Établissement et manipulation génétique d’organoïdes d’hépatocytes murins

Le foie est le plus grand organe chez les mammifères. Il joue un rôle très important dans le métabolisme et la désintoxication. Bien que le foie ait une capacité de régénération remarquable in vitro, c’est encore un très grand défi à long terme de cultiver des hépatocytes in vitro.

Ici, nous établissons les organoïdes des hépatocytes à partir d’hépatocytes matures. Il conserve les principales caractéristiques des hépatocytes dans la morphologie et la fonction. Dans cette vidéo, nous allons présenter comment cultiver et passer ces organoïdes et comment effectuer la modification génétique de ces organoïdes en détail.

Tout d’abord, la perfusion hépatique et la digestion. Préparez toutes les régions et les instruments et rendez-les stériles. Lavez la souris et ouvrez l’épiderme et la peau, puis essayez de trouver le four à poche du foie.

Injectez-y les aiguilles, puis capturez-les. Faites la perfusion à la vitesse de cinq millilitres par minute, jusqu’à ce que le foie devienne pâle. Changez-les dans le tampon de perfusion, placez-les soigneusement, surveillez le foie, jusqu’à ce qu’il devienne mou.

Habituellement, cela prend trois à cinq minutes, puis coupez le foie et mettez-les dans les assiettes, et coupez-les en petits morceaux avec les ciseaux. Pep it up and down fréquemment. Habituellement, il faut 10 à 15 minutes pour les transformer en cellule unique.

Et puis pepsez-le de haut en bas avec 10 à 15 minutes et nourrissez-les à travers le fitter. Transformez-les en cellules individuelles. Collectez toutes les cellules dans le tube de 50 millilitres, et centrifugez-les, avec la vitesse, puis collectez toutes les plaques par.

Essayez de les garder toujours dans la glace froide. Faites les suspensions à cellule unique et comptez-les avec le compteur de cellules. Habituellement, les hépatocytes s’ils sont heureux, ils ont le fluorescent vif.

La deuxième partie, nous essayons d’asseoir les cellules et de faire la culture organoïde. Nous recueillons toutes les suspensions de cellules, et comptons les cellules avec une certaine concentro-fusion Et puis nous mélangeons les. Metrogels. et le support de code.

Habituellement, nous prenons, avec le milieu et les métrogels, au rapport de 1 à 2 ou de 1 à 3. Après les avoir soigneusement mélangés, nous les asseyons sur les plaques de dégradé. Nous ajoutons généralement 100 microlitres au puits de 24 plaques.

Mettez-les dans l’incubateur à la température de 37 degrés. Après 20 minutes, nous les mettons en marche arrière avec le fond en bas puis au milieu. Avec deux ou trois jours de contre,, on voit généralement les organoïdes sortir.

C’est l’image typique de nos organoïdes. Nous avons généralement besoin de cellules individuelles d’organoïdes si nous voulons faire le passage ou faire une méthode de modification génétique Nous recueillons tous les organoïdes des plaques de contrepoids avec le tampon de lavage de la couche. Nous laissons tomber le surnageant, puis au tampon de lavage du manteau dans la plaque, mélangeons-les, alors pepsez-le de haut en bas.

Et puis nous pré-lavons généralement toutes les pointes avec le tampon des rubans de lavage. Pour éviter tous les organoïdes basculer sur les pointes. Et puis avec le, un nouveau lot sur glace ou sans glace, on collecte tous les organoïdes par centro-fusion.

Nous les traitons, il y a un conning radients pour enlever tous les métrogels. Après 20 à 30 minutes d’incubation sur glace, tous les métrogels sont retirés. Nous recueillons tous les organoïdes propres et ajoutons de la trypsine pour les transformer en cellules uniques.

Après l’ajout de trypsine, nous traitons les organoïdes dans l’incubateur. Il faut 5 à 10 minutes pour que les organoïdes du foie deviennent des cellules uniques. Nous ajoutons plus de tampons de lavage pour arrêter la triplatine.

Et puis peps de haut en bas vers eux. Pour le processus d’option, vous pouvez les laver une fois de plus pour enlever toute la trypsine. Après lavage par centrofusion, nous pouvons les compter sous le compteur de cellules.

Ensuite, nous montrerons comment faire la transaction ou la transfection de ces organoïdes d’hépatocytes. Tout d’abord, étiquetez les tubes de ce que vous allez faire, puis nous ferons la transfection de la vue selon les instructions du fabricant. Vous avez besoin, le régent de lipoyl fait apprivoiser INI MaX.

Nous ajoutons le. contrôler et le gène spécifique siRNA, et les incuber avec l’optimum, selon les instructions du fabricant. Et puis en fonction de la concentration cellulaire, nous ajoutons le RAN max et les mélangeons soigneusement.

Ensuite, nous ajoutons également le RAN max avec l’optimum séparément et les mettons sur la glace. Après 5 minutes, nous relançons séparément le mélange RAN max avec différents siRNA, le gène spécifique RANi et ii contrôle séparément et les mélangeons soigneusement. Remettez-les sur la glace, puis nous recueillons tous les organoïdes, ralentissons la centrofusion, laissons tomber tout le surnageant, nous ajoutons l’ARNi max, le mélange de siRNA dans cette plaque cellulaire et le dynamisons de haut en bas.

En bref, les cellules et le mélange d’ARNi max et de siRNA ont été gentrification et incubés pendant 4 à 5 heures à 37 degrés. Dernière partie, ces hépatocytes organoïdes pourraient également être infectés par le virus Lenti. Le message similaire a été effectué sous forme de transfection de siRNA.

Le contrôle et les tubes du virus siRNA étaient bien préparés, et l’optimum a été ajouté selon les instructions du fabricant. Ensuite, avec les régions d’infection comme poly green, puis nous ajoutons différents virus Lenti, selon la constitution des instructions du fabricant. Combinez les suspensions unicellulaires en culture organoïdes et diverses particules dans les tubes eppendorf de 1,5 millilitre, ajoutez, eh bien, mélangez-les Plaquer ce mélange, et concentrez-les pendant 1 heure à 32 degrés.

La fusion du concentré sera réalisée à 500 G.Et après 4 à 5 heures d’incubation à 37 degrés, la suspension cellulaire sera alors collectée et assise dans du métrogel. Et mettez-les à nouveau dans l’incubateur. L’organe sur l’efficacité de la formation ou une autre analyse fonctionnelle pourrait être effectuée 7 à 10 jours plus tard.

Voici nos résultats représentatifs. Dans la figure 1A, vous pouvez voir notre organoïde d’hépatocytes ALB-Cre Rosa 26-GFP ou RFP de souris. Dans la figure 1B, vous pouvez voir le signal positif Ki67 dans la coloration, qui a montré que nos organes hépatocytes prolifèrent.

Dans les figures 2A et 2B, voici une expression génique représentative de notre expression interférente de nos gènes. Après manipulation génétique dans les organoïdes des hépatocytes, l’interférence efficace est très efficace. Voici la figure 2C, vous pourriez voir après manipulation génétique avec la technologie carsonite dans nos organoïdes murins.

En conclusion, nos résultats ont montré que les organoïdes des hépatocytes pouvaient être élargis in vitro et manipulés génétiquement. En résumé, dans cette vidéo, nous montrons comment faire la perfusion hépatique et la digestion pour obtenir les hépatocytes. Comment capturer les hépatocytes et passer les organoïdes des hépatocytes.

Aussi, nous avons montré comment faire la transfection siRNA et vecteur ou l’infection par le virus Lenti pour faire la modification de la génétique de ces organoïdes. En outre, nous avons deux pénuries dans nos organoïdes. Tout d’abord, nous n’avons pas utilisé par noyau ou noyau de fourrure pour purifier les hépatocytes.

Et deuxièmement, je pense que plus de facteurs de croissance et de signalisation devraient être essayés pour améliorer le temps de croissance des organoïdes.