Congélation rapide à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich pour une bonne conservation ultrastructurale des échantillons biologiques en microscopie électronique

Afin d’observer l’ultrastructure naturelle exquise des cellules, il est nécessaire de fixer les cellules par congélation rapide. La congélation en sandwich est l’une des meilleures méthodes pour congeler les cellules sans former de cristaux de glace. Ce protocole démontre l’utilisation d’un dispositif de congélation sandwich et décrit également la procédure de fabrication de sections ultra minces d’échantillons substitués par congélation après congélation sandwich.

Commencez à préparer le propane liquide en remplissant le contenant d’azote liquide du dispositif de congélation sandwich ou du SFD avec de l’azote liquide. Remplissez le contenant de propane liquide avec du propane liquide en introduisant du gaz propane à l’aide d’une buse fine. Accélérer la solidification du propane à l’aide d’une barre métallique refroidie.

Pour préparer les disques de cuivre de type plat et de type panier, placez-les sur une lame de verre avec le côté sans lettre vers le haut et traitez avec une décharge lumineuse à 10 pascals, 400 volts, un milliampère pendant 30 secondes pour rendre la surface du disque hydrophile à l’aide d’un appareil d’observation d’ions. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres et centrifuger à 2 900 fois G pendant 10 secondes à température ambiante. Retirez le surnageant et suspendez la pastille pour obtenir une suspension épaisse.

Placez une petite quantité ou environ 0,02 microlitre de la suspension cellulaire sur un disque de cuivre. Couvrez-le avec un autre disque en cuivre et ramassez les disques avec une pince à épiler. Faites un puits au centre du propane solide avec la fine barre métallique.

Placez la pince à épiler dans un SFD et congelez-les rapidement en appuyant sur le bouton d’injection de l’appareil. Faire tremper les pinces usagées dans de l’eau à température ambiante pour les réchauffer afin de congeler les spécimens suivants. Utiliser des tissus animaux et humains fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 %, un tampon phosphate molaire de 0,1 de pH 7,4.

Découpez-les en sections de 0,1 à 0,2 millimètre d’épaisseur avec une lame de rasoir au stéréomicroscope. Placez une petite goutte de la solution de glutaraldéhyde sur le disque de cuivre de type panier, puis utilisez une pince à épiler pour placer un morceau de tissu dans le glutaraldéhyde sur le disque de cuivre et recouvrez-le du disque plat en cuivre. Congelez rapidement les disques avec les tissus dans le propane en fusion du SFD, comme démontré précédemment.

Transférer les disques dans l’azote liquide dans un bain de travail. À l’aide d’une pince à épiler refroidie à l’azote liquide, détachez les disques les uns des autres pour exposer l’échantillon. Placez les disques avec les cellules dans un flacon en verre rempli d’un millilitre d’acétone contenant du tétroxyde d’osmium à 2% qui a été placé dans de l’azote liquide et solidifié.

Transférez les disques dans un congélateur et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pendant deux à quatre jours pour la substitution du gel des cellules. Amenez progressivement les spécimens à la température ambiante en les incubant pendant deux heures à moins 20 degrés Celsius, deux heures à quatre degrés Celsius et 15 minutes à température ambiante. Transférez les disques dans deux tubes en plastique millilitres remplis d’un millilitre d’acétone.

Préparez la résine époxy en mélangeant les réactifs dans un récipient en plastique jetable à l’aide d’un agitateur. Échangez l’acétone successivement avec 30% de résine dans de l’acétone, 60% de résine et 90% de résine à température ambiante pendant une heure chacun, puis échangez la résine de 90% avec 100% de résine à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Enfin, incorporez les échantillons dans de la résine à 100% dans le moule d’encastrement en silicium et polymérisez-les à 60 degrés Celsius pendant 24 heures.

Retirez les blocs polymérisés des moules d’enrobage de silicium et écrivez le numéro d’échantillon sur le bloc. Retirez les disques de cuivre du bloc avec une lame de rasoir et coupez les échantillons incrustés sur la surface du bloc à l’aide d’une lame de coupe à ultrasons et de lames de rasoir sous un stéréomicroscope. Ensuite, appliquez du ruban adhésif sur le mandrin du bloc d’échantillon et le porte-échantillon du microtome et coupez le ruban à la limite.

Retirez le bloc de l’ultra microtome, placez-le dans un stéréomicroscope et coupez-le encore à 0,2 millimètre par 0,3 millimètre à l’aide d’une lame de rasoir. Appliquez du néoprène sur les grilles pour les rendre adhésives. Remettez le bloc sur le microtome ultra en alignant les pièces scotchées.

Couvrez l’ultra microtome avec un couvercle en plastique et coupez des sections de 50 à 70 nanomètres d’épaisseur. Récupérez les sections à l’aide d’une boucle. Montez-les sur des grilles de cuivre de 300 ou 400 mailles traitées au néoprène et séchez-les.

Réglez les grilles avec des sections dans la rainure du demi-tube en silicone. Faire tremper les échantillons dans une solution d’acétate d’uranyle pendant trois minutes. Recueillir la solution d’uranyle utilisée et la conserver dans une seringue.

Lavez les spécimens dans un demi-tube avec un jet d’eau, puis faites tremper les spécimens dans du citrate de plomb pendant trois minutes. Pour les spécimens de levure et de champignons, placez les grilles sur un papier filtre, ramassez-les avec une pince à épiler et recouvrez-les d’un film de naphtalène polymérisé au plasma à la surface de l’eau. Insérez les grilles dans le porte-spécimen d’un microscope électronique, puis insérez le porte-échantillon dans le microscope électronique et observez à 100 kilovolts.

Des sections ultra minces d’E. coli et de S.cerevisiae lorsqu’elles ont été observées au microscope électronique ont montré une morphologie naturelle et des images claires. Des sections ultra minces de cellules cultivées rapidement congelées à l’aide de SFD ont été observées au microscope électronique. Les images de sections ultra minces de la peau humaine étaient très claires et montraient une morphologie naturelle.

Les particules du noyau du virus de l’hépatite B ont été rapidement congelées avec du SFD et observées par cryomicroscopie électronique. La chose la plus importante à retenir est que vous devez appliquer une très petite quantité de cellules sur les disques de cuivre afin d’éviter la formation de cristaux de glace lors de la congélation. En fixant préalablement les tissus animaux avec du glutaraldéhyde, une bonne congélation à une profondeur d’environ 200 micromètres est obtenue de manière similaire à la profondeur obtenue par congélation à haute pression.

Cette technique ouvre la voie à un chercheur pour observer l’ultrastructure naturelle exquise des cellules facilement à faible coût.