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Centrifuger pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius et recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes de centrifugeuse. Ajouter huit microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires à tous les tubes et incuber à 65 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures ou pendant la nuit pour inverser les liaisons croisées des protéines de l’ADN.Ajouter un microlitre de Rnase A et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter quatre microlitres de protéinase K à chaque tube et incuber à 45 degrés Celsius pendant une à deux heures. Ajouter 550 microlitres du mélange de chloroforme fénal et d’alcool isoamylique dans le tube de centrifugeuse.Centrifuger pendant 15 minutes à 10 000 fois G et aspirer le surnageant. Ajouter 1/10 volume de solution d’acétate de sodium à trois molaires, 2,5 volumes d’éthanol absolu et trois microlitres de glycogène dans le tube. Placez l’échantillon dans un réfrigérateur à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit pour les précipitations.Le lendemain, centrifugez les tubes et jetez le surnageant. Laver la pastille trois fois avec un millilitre d’éthanol 75% fraîchement préparé à 10 000 fois G.Ajouter 50 microlitres d’eau désionisée stérile pour dissoudre suffisamment le précipité. Réparez les extrémités de l’ADN pour générer de l’ADN émoussé à l’aide d’un kit de réparation de l’extrémité de l’ADN et des instructions mentionnées dans le manuscrit textuel.Pour ajouter une base d’adénine aux trois extrémités principales, ajoutez 30 microlitres d’ADN, deux microlitres d’eau, cinq microlitres de 10 fois le tampon Taq, 10 microlitres d’un dATP millimolaire et trois microlitres d’ADN polymérase Taq à un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 microlitre. Mélangez-les et réagissez dans un appareil pcr à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuer la ligature de liaison en mélangeant 10 microlitres d’ADN, 9,9 microlitres d’eau, 2,5 microlitres de tampon d’ADN ligase T4, 0,1 microlitre de mélange oligo d’adaptateur et 2,5 microlitres d’ADN ligase T4 dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 microlitre.Incuber le tube à 16 degrés Celsius pendant quatre heures. Pour amplifier l’ADN à l’aide d’amorces PCR, ajoutez 10,5 microlitres d’ADN, 12,5 microlitres de mélange maître deux fois haute fidélité. un microlitre d’apprêt PCR PE 1.0 et un microlitre d’apprêt PCR PE 2.0 à un tube centrifuge PCR PCR de 0,2 microlitre et bien mélanger.Les signaux H3K4me3 des mutants de délétion mobre2, mospp1 et moswd2 ont été significativement diminués dans ses régions cibles fonctionnelles. Par rapport à la souche de type sauvage P131, les signaux des lectures enrichies de séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine H3K4me3 chez les mutants de délétion mobre2, mospp1 et moswd2 ont été largement diminués. En suivant cette procédure, puce sur puce et puce qPCR peuvent être effectués.Ils sont généralement utilisés pour dépister le gène cible en aval d’une protéine et étudier les interactions de l’ADN protéique sur des sites de liaison au génome connus.

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Génétique

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Détection des modifications des histones dans les feuilles des plantes

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A Novel bayésienne changement de point Algorithme pour l&#39;échelle du génome Analyse des données ChIPseq divers types de

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

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Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

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Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Découvrez l'analyse à l'échelle du génome des modifications des histones chez Magnaporthe oryzae par séquençage ChIP-seq. Cette méthode permet d'identifier les gènes cibles impliqués dans la pathogénèse fongique et la régulation épigénétique.

Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae

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