Analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre

Nos modèles et protocoles de cancer du foie du poisson zèbre offrent une occasion unique de visualiser in vivo, de manière non invasive, le microenvironnement hépatique et le paysage immunitaire à l’aide de la microscopie intravitale. La transparence des larves de poisson zèbre est sans aucun doute le principal avantage de ce système, qui nous permet d’effectuer une microscopie intravitale non invasive et de mieux comprendre le microenvironnement et l’infiltration de cellules immunitaires d’un tissu et d’un organe profonds, tels que le foie. Notre modèle néphrotique induit par l’alimentation et les techniques d’imagerie décrites dans ce protocole peuvent facilement être appliqués aux interactions alambiquées cellule-cellule dans d’autres maladies du foie ou domaines de recherche, y compris le syndrome métabolique et les maladies cardiovasculaires.

Cassia Michael, notre technicienne de laboratoire, et le Dr Francisco Juan Martinez-Navarro, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, pesez quatre grammes de nourriture sèche commerciale pour les larves de poisson zèbre dans deux béchers en verre de 25 millilitres, l’un pour l’alimentation normale et l’autre pour le régime riche en cholestérol à 10%, ou HCD. Pesez 0,4 gramme de cholestérol dans un bécher en verre de 10 millilitres et couvrez le bécher de papier d’aluminium.

Dans une hotte, mesurer cinq millilitres d’éther diéthylique à l’aide d’une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 20. Ensuite, ajoutez l’éther diéthylique au bécher de régime normal et mélangez-le immédiatement avec la nourriture sèche à l’aide d’une spatule. Mesurez encore cinq millilitres d’éther diéthylique à l’aide de la même seringue et de la même aiguille et ajoutez-les au bécher contenant du HCD.

Mélanger immédiatement en aspirant de haut en bas avec la seringue. Ajouter rapidement la solution de cholestérol au bécher HCD et mélanger immédiatement avec une spatule jusqu’à ce que la solution soit uniforme. Laissez les béchers dans le capot jusqu’à 24 heures pour évaporer complètement l’éther diéthylique.

Le lendemain, broyez les régimes en fines particules à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Transférez chaque régime dans un petit sac en plastique étiqueté ou un tube à centrifuger de 50 millilitres et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Installez des lignes de poissons transgéniques le jour moins un.

Le jour zéro, ramassez les œufs dans une passoire à mailles après le frai des poissons. À l’aide d’un flacon de lavage avec E3, rincez soigneusement les œufs et transférez-les soigneusement dans des boîtes de Petri de 10 centimètres avec un milieu E3. Nettoyez les plaques de tous les débris qui pourraient s’être accumulés dans les nichoirs, y compris les œufs morts ou non fécondés afin d’éviter la croissance incontrôlée de micro-organismes et les défauts de développement des larves qui en résultent.

Ensuite, divisez les œufs à une densité de 70 ou 80 œufs par plat contenant 25 millilitres d’E3. Le premier jour, vérifier et nettoyer les embryons morts ou présentant des défauts de développement sous une lunette de dissection équipée d’une base de transillumination. Le cinquième jour, mélanger les larves de tous les plats dans une boîte de Petri de 15 centimètres et ajouter E3 sans bleu de méthylène. Répartir les larves dans les boîtes d’alimentation et les nourrir comme décrit dans le manuscrit du texte.

Gardez les larves dans la salle du poisson zèbre ou dans un incubateur à 28 degrés Celsius dans un cycle sombre-lumière et nourrissez-les deux fois par jour du jour 5 au jour 12. Enlevez les débris alimentaires quotidiennement ainsi que 90 à 95% du milieu à l’aide d’un système de vide fixé à un embout de pipette d’un millilitre. Ensuite, versez soigneusement le nouvel E3 sans bleu de méthylène dans un coin de la boîte d’alimentation pour éviter d’endommager les larves.

Alternativement, les larves peuvent être divisées en réservoirs de trois litres avec de l’eau du système et placées en tant qu’unité système autonome avec un faible débit d’eau. Cette alternative permet d’économiser le temps nécessaire au processus de nettoyage quotidien et le système de filtration aide à garder les larves en bonne santé jusqu’au bout. Le jour 13, préparez les plats de collecte en fonction du nombre de conditions expérimentales qui ont été mises en place.

Versez suffisamment d’E3 sans bleu de méthylène pour couvrir le fond de chaque plat. Ensuite, avec précaution, à l’aide du système de vide, aspirez l’eau des boîtes d’alimentation. Lorsque le niveau d’eau commence à baisser, soulevez lentement la boîte d’alimentation pour faire nager les larves jusqu’à l’un des coins, puis aspirez dans la direction opposée.

Une fois qu’il ne reste qu’environ 20 à 30 millilitres de liquide, décanter soigneusement les larves dans la boîte de Petri de collection préparée et placer le ruban étiqueté de la boîte d’alimentation sur le couvercle de la boîte. Sur un stéréomicroscope à fluorescence, cribler les larves anesthésiées pour les marqueurs fluorescents souhaités. Ajoutez ensuite la tricaïne E3 dans les chambres du dispositif de blessure et de piégeage.

Enlevez les bulles d’air des chambres et du canal de retenue à l’aide d’une micropipette P-200. Retirez tout excès de tricaïne E3, en ne laissant que suffisamment de volume pour remplir les chambres. Ensuite, transférez une larve anesthésiée dans la chambre de chargement du dispositif de blessure et de piégeage et positionnez-la pour l’imagerie du lobe gauche à l’aide d’un outil de cils.

Imagez la morphologie de toutes les cellules nécessaires dans le foie sous un microscope confocal comme décrit dans le manuscrit du texte. Ouvrez le logiciel Fiji. Ouvrez ensuite le fichier image et cochez l’option Fractionner les canaux dans l’onglet Options d’importation de bioformat.

Après avoir créé des projections d’intensité maximale pour chaque canal, créez un retour sur investissement entourant le foie larvaire et mesurez la zone hépatique. Ensuite, ajoutez une barre d’échelle comme référence et créez un deuxième retour sur investissement comprenant la zone du foie et 75 micromètres de la zone environnante. Dans le menu Plugins, sélectionnez l’option Analyser suivie de Compteur de cellules et comptez les cellules immunitaires à l’intérieur de la zone de recrutement.

Notez le nombre de cellules immunitaires recrutées sur une feuille de calcul. Calculer les densités de neutrophiles, de macrophages et de lymphocytes T en normalisant le nombre de cellules immunitaires par région hépatique. Les larves de poisson-zèbre HCC nourries avec un régime alimentaire normal ne présentent pas de stéatose hépatique, telle que mesurée par la coloration Oil Red O.

Cependant, les larves de CHC nourries avec HCD montrent une augmentation significative de la stéatose hépatique. Après huit jours d’exposition à un surplus de cholestérol, une hypertrophie du foie a été observée chez les larves de CHC. Pour évaluer l’hépatomégalie, la zone du foie, la surface hépatique et le volume hépatique ont été évalués.

Dans le CHC associé à la stéatohépatite non alcoolique, la zone hépatocytes, ainsi que la zone nucléaire, et le rapport nucléaire/cytoplasmique ont augmenté. Une diminution significative de la circularité nucléaire a également été observée dans le groupe CHC nourri avec un régime riche en graisses. En utilisant le marqueur H2B-mCherry, une plus grande incidence de micronoyaux a été détectée chez les larves de CHC nourries avec HCD.

L’évaluation du système vasculaire hépatique a montré une augmentation significative de la densité des vaisseaux chez les larves de CHC nourries avec HCD. L’infiltration de macrophages et de neutrophiles s’est produite dans le CHC et le HCC nourris avec des larves de HCD. La quantification des neutrophiles dans les macrophages du foie et de son voisinage a montré une augmentation significative du nombre et de la densité des cellules chez les larves de CHC nourries avec HCD.

En revanche, une diminution significative de la densité des lymphocytes T en nombre total a été observée chez les larves de CHC nourries avec HCD. Le nettoyage des réservoirs et l’alimentation sont les étapes les plus importantes pour assurer la viabilité des larves et éviter le développement de stéatose ou de foie et d’inflammation chronique systémique chez les témoins en raison d’une mauvaise qualité de l’eau ou d’une mauvaise alimentation. D’autres méthodes telles que la microscopie accélérée et l’analyse de l’interaction entre les différentes cellules peuplant le foie peuvent être effectuées.

De plus, la recherche d’ARN unicellulaire de foies disséqués à différents stades du cancer du foie peut être effectuée pour comprendre pleinement comment le paysage immunitaire du foie évolue avec la progression de la maladie.