Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier

Notre approche nous permet d’effectuer l’analyse quantitative d’une distribution d’Aspergillus fumigatus Conidia dans un poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier. Aspergillus fumigatus Conidia peut pénétrer dans les voies respiratoires et provoquer des maladies potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés. Les voies respiratoires des mammifères sont un système de voies respiratoires de différentes générations.

Chaque génération est caractérisée par les différentes structures des parois des voies respiratoires et des populations de cellules immunitaires. Dans les branches bronchiques, aspergillus fumigatus Conidia être éliminé par clairance mucociliaire. Cependant, dans l’espace disponible, la clairance mucociliaire ne fonctionne pas et les conidies doivent être éliminées par les cellules immunitaires, telles que les macrophages alvéolaires et les neutrophiles.

Tout comme les aspects spatio-temporels de la distribution des conidies dans les voies respiratoires sont importants. Cependant, question mal étudiée dans la compréhension des mécanismes de la maladie. Nous présentons ici une configuration expérimentale pour l’analyse quantitative de la distribution d’Aspergillus fumigatus Conidia dans les voies respiratoires de souris infectées.

J’applique 50 microlitres d’Aspergillus fumigatus Conidia étiqueté sur la souris. Six heures plus tard, récoltez le poumon. Fixer pendant la nuit dans 2% de formaldéhyde et tacher avec le conjugué de streptavidine étiqueté.

Soumettez ensuite l’échantillon à la clairière optique. Placez l’échantillon dans la bouteille en verre remplie d’une solution d’eau à 50% de méthanol et placez-le sur le mélangeur d’échantillons à température ambiante pendant une heure. Remplacez le méthanol à 50 % par du méthanol à 100 % et mettez-le sous le mélangeur d’échantillons pendant deux heures.

Préparez un mélange composé d’une partie d’alcool benzylique et de deux parties de benzoate de benzyle. Transférer l’échantillon sur une plaque de 24 puits et le recouvrir du mélange benzyl-benzoate pendant au moins 30 minutes. L’échantillon est prêt pour l’imagerie.

Déposer l’échantillon sur le porte-échantillon. Et placez le support dans le microscope. Après avoir allumé le système de microscope et ouvert le logiciel, allumez la lumière de transmission et sélectionnez un objectif X.

Localisez visuellement votre échantillon dans la lumière de transmission et passez à l’onglet d’acquisition. Sélectionnez le mode Lambda de microscopie laser confocale. Allumez les lasers appropriés.

Réglez la plage spectrale du détecteur et sélectionnez le miroir dichroïque. Ajustez le gain du détecteur et réduisez le sténopé à une unité de zone. Définissez la résolution des pixels sur 512 par 512.

Activez le mode zed-stack et démarrez l’imagerie en direct. Trouvez le plan focal où les deux dés sont visibles. Développez le panneau zed-stack.

À l’aide de la molette de mise au point, recherchez et sélectionnez les plans les plus bas et les plus hauts de l’échantillon. Placez le plan focal à côté du bas de l’échantillon. Désactivez le mode zed-stack et activez le mode de numérisation de numérotation.

Si nécessaire, ajustez la position X, Y et le nombre de tuiles. Activez les modes zed-stack et dial scan. Définissez l’étape de sectionnement zed sur cinq microns.

Définissez la vitesse de numérisation. Démarrez l’expérience. L’imagerie prend généralement plusieurs heures en fonction de la taille du terrain et de la vitesse de numérisation.

L’image obtenue est alors spectralement non mélangée. Pour le démélange spectral, utilisez l’option de démélange linéaire. Sélectionnez les régions correspondant aux zones terrestres étiquetées avec la streptavidine et les conidies.

Commencez à démélanger. Après avoir décomfondé, enregistrez le fichier non mixé. Pour découper des mosaïques à partir de l’image obtenue, ouvrez l’image.

Sélectionnez des méthodes, des coutures géométriques. Sélectionnez l’image dans la fenêtre de saisie. Dans les options d’assemblage, sélectionnez l’option Nouvelle sortie et mosaïque de fusion.

Utilisez le mode de référence avec le canal sélectionné correspondant à la fluorescence des voies respiratoires. Ouvrez l’image dans une vue 3D excédentaire. Si nécessaire, modifiez les couleurs utilisées pour leur présentation.

Ici, nous montrons le canal des voies respiratoires dans les tons gris et le canal Conidia en violet. Pour créer un masque des voies respiratoires, utilisez l’outil Ajouter une nouvelle surface. Sélectionnez le canal des voies respiratoires et choisissez le paramètre de lissage de 10 microns.

Divers filtres peuvent être utilisés pour exclure le signal des voies respiratoires. Tout d’abord, inspectez visuellement la surface et définissez le seuil d’intensité. Des filtres supplémentaires, comme la surface, peuvent également être appliqués sur certaines voies respiratoires, mais pas sur la plèvre ou les vaisseaux sanguins.

Ensuite, supprimez manuellement le fragment de surface sélectionné qui n’appartient pas aux voies respiratoires. Vous pouvez maintenant observer la surface créée et enquêter sur les pièces manquantes pour les corriger ultérieurement. Créez un masque pour la surface des voies respiratoires à l’aide des options d’édition et de masque de tout.

Sélectionnez le canal des voies respiratoires et définissez les cellules de travail à l’extérieur de la surface sur 0,001. Ici, nous avons montré le masque résultant en orange. Enregistrez le canal Conidia et le masque des voies respiratoires dans deux dossiers distincts, en tant que série T de F.

Ouvrez le fichier avec l’image du masque des voies respiratoires. Rendez l’image binaire. Suivez le processus binaire, faites binaire.

Pour ressembler à l’épaisseur du masque, appliquez plusieurs fonctions 3D dilatées. Suivez les plugins, traitez, dilatez la 3D. Pour ce faire, vous pouvez également utiliser la fonctionnalité des macros.

Après plusieurs cycles de processus de dilatation, utilisez la fonction de remplissage des trous. Suivez le processus, binaire, remplissez les trous. Pour remplir manuellement les trous résiduels dans le masque, ouvrez le gestionnaire de région d’intérêt.

suivre l’analyse, les outils, le gestionnaire de retour sur investissement. À l’aide de l’outil de sélection de polygones, sélectionnez une zone à remplir à une projection particulière. Faites-le plusieurs fois pour quelques projections dans zed-stack afin de pouvoir interpoler les formes des régions d’intérêt.

Pour interpoler les formes sélectionnées, sélectionnez-les toutes et appuyez sur d’autres, interpolez les retours sur investissement. Remplissez ensuite tous les ROI avec du blanc. Utilisez à nouveau la procédure de remplissage des trous.

Pour réassembler l’épaisseur du masque après avoir rempli les trous, appliquez la fonction 3D érodée. Suivez les plugins, traitez, érodez la 3D. Vous pouvez également utiliser des micros pour cela.

Le nombre d’itérations dans erode 3D et LA 3D doit être égal. Lancez l’application Conidia count. Appuyez sur le bouton Ajouter des fichiers et sélectionnez les dossiers contenant des fichiers DIFF avec le masque des voies respiratoires préparé et les images de fluorescence Conidia.

Définissez un seuil personnalisé entre zéro et un. Appuyez sur OK et voyez les résultats. En utilisant cette approche, nous effectuons l’analyse quantitative des conidies à l’intérieur et à l’extérieur de l’arbre bronchique des souris six heures après l’application de Conidia.

Les données suggèrent que lors de notre application originale, la majorité des Conidia pénètrent dans l’espace alvéolaire et y sont allouées au début de la réponse immunitaire inflammatoire. L’imagerie tridimensionnelle des poumons de souris avec microscopie confocale à balayage laser permet d’identifier Aspergillus fumigatus Conidia dans les voies respiratoires. Le traitement d’images tridimensionnelles à l’aide de ce protocole permet d’effectuer une analyse quantitative de la distribution des conidies à l’intérieur et à l’extérieur des branches bronchiques.

Notre approche peut également être utilisée pour estimer la cinétique de l’élimination des conidies à partir des souris et pour comparer la distribution anatomique des conidies chez les souris immunocompétentes et immunodéprimées. De plus, en utilisant cette approche, on peut analyser la distribution des microparticules ou des nanoparticules agglomérats dans les voies respiratoires.