Name: Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez un protocole optimisé pour générer des tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines sans acide rétinoïque. Cette méthode quantifie précisément la taille des corps embryonnaires et la densité de semis pour améliorer la reproductibilité et l'enrichissement en cônes.

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Cette étude a été soutenue par le National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), le Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), le Science & Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), la Natural Science Foundation (NSF) de Chine (81570874, 81970842), le programme Cent talents de l’Université Sun Yat-sen (PT1001010) et les Fonds de recherche fondamentale du State Key Laboratory of Ophthalmology.

1. Culture et expansion des CSEh
<ol><li>Culture HPSC
	<ol>
<li>Recouvrir deux puits d’une plaque de 6 puits avec matrice extracellulaire (ECM, matrice qualifiée hESC). Préparer 50 mL d’une solution ECM contenant 8-12 μg/mL d’ECM dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Dans 49 mL de DMEM, ajouter 1 mL de la solution mère ECM décongelée (50x). Ajouter 1 mL de la solution ECM à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C et 5% deCO2.</li>
		<li>Préparez le support d’entretien hPSC (MM) conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>Préchauffer MM à température ambiante (RT) pendant 30 min.</li>
		<li>Décongeler un flacon cryogénique de CSEh (hiPSC ou cSEh) (environ 1 x 106)d’un réservoir d’azote liquide par incubation dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 s.</li>
		<li>Sortez le flacon et désinfectez-le soigneusement à l’aide d’un spray d’alcool de désinfection à 75%. Mettez-le dans une armoire de biosécurité.</li>
		<li>Transférer la suspension de la cellule du flacon dans un tube de 15 mL, ajouter 5 mL de MM préchauffé goutte à goutte au tube à l’aide d’une pipette de 5 mL. Pendant ce temps, secouez doucement le tube pour mélanger les hPSCs .</li>
		<li>Centrifuger le tube à 170 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL et laissez derrière vous environ 50 μL de surnageant pour éviter de perdre les cellules.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de MM au tube et resuspendez la pastille en pipetant doucement de haut en bas une ou deux fois avec une pipette de 1 mL. REMARQUE: La survie des cellules individuelles des CSEh est faible. Les amas de petites cellules avec 3 à 5 cellules sont préférés pour maintenir la croissance des CSEh en colonies.</li>
		<li>Retirer l’ECM des puits pré-enduits (étape 1.1.1), ajouter 1,5 mL de MM à chaque puits, puis répartir 0,5 mL de suspension cellulaire par puits.</li>
		<li>Agiter doucement la plaque pour répartir uniformément les cSH, et mettre la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2. Ne déplacez pas la plaque pendant au moins 24 h pour favoriser l’adhérence cellulaire.</li>
		<li>Changez MM tous les deux jours et passez les hPSC lorsque la confluence a atteint environ 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage des CSEh REMARQUE: Le maintien de l’état indifférencié dans les HSPC est assez critique pour d’autres applications. Dans les conditions adhérentes, les CSEh poussent dans des colonies avec une frontière bien définie. Les cellules doivent être passées lorsque la confluence des CSEh atteint environ 80%.<ol>
<li>Observez les cellules au microscope. Marquez et retirez mécaniquement les cellules différenciées clairement visibles (<5%) avant le passage.</li>
		<li>Préparez la plaque revêtue d’ECM comme décrit à l’étape 1.1.1.</li>
		<li>MM préchauffé et 1x solution saline tampon phosphate (PBS) sans Ca2+ et Mg2+ à RT.</li>
		<li>Préchauffer la solution d’EDTA de 0,5 mM (dans 1x PBS) au bain-marie à 37 °C.</li>
		<li>Retirer le milieu de la plaque de culture à l’aide d’un système d’aspiration sous vide, ajouter 1 mL de 1x PBS dans chaque puits pour laver les cellules à l’aide d’une pipette de 1 mL et répéter deux fois.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution d’EDTA par puits pour dissocier les cSEh dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 min. Ne pas dépasser le temps d’incubation recommandé afin d’éviter la dissociation en cellules individuelles.</li>
		<li>Sortez la plaque et vérifiez le détachement des cellules au microscope. Les cSEh confluents se desserrent et chaque bordure cellulaire peut être vue, mais les cellules ne peuvent pas facilement se détacher en secouant doucement la plaque cellulaire.</li>
		<li>Retirer la solution d’EDTA à l’éventrion à l’éventrant d’une pipette de 1 mL et ajouter 1 mL de MM pour arrêter la dissociation. Pipettez doucement les hPSC une ou deux fois avec une pipette de 1 mL pour ressuspender les cellules. Il n’est pas nécessaire de centrifuger pour collecter les cellules. REMARQUE: Si la plupart des cellules se détachent de la plaque après l’incubation avec EDTA, les cellules peuvent être collectées par centrifugeuse.</li>
		<li>Retirer l’ECM des puits pré-enduits (étape 1.2.2) et ajouter 1,5 mL de MM par puits.</li>
		<li>Transférer 150 à 200 μL d’amas cellulaires à chaque puits. Généralement, les CSEh peuvent être adoptés dans un rapport de 1:6. Par exemple, les cellules d’un puits d’une plaque de 6 puits peuvent être distribuées à six nouveaux puits.</li>
		<li>Agitez doucement la plaque pour répartir uniformément les hPSC et culturez les hPSC dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 24 h sans toucher la plaque.</li>
		<li>Changez MM tous les deux jours comme décrit à l’étape 1.1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Différenciation rétinienne des CSEh
REMARQUE: Lorsque les colonies atteignent ~ 80% de confluence(Figure 1B),elles peuvent être guidées pour se différencier en organoïdes rétiniens en suivant le protocole schématisé dans la Figure 1A. Pour vous assurer que les hPSC ont une haute qualité et un bon rendement, évaluez régulièrement la pluripotence avec des marqueurs moléculaires tels que OCT4 ou NANOG en utilisant IFC ou QPCR. Les HPSC doivent être éliminés si les cellules différenciées représentent plus de 5 % du total des cellules. Vérifiez la contamination par les mycoplasmes à l’ide d’un kit de détection des mycoplasmes conformément aux instructions du fabricant. Utilisez uniquement des CSEh sans mycoplasmes, car les mycoplasmes peuvent modifier la capacité de différenciation des CSEh.
<ol><li>Préparer les supports et les réactifs
	<ol>
<li>Préparer le milieu d’induction neuronale (NIM) en mélangeant les éléments suivants : 500 mL de mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL de supplément de N2 à 1 %, 0,5 mL d’héparine à 0,1 % (2 mg/mL dans 1x PBS) et 5 mL d’acides aminés non essentiels (NEAA) à 1 % de MEM.</li>
		<li>Préparer un milieu de différenciation rétinienne (RDM) contenant 300 mL de DMEM/F-12, 200 mL de DMEM basique, 10 mL de supplément de B27 à 2 %, 5 mL d’antibiotique antimycotique à 1 % et 5 mL de NEAA MEM à 1 %. REMARQUE: Nim et RDM ne sont pas filtrés, mais un test de stérilité est effectué. Sortir 1 mL de milieu et l’ajouter dans un plat de 35 mm, et mettre en culture pendant 3 à 7 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Le support peut être stocké à 4 °C et doit être utilisé dans les 2 semaines pour assurer l’activité des composants.</li>
		<li>Préparez 10 mM de blébbistatine (1 000x) en DMSO. Ajouter 1 710 μL de DMSO pour dissoudre 5 mg de blébbistatine pour obtenir 10 mM de solution mère (1 000x), aliquote à 10 μL/tube, et conserver à -20 °C. REMARQUE: Tous les supports et réactifs doivent être réchauffés à RT pendant 30 minutes avant utilisation, sauf indication contraire.</li>
	</ol></li>
	<li>Formation du corps embryoïde (EB)
	<ol>
<li>Le jour 0 (J0), initiez la différenciation. Retirez un puits de cSEh d’une plaque de 6 puits, qui a atteint environ 80% de confluence. Prélever les cellules avec une solution de dissociation de l’EDTA comme décrit aux étapes 1.2.1 à 1.2.6.</li>
		<li>Retirer la solution d’EDTA, ajouter 1 mL de MM contenant 10 μM de blébbistatine pour arrêter la dissociation cellulaire et prélever les cellules avec une pipette de 1 mL. La taille des amas cellulaires est l’un des facteurs clés ayant un impact sur le rendement des CE. Environ cinq cellules par amas sont préférées pour produire la bonne taille d’ET sur D5 à D7. REMARQUE: Il s’agit d’une étape clé. Ne pipettez pas les cellules trop souvent, car les agrégats de type EB sont difficiles à former à partir de cellules individuelles de CSEh.</li>
		<li>Transférer la suspension cellulaire (environ 2 x 106 cellules) dans une boîte de Petri ultra-basse de 100 mm et ajouter 9 mL de MM contenant 10 μM de blébbistatine à la boîte.</li>
		<li>Agiter doucement le plat deux fois pour répartir uniformément les cellules, et mettre le plat dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.</li>
		<li>Sur D1, après que les cellules ont été cultivées pendant au moins 24 heures, sortez le plat et observez-le au microscope. Un grand nombre d’agrégats de petites cellules seront formés spontanément à ce moment-là(Figure 1C).</li>
		<li>Préparer 12 mL de mélange avec MM et NIM à un rapport de 3:1 (9 mL de MM et 3 mL de NIM) dans un tube de 15 mL.</li>
		<li>Transférer les cultures cellulaires dans un tube centrifuge de 15 mL avec une pipette de 10 mL perpendiculairement, et ajouter 10 mL du mélange préchauffé à la boîte.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 60 x g pendant 3 min pour recueillir les agrégats, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL et laisser derrière lui environ 500 μL pour éviter de perdre des cellules.</li>
		<li>Ajouter 2 mL du mélange dans le tube et transférer la suspension dans le même plat (étape 2.2.7).</li>
		<li>Secouez doucement le plat pour répartir uniformément les agrégats cellulaires et remettez le plat dans l’incubateur.</li>
		<li>Sur D2, préparer 12 mL d’un nouveau mélange avec MM et NIM à un rapport de 1:1 (6 mL de MM et 6 mL de NIM) dans un tube de 15 mL. Changer le milieu cellulaire avec le mélange fraîchement préparé en répétant les étapes de 2.2.5 à 2.2.10.</li>
		<li>Sur D3, changez le milieu cellulaire avec 15 mL de NIM comme décrit ci-dessus. Culturez les cellules pendant au moins 5 jours dans les conditions de suspension. REMARQUE: Pendant D1 à D3, le milieu doit être changé chaque jour, fournissant suffisamment de nutrition. Depuis D3, NIM peut être changé tous les deux jours. En outre, les AB peuvent être divisés en plusieurs plats pour fournir une nutrition abondante.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensemencez les ABE REMARQUE: Sur D5 à D7, choisissez un point de temps approprié pour plaquer les ET sur les plats revêtus d’ECM en fonction de la taille des ABE. Les CE d’un diamètre approximatif de 200 μm conviennent à la différenciation rétinienne. En général, un puits de CSEh dans une plaque de 6 puits peut produire environ 300 à 1 000 OE. La variation du rendement EB est variée par les lignes hPSC.<ol>
<li>Sur D4, préparez des plats enrobés d’ECM pour la culture adhérente des ER. Ajouter 5 mL d’ECM à chaque boîte de culture tissulaire de 100 mm (traitée en surface) et les mettre dans l’incubateur pendant la nuit.</li>
		<li>Sur D5, retirez l’ECM des plats pré-enrobés et ajoutez 10 mL de NIM préchauffé à chaque plat.</li>
		<li>Sortez le plat contenant des OE. Vérifiez la qualité des ÉBs au microscope et assurez-vous qu’ils sont assez brillants et de forme ronde. La taille des CE est d’environ 200 μm de diamètre. Collectez tous les CE dans un tube de 15 mL. Transférer les OE des plats dans un tube de 15 mL avec une pipette de 5 mL. Laissez les ABE s’installer pendant 5 min. Retirez la majeure partie du surnageant, en laissant derrière vous environ 2 mL de milieu.</li>
		<li>Répartir les CE dans les plats enduits contenant 10 mL de NIM goutte à goutte avec une pipette de 1 mL. Ensemencez les OE à une densité d’environ 2-3 EBs par cm2. Par exemple, ajoutez environ 120 à 180 OE dans un plat de 100 mm. Pour juger approximativement du nombre EB, placez une goutte de suspension EB sur un couvercle et comptez le nombre d’EB sous le microscope. REMARQUE: La densité de placage des EBs est l’un des facteurs clés ayant un impact sur l’efficacité de l’induction rétinienne. La densité peut également être ajustée par chaque ligne hPSC.</li>
		<li>Secouez doucement la vaisselle pour répartir uniformément les BOULE. Mettez-les dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2. REMARQUE: Ne déplacez pas les plats pendant au moins 24 heures pour améliorer l’adhérence des CE.</li>
	</ol></li>
	<li>Induction de vésicules optiques (VE) et d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans des conditions adhérentes REMARQUE: Une fois que les CE sont ensemencés sur la surface revêtue d’ECM, les hPSC peuvent développer des structures de type OV, qui peuvent être observées dès D20 après différenciation. Dans ce protocole, des facteurs de croissance spécifiques ou des molécules de signalisation ne sont pas nécessaires pour guider les CSEh dans le devenir rétinien, à l’exception de l’ajout de suppléments de N2 et de B27 dans le milieu.<ol>
<li>Sur D8-D9, retirez les paraboles et observez les ET au microscope. Tous les CE seront fixés et étalés sur les plats(Figure 1D). Ajouter 10 mL de NIM frais à chaque plat de 100 mm contenant 10 mL de vieux milieu. Remettez-les dans l’incubateur. REMARQUE: Ne supprimez pas l’ancien support.</li>
		<li>Sur D12, changer la moitié du milieu avec NIM à l’aide d’une pipette de 10 mL. Gardez la culture dans l’incubateur.</li>
		<li>Sur D16, retirez tous les NIM des plats à l’aide d’un système d’aspiration sous vide. Ajouter 20 mL de RDM à chaque plat. Continuez à cultiver en RDM et changez la moitié du support tous les deux jours.</li>
		<li>Au cours de D10-D30, observez les changements morphologiques des cellules deux fois par semaine au microscope et évaluez l’efficacité de la différenciation rétinienne. REMARQUE: Depuis D10, les domaines du champ oculaire (EF) sont auto-organisés dans les zones périphériques des ABE adhérents. Les structures de type OV apparaissent entre D20 et D25, dépassent progressivement de la parabole et s’auto-forment une coupe optique, qui est entourée par le RPE pigmenté(Figure 1E). Les OV peuvent être facilement reconnus avec l’anneau NR lumineux, réfractif et épais.</li>
	</ol></li>
	<li>Détacher et mettre en culture des OV et des EPR en suspension pour obtenir des organoïdes rétiniens (RO)
	<ol>
<li>Sur D28-D35, la plupart des OV apparaissent dans les plats. Utilisez une aiguille en tungstène ou une aiguille avec une seringue de 1 mL pour détacher mécaniquement les OV morphologiquement identifiables ainsi que l’EPR adjacent. Culturez-les en suspension. REMARQUE: L’apparence et le rendement des OV et des EPR varient considérablement selon les lignes hPSC. Ainsi, le point temporel de détachement ov et RPE est flexible. Les OV évidents avec le RPE adjacent peuvent être détachés, puis déplacés vers une boîte de culture à faible attachement contenant du RDM. Continuez à cultiver le reste des cellules jusqu’à ce que tous les OV et EPR soient soulevés.</li>
		<li>Placer 50 à 60 AV dans chaque boîte de culture à faible fixation de 100 mm contenant 15 mL de RDM pour la formation des RO (Figure 1F).</li>
		<li>Changez RDM tous les 2-3 jours jusqu’à D42, lorsque les DR sont bien ronds.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Développement et maturation de la rétine
REMARQUE: Dans ce protocole, le sérum est nécessaire pour maintenir les OR à croître et à mûrir pour une culture à long terme.
<ol><li>
Lamination rétinienne et spécification dans les RO
	<ol>
<li>Préparer 10 mL de taurine de 100 mM (1 000x) dans 1x PBS. Peser 125 mg de taurine et dissoudre dans 10 mL de 1x PBS. Filtrer la solution avec un filtre à seringue de 0,22 μm. Aliquote à 500 μL/tube et conserver à -20 °C.</li>
		<li>Préparer le milieu de culture rétinienne 1 (RC1). Mélanger les composants suivants : 250 mL de DMEM/F-12, 175 mL de DMEM basique, 50 mL de sérum bovin fœtal, 10 mL de supplément de B27 à 2 %, 5 mL d’antibiotique antimycotique à 1 %, 5 mL de NEAA MEM à 1 %, 0,5 mL de taurine 100 μM et 5 mL de L-alanyl-L-glutamine de 2 mM.</li>
		<li>Préparer le milieu de culture rétinienne 2 (RC2) contenant 450 mL de DMEM/F-12, 50 mL de sérum bovin fœtal, 5 mL de supplément de N2 à 1 %, 5 mL d’antimycotique antibiotique à 1 %, 0,5 mL de taurine à 100 μM, 5 mL de NEAA MEM à 1 % et 5 mL de L-alnyl-L-glutamine à 2 mM. REMARQUE: Les RC1 et RC2 ne sont pas filtrés, mais subissent un test de stérilité. Retirer 1 mL de milieu, l’ajouter à un plat de 35 mm et le mettre en culture pendant 3 à 7 jours dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2,pour assurer la stérilité avant utilisation. Le milieu peut être conservé à 4 °C et doit être utilisé dans les 2 semaines pour assurer l’activité des composants. Tous les supports et réactifs doivent être préchauffés à RT pendant 30 minutes avant utilisation.</li>
		<li>Sur D42, basculez le milieu de culture de RDM à RC1.</li>
		<li>Inclinez la vaisselle à environ 30° et laissez les GR s’installer pendant 30 s. Retirez l’ancien RDM avec une pipette de 10 mL laissant derrière lui environ 1 mL de milieu pour éviter de perdre des RO. Ajouter 15 mL de RC1 frais à chaque plat.</li>
		<li>Secouez doucement la vaisselle pour répartir uniformément les GR. Remettez la vaisselle dans l’incubateur. Changez l’ensemble du support deux fois par semaine par la suite.</li>
		<li>Pendant D50-D90, sélectionnez des R de haute qualité pour la culture à long terme, qui sont de forme ronde avec un NR épais et lumineux. Placez 30 à 40 RO dans un plat à fixation basse de 100 mm avec 20 mL de RC1 et changez le milieu entier deux fois par semaine.</li>
		<li>Pour la culture de suspension à long terme des RO, pipettez les RO pour éviter le rattachement RO-RO à l’aide d’une pipette. Transférez les RO vers de nouveaux plats de culture une fois par mois pour éviter que les RO ne collent à la surface des plats. REMARQUE: Dans les conditions de culture en suspension, les RO sont de forme ronde, avec un anneau NR brillant et épais attaché avec plus ou moins de RPE d’un côté. La rétine neurale stratifiée se développe et des sous-types de cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement avec des cellules ganglionnaires rétiniennes d’abord générées, suivies de cellules photoréceptrices, de cellules amacrines et de cellules bipolaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maturation des photorécepteurs humains avec enrichissement des cônes dans les RO
	<ol>
<li>Après D90, basculez le milieu de RC1 à RC2, ce qui convient à la maturation des photorécepteurs.</li>
		<li>Modifiez le support comme décrit aux étapes 3.1.7 à 3.1.8. REMARQUE: Dans cette condition de culture, les RO peuvent croître à long terme(Figure 1G),jusqu’à D300 testé. Les cellules rétiniennes dans les RO deviennent matures et tous les sous-types cellulaires de la rétine neurale, y compris les cellules gliales muller, les bâtonnets et les cônes, sont également acquis. Sans aucun ajout de PR, les photorécepteurs coniques sont également riches en OR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation%2C+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179(2019).</li>
<li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li>
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<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
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<li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li>
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<li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).</li>
<li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li>
<li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li>
<li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development%2C+survival%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li>
<li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
<li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li>
</ol>

Xiufeng Zhong est l’inventeur du brevet lié à la génération de cellules rétiniennes à partir de cellules souches pluripotentes humaines.

Dans ce protocole d’induction rétinienne en plusieurs étapes, les CSEh ont été guidés étape par étape pour gagner le destin rétinien et auto-organisés en organoïdes rétiniens contenant des NR et des EPR stratifiés. Au cours de la différenciation, les CSEh ont récapitulé toutes les principales étapes du développement rétinien humain in vivo,de l’EF, de l’OV et de l’EPR à la stratification rétinienne, générant tous les sous-types de cellules rétiniennes, y compris les cellules ganglionnaires rétiniennes, les cellu...

Les maladies dégénératives de la rétine (MR), telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinite pigmentaire (RP), sont caractérisées par le dysfonctionnement et la mort des cellules photoréceptrices et entraînent généralement une perte de vision irréversible sans moyens efficaces de guérir1. Le mécanisme sous-jacent à ces maladies est largement inconnu en partie en raison de l’absence de modèles de maladies humaines2. Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés en médecine régénérative grâce à la technologie des cellules souches. De nombreux chercheurs, y compris nous-mêmes, ont montré que les cellules souches pluripotentes humaines (CSEh), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSH), peuvent se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens par diverses approches de différenciation3,4,5,6,7,8,9,10, 11, offrant un énorme potentiel dans la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire12,13,14.
Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est très compliqué et prend beaucoup de temps avec une faible répétabilité, ce qui nécessite des chercheurs ayant une riche expérience et des compétences élevées. Au cours du processus d’induction complexe et dynamique, un certain nombre de facteurs auront un impact sur le rendement des tissus rétiniens15,16,17. En outre, les différentes méthodes d’induction varient souvent considérablement dans le temps et l’expression robuste des marqueurs rétiniens, ce qui pourrait confondre la collecte d’échantillons et l’interprétation des données3. Par conséquent, un protocole simple de différenciation rétinienne des CSEh avec un guidage étape par étape serait en demande.
Ici, sur la base de nos études publiées18,19,20,21, un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des organoïdes rétiniens (RO) avec des photorécepteurs coniques riches à partir de CSEh est décrit, ce qui ne nécessite pas le supplément d’acide rétinoïque (RA). Ce protocole se concentre sur la description de la méthode en plusieurs étapes pour générer la rétine neurale et l’EPR. La formation d’EB est la partie essentielle du stade précoce de l’induction. La taille et la densité de placage des CE sont quantitativement optimisées, ce qui améliore scientifiquement le rendement des tissus rétiniens et favorise la répétabilité. Dans la deuxième partie de l’induction, les vésicules optiques (VE) s’auto-organisent dans la culture d’adhérence et les RO se forment dans la culture de suspension; les parcours temporels et les gains d’efficacité de cette partie varient considérablement selon les lignes hPSC. La maturation et la spécification des cellules rétiniennes dans les OR se produisent principalement au stade moyen et tardif de l’induction. Sans l’ajout de PR, des photorécepteurs matures avec des cônes et des bâtonnets riches peuvent être produits.
Le but de ce protocole est de décrire quantitativement et de détailler chaque étape pour les chercheurs inexpérimentés à répéter. Diverses lignées de hPSC ont été induites avec succès dans les RO par ce protocole avec un rendement robuste de tissus rétiniens riches en cônes et une répétabilité élevée. Les RO dérivés des HPSC avec ce protocole peuvent récapituler les principales étapes du développement rétinien in vivoet survivre à long terme, ce qui facilite les applications en aval, telles que la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la thérapie cellulaire.

<table><tbody><tr><td>(&minus ;)-Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>Inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>1 ml pointes</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipette de 10 ml Pipette</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Culture tissulaire</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm Boîte de Pétri</td></tr><tr><td>100 mm Culture tissulaire</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm Boîte</td>de</tr><tr><td>Pétri 15 ml Tubes à centrifuger</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>Tubes à centrifuger</td></tr><tr><td>35 mm Boîtes de culture tissulaire</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm Boîte de Pétri</td></tr><tr><td>5 ml Pipette</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 50 ml Tubes à centrifuger</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>Tubes à centrifuger</td></tr><tr><td>6 puits Plaques de culture tissulaire</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Plaques de culture</td></tr><tr><td>Anti-AP2&alpha ; Anticorps</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>primaires&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiotique-Antimycotique</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Anticorps</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Primaire&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Primaire&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anti-L/M opsin</td><td>Anticorps cadeau du Dr jeremy</td><td>/</td><td>Primary&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anti-PAX6 Anticorps</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>Primaire&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin Anticorps</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>Primaire&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anticorps anti-rhodopsine Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>Primaire&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anti-mouton 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>Âne anti-Mouton IgG (H+L) Anticorps secondaire, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-SOX9 Anticorps</td><td>Abclonal</td><td>A19710</td><td>Primaire&nbsp ; anticorps</td></tr><tr><td>Anti-VSX2 Anticorps</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>Primaire&nbsp ; supplément d’anticorps</td></tr><tr><td>B-27 sans vitamine A (50X)</td><td>Supplément</td><td>Gibco 12587010</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de cryotube</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1,8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole dichlorhydrate ; fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco C11995500BT</td><td></td><td>Moyen</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>Moyen</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td> Filtre <td>à sérum</td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&mu ; m, filtre stérile Millex</td></tr><tr><td>GlutaMax, 100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanyl-L-glutamine</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>2 mg/ml dans PBS à utiliser</td></tr><tr><td>Matrigel, 100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrice extracellulaire (ECM)</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEM CELL</td><td>85850</td><td>milieu d’entretien hPSCs (MM)</td></tr><tr><td>N2 supplément</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Supplément Tampon salin tamponné au phosphate (PBS)</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>Sans Ca+,Mg+,PH7.2&plusmn ; 0.1 0.1M</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>Supplément</td></tr><tr><td>Boîtes de culture à très faible attachement Boîte de Pétri 100mm,</td> boîte de <td>Pétri</td> <td>Corning</td><td>CLS3262-20EA</td> à faible attachement</tr></tbody></table>

système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3d à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Les maladies dégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité irréversible sans traitement efficace. Les cellules souches pluripotentes qui ont le potentiel de se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens, sont très prometteuses pour les patients atteints de ces maladies et offrent de nombreuses possibilités dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Nous décrivons ici un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées, adaptés à diverses cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole est réalisé sans ajout d’acide rétinoïque, ce qui profite à l’enrichissement des photorécepteurs coniques. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne. Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera les applications en aval, telles que la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire.

Le processus d’induction rétinienne dans ce protocole imite le développement de la rétine fœtale humaine. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension pour induire la formation d’EBs. Sur D1, les agrégats cellulaires uniformes ou EBs se sont formés (Figure 1C). Le milieu de culture a été progressivement transféré en NIM. Sur D5, les ÉBs ont été plaqués sur les plats de culture enrobés d’ECM. Les cellules ont progressiveme...

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Ce protocole optimisé peut générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité élevée et sans frais. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne à partir de CSEh.Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire pour les maladies dégénératives rétiniennes. Pour démontrer la procédure, nous sommes avec Yuanyuan Guan, un doctorant, et Bingbing Xie, un technicien du laboratoire.Commencez par préparer 50 mL de solution ECM en ajoutant 1 mL de la troisième solution mère 50 fois à 50 mL de DMEM. Ensuite, ajoutez 1 mL de cette solution ECM préparée à chaque puits d’une plaque de six puits et incubez-la pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Préparez le support d’entretien hPSC conformément aux instructions du fabricant et préchassez-le à la température ambiante pendant 30 minutes.Versez un flacon cryogénique de CSEh à partir d’un réservoir d’azote liquide en l’incubant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes. Désinfectez-le soigneusement à l’aide d’un spray à 75% d’alcool et mettez-le dans une armoire de biosécurité. Transférer la suspension cellulaire du flacon dans un tube de 15 millimètres.Ensuite, ajoutez 5 mL de milieu d’entretien préchauffé goutte à goutte au tube à l’aide d’une pipette de 5 mL, tout en secouant doucement le tube pour mélanger les hPSC. Centrifugez le tube à 170 fois G pendant cinq minutes. Retirez soigneusement la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL, en laissant derrière vous environ 50 microlitres de surnageant pour éviter de perdre les cellules.Re-suspendez la pastille avec 1 mL de support d’entretien en pipetant de haut en bas. Retirez l’ECM des puits pré-enduits et ajoutez 1,5 millilitre de milieu d’entretien à chaque puits. Répartissez ensuite 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits.Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les hPSC. Mettez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 24 heures pour favoriser l’adhérence cellulaire. Changer de milieu tous les jours et passer les hPSC à 80% de confluence.Le jour 0, initiez la différenciation en retirant les cellules de confluence à 80% d’un puits de la plaque à six puits. Recueillir les cellules avec une solution de dissociation EDTA comme décrit dans le manuscrit textuel. Retirer la solution d’EDTA et ajouter 1 mL de milieu d’entretien contenant 10 fluvastatines micromolaires pour arrêter la dissociation cellulaire.Prélever les cellules avec une pipette de 1 mL. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Petri ultra-basse de 100 millimètres et ajouter 9 mL de milieu d’entretien contenant 10 fluvastatines micromolaires à la boîte. Secouez doucement le plat deux fois pour répartir uniformément les cellules.Ensuite, mettez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Une fois les cellules cultivées pendant au moins 24 heures, observez-les au microscope. Ajouter 9 mL de support d’entretien et 3 mL de NIM à un tube de 15 mL.Transférer les cultures cellulaires dans un tube centrifuge de 15 mL et ajouter 10 mL du mélange NIM préchauffé à la boîte. Centrifuger le tube à 60 fois G pendant 3 minutes pour recueillir les agrégats. Retirez ensuite le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL, en laissant derrière lui environ 500 microlitres pour éviter de perdre des cellules.Ajouter 2 mL du mélange dans le tube et transférer la suspension dans la même boîte de Pétri. Secouez doucement le plat pour répartir uniformément les agrégats cellulaires. Ensuite, remettez le plat dans l’incubateur.Le jour 5, retirez l’ECM des plats pré-enrobés et ajoutez 10 mL de NIM préchauffé à chaque plat. Sortez le plat contenant des Ebs et vérifiez la qualité des EB au microscope, en vous assurant qu’ils sont brillants et ronds. Recueillir tous les EBs dans un tube de 15 mL et les laisser se déposer pendant 5 minutes.Ensuite, retirez la majeure partie du surnageant, en laissant derrière vous environ 2 mL de milieu. Après avoir compté les BOULE, ensemencez-les goutte à goutte à une densité d’environ 2-3 BOULEs par centimètre carré dans des plats enrobés contenant 10 mL de NIM. Secouez doucement les plats pour répartir uniformément les BOULE et mettez-les dans l’incubateur pendant au moins 24 heures.Utilisez une aiguille en tungstène ou une aiguille avec une seringue de 1 mL pour détacher mécaniquement les vésicules optiques morphologiquement identifiables, ainsi que l’épithélium pigmentaire rétinien adjacent aux jours 28 à 35. Culturez-les en suspension. Mettez 50 à 60 vésicules optiques dans chaque boîte de culture à faible fixation de 100 millimètres, contenant 15 mL de RDM pour la formation d’organoïdes rétiniens.Changez le support tous les 2 à 3 jours jusqu’au jour 42. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension, qui ont formé des CE depuis le jour 1. Le jour 5, les ABE ont été plaquées sur les boîtes de culture revêtues d’ECM et les cellules ont progressivement migré hors des EBs.Le jour 16, le milieu d’induction a été remplacé par rdM, provoquant la formation des domaines neuronaux de la rétine et la saillie progressive de la boîte, ainsi que la formation de cellules de structures ressemblant à des vésicules optiques entourées de cellules RPE. Pendant les jours 28 à 35, organoïdes rétiniens constitués de la rétine neurale, attachés à une sphère RPE. D’un côté, des cellules se sont formées.Au fur et à mesure que la différenciation et la spécification de la rétine progressaient, les CSH produisaient des sous-types de rétine neurale qui s’alignaient progressivement en couches, imitant les caractéristiques architecturales d’une rétine humaine native. Les cellules ganglionnaires de la rétine ont d’abord été générées à partir de progéniteurs rétiniens et accumulées dans la face basale de la neuro-rétine. Avec ce protocole, les organoïdes rétiniens se sont développés en photorécepteurs très matures avec à la fois des bâtonnets et des cônes riches.Les cellules photoréceptrices étaient situées du côté apical, tandis que les cellules amacrines, les cellules horizontales, les cellules bipolaires et les cellules gliales muller étaient toutes situées dans la couche intermédiaire de la rétine neurale. Les points clés de ce protocole sont la création d’Ebs de haute qualité et leur ensemencement à la bonne densité.

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