Préparation d’homogénats de muscles squelettiques de rat pour les mesures de nitrates et de nitrites

Le muscle squelettique sert de réservoir majeur de nitrate qui, après sa conversion en nitrite, sert de source de NO pendant l’exercice. Nous présentons ici une méthodologie pour mesurer ces ions dans les muscles et autres tissus. Pour commencer, préparer la solution de préservation ou d’arrêt des nitrates en combinant 890 millimolaires de ferricyanure de potassium et 118 millimolaires de n-méthylmaléimide dans de l’eau distillée, en veillant à ce qu’aucun cristal ne reste en solution, puis ajouter un tensioactif non ionique dans un rapport de 1 à 9 et mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.

Diluer la solution stop dans un rapport de 1 à 9 avec de l’eau distillée et ajouter la solution d’arrêt diluée dans le tube d’homogénéisation. Ensuite, décongelez le tissu musculaire de rat isolé et congelé précédent sur de la glace. Une fois que le tissu a décongelé, retirez le reste de la graisse et du tissu conjonctif du muscle squelettique.

Coupez des morceaux du muscle squelettique et épongez-les sur une gaze pour les sécher. Pesez la quantité appropriée de tissu musculaire squelettique, puis placez le tissu de prépoids dans les tubes d’homogénéisation contenant la solution d’arrêt. Pour l’homogénéisation dans un homogénéisateur rotatif, placer le tube de type M contenant le muscle squelettique prépesé et la solution d’arrêt pré-mesurée dans la machine.

Homogénéiser chaque échantillon deux fois et, après chaque homogénéisation, placer immédiatement le tube sur de la glace pendant 5 minutes pour le refroidir. Après homogénéisation, centrifuger brièvement le tube. Replacez le tube sur la glace et ajoutez le volume approprié de méthanol avant de vorter pendant 15 secondes.

Homogénéiser à nouveau l’échantillon et l’incuber sur de la glace pendant 30 minutes, puis centrifuger l’échantillon, aspirer le surnageant et procéder à la mesure des niveaux de nitrite et de nitrate. Pour l’homogénéisation des billes, placez le tissu musculaire squelettique dans un tube contenant des billes et homogénéisez deux fois pendant 45 secondes à la vitesse la plus élevée disponible sur l’instrument. Après chaque homogénéisation, placez immédiatement le tube sur de la glace pendant 5 minutes pour refroidir, puis centrifugez le tube, replacez le tube sur de la glace et ajoutez le volume approprié de méthanol avant de vorter pendant 15 secondes.

Homogénéiser l’échantillon une fois de plus pendant 45 secondes, puis l’incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifuger l’échantillon, aspirer le surnageant et procéder à la mesure des niveaux de nitrite et de nitrate. Pour l’homogénéisation à base de pulvérisateur, préparer les tubes contenant la solution d’arrêt diluée, puis peser et noter le poids des tubes.

Après avoir refroidi l’outil pulvérisateur sur de la glace sèche pendant 30 minutes, à l’aide d’une pince à épiler refroidie dans de l’azote liquide, transférer l’échantillon de tissu prépesé dans le pulvérisateur, puis ajouter une petite quantité d’azote liquide pour s’assurer que le tissu est à la température de l’azote liquide. Une fois que 95% de l’azote liquide s’est vaporisé, placez l’outil de broyage sur le tissu et appuyez fermement pour sentir l’écrasement de l’échantillon, puis à l’aide d’un maillet, frappez l’outil de broyage 3 à 5 fois. Lorsque l’échantillon entier a été pulvérisé, à l’aide d’une cuillère et d’une pince à épiler refroidies à l’azote liquide, transférer directement le tissu broyé dans le tube prépesé contenant la solution d’arrêt diluée.

Ensuite, faites tourbillonner le tube pendant 15 secondes, puis ouvrez le tube pour vérifier s’il y a du tissu coincé dans le couvercle. S’il y en a, essayez de le déloger, puis vortex à nouveau. Centrifuger brièvement l’échantillon pendant 2 à 3 secondes.

Pesez à nouveau le tube et calculez le poids du tissu en déduisant le poids du tube d’origine de ce nouveau poids. Placez le tube sur de la glace. Ajouter un volume approprié de méthanol dans le tube et vorter le tube à fond pendant 15 secondes avant de l’incuber sur de la glace pendant 30 minutes, puis centrifuger l’échantillon, aspirer le surnageant et procéder à la mesure des niveaux de nitrite et de nitrate.

Les niveaux de nitrate et les homogénats de muscles squelettiques de rat préparés à l’aide d’un homogénéisateur rotatif, d’un homogénéisateur de billes et d’un pulvérisateur étaient similaires. Fait intéressant, pour les niveaux de nitrites, l’échantillon d’homogénat préparé par un pulvérisateur a montré la valeur la plus élevée, qui était statistiquement différente des deux autres valeurs d’échantillon. Une comparaison des niveaux de nitrite et de nitrate dans les homogénats fessiers préparés à partir de 20, 50 et 200 milligrammes de tissu à l’aide d’un homogénéisateur de billes a montré que ni les niveaux de nitrate ni de nitrite n’étaient significativement différents entre les tailles d’échantillons musculaires.

La comparaison des niveaux de nitrate dans différents tissus musculaires squelettiques des jambes de rongeurs a révélé que le muscle fessier avait des niveaux de nitrate environ deux fois plus élevés que les trois autres tissus musculaires. Cependant, ces différences n’ont pas atteint la signification statistique. Comme pour les niveaux de nitrate, la concentration de nitrate dans le muscle fessier était également plus élevée que celle dans les trois autres tissus musculaires et était significativement plus élevée que celle dans l’échantillon gastrocnémien.

Notre méthode est relativement simple et bien adaptée aux petits échantillons tout en préservant les nitrates et nitrites lors de la préparation des échantillons.