Utilisation du colorant fluorescent, Rhodamine B, pour étudier la compétitivité de l’accouplement chez les moustiques mâles Aedes aegypti

Ce protocole mesure la compétitivité de l’accouplement des moustiques mâles, qui est une condition préalable aux programmes de suppression des populations de moustiques basés sur la libération des mâles. Ce critère d’aptitude est évalué dans le cadre du contrôle de la qualité et de l’évaluation des souches. Cette méthode réduit le temps expérimental de 90% et permet de comparer directement la compétitivité de l’accouplement entre deux lignées stériles ou infectées par Wolbachia.

Irene Li et Keng Wai Mak effectueront cette procédure. Pour commencer, sexez les moustiques mâles et femelles au stade nymphal, en fonction de leurs différences de taille. Pour chaque ensemble de moustiques, transférez 100 nymphes mâles dans une cage pré-étiquetée pour l’alimentation en saccharose ou en saccharose Rhodamine B.

Placez les nymphes femelles en petits lots de 40 à 50 par cage. À l’émergence des imagos, vérifiez la présence de moustiques mâles dans les cages. Pour préparer la solution de saccharose à 0,2% de rhodamine B, dissoudre 200 milligrammes de poudre de rhodamine B pour chaque 100 millilitres de solution de saccharose à 10%.

Bien mélanger pour s’assurer que toute la poudre est dissoute. Préparez 20 bouteilles d’alimentation en sucre avec une mèche. Ajouter 10 millilitres de saccharose à 10 % dans 10 biberons et 10 millilitres de solution de saccharose de rhodamine B à 0,2 % pour les 10 autres biberons.

Placez cinq biberons dans chaque cage mâle préparée et laissez les moustiques mâles se nourrir pendant trois jours avant l’expérience d’accouplement. Allumez la lampe à brûleur au mercure et le stéréomicroscope. Laissez la source lumineuse de la lampe du brûleur au mercure se stabiliser pendant 10 minutes.

Ensuite, réglez les filtres de fluorescence pour la protéine de fluorescence rouge un. Aspirer un petit nombre de moustiques à la fois dans le tube de verre de l’aspirateur oral. À travers le tube de verre, observez le corps des moustiques mâles sous le stéréomicroscope fluorescent.

Utilisez uniquement des moustiques mâles marqués avec de la Rhodamine B pour l’expérience. Ensemble de transfert Un moustique mâle dans 12 gobelets en papier sécurisés avec un filet. Placez 10 moustiques mâles nourris au saccharose par tasse dans six tasses, et 10 moustiques mâles nourris au saccharose Rhodamine B par tasse dans les six autres tasses.

Répétez cette étape pour les moustiques mâles définis B. Installez 12 cages pour le test d’accouplement. Dans chacune des six cages, inclure 10 moustiques mâles A marqués Rhodamine B, 10 moustiques mâles non marqués B et 10 moustiques femelles vierges de type sauvage.

Dans les six autres cages, comprennent 10 moustiques mâles A non marqués, 10 moustiques mâles marqués Rhodamine B et 10 moustiques femelles vierges de type sauvage. Étiquetez ces cages pour distinguer clairement les deux combinaisons d’accouplement. Placez les tasses respectives des mâles dans les cages d’accouplement en fonction des étiquettes.

Retirez le filet et tapotez doucement la tasse pour bousculer les mâles hors de la tasse. Retirez soigneusement le gobelet en papier et le filet de la cage pour vous assurer qu’aucun moustique ne s’échappe de la cage. Laissez les moustiques mâles s’acclimater dans la cage d’accouplement pendant au moins une heure.

À l’aide d’un aspirateur oral, transférez les moustiques femelles vierges de type sauvage dans 12 gobelets en papier, chaque tasse contenant 10 moustiques. Après la période d’acclimatation pour les moustiques mâles, transférez une tasse de femelles dans chaque cage d’accouplement et retirez le filet. Bousculez doucement la tasse pour encourager les moustiques femelles restants hors de la tasse, puis retirez soigneusement le gobelet en papier et le filet de la cage pour vous assurer qu’aucun moustique ne s’échappe de la cage.

Laissez l’accouplement avoir lieu pendant trois heures, puis terminez l’expérience d’accouplement en retirant tous les moustiques de chaque cage avec un aspirateur mécanique. Anesthésiez à froid les moustiques sur la glace pendant au moins cinq minutes. Lorsque les moustiques sont complètement anesthésiés, ramassez doucement les moustiques femelles et rangez-les dans un gobelet en papier séparé sécurisé avec un filet.

Étiquetez le gobelet en papier en transférant l’étiquette correspondante de la cage d’accouplement sur le gobelet. Pour marquer les spermathèques femelles, anesthésiez à froid les moustiques femelles sur la glace pendant au moins cinq minutes avant la dissection au stéréomicroscope. Disséquez le moustique femelle au stéréomicroscope.

Examinez les spermathèques au microscope. Si la femelle n’est pas inséminée, les trois spermathèques seraient vides, et si elles sont inséminées, deux ou trois des spermathèques seraient remplies de spermatozoïdes mobiles. Pour les personnes inséminées, déterminez si les spermathèques contiennent du liquide séminal marqué Rhodamine B en les examinant au stéréomicroscope fluorescent équipé d’un filtre RFP1.

Si les spermathèques sont remplies de liquide séminal qui n’est pas marqué avec de la Rhodamine B, aucune fluorescence n’est observée. D’autre part, si la spermathèque contient du liquide séminal marqué Rhodamine B, il fluorescerait l’orange. L’objectif de ce test de compétitivité d’accouplement était de déterminer s’il pouvait y avoir une perte de capacité d’accouplement mâle après plusieurs générations de consanguinité.

Des triples expérimentaux du test de compétitivité d’accouplement ont été effectués et les données d’insémination sont présentées ici. Les femelles de type sauvage ont été inséminées par les mâles consanguins ou croisés, avec un marquage réciproque. Les résultats montrent que la proportion de femelles inséminées par les mâles consanguins ou croisés n’a pas été affectée par le marquage Rhodamine B.

Un pourcentage significativement plus élevé de femelles se sont accouplées avec les mâles croisés qu’avec les mâles consanguins dans les trois réplicants, ce qui indique que la consanguinité pourrait entraîner une perte de la condition physique d’accouplement. Il est important de préparer des cages supplémentaires de moustiques femelles. N’utilisez pas de moustiques femelles provenant d’une cage contaminée par des moustiques mâles, car des femelles pré-inséminées rendraient toutes les données invalides.

Outre le test de compétitivité de l’accouplement en laboratoire, cette procédure peut être utilisée dans les expériences de libération-recapture de marques pour étudier la biologie de l’accouplement des insectes, la dynamique des populations et leur dispersion.