Name: Analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie intravitale non invasive pour analyser le microenvironnement hépatique et la composition des cellules immunitaires dans un modèle de carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez Danio rerio.

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L’auteur tient à remercier Clinton DePaolo et Spartak Kalinin, techniciens de l’Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility, pour leur assistance et leur entretien de nos lignées de poissons zèbres. FJMN est soutenu par le Cancer Research Institute et la Fibrolamellar Cancer Foundation.

<ol><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease-Related+Hepatocellular+Carcinoma%3A+A+Problem+of+Growing+Magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminals+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude.</a> Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
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<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+non-alcoholic+steatosis+to+steatohepatitis+and+fibrosis+parallels+cumulative+accumulation+of+danger+signals+that+promote+inflammation+and+liver+tumors+in+a+high+fat-cholesterol-sugar+diet+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).</li>
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<li>Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There+is+something+fishy+about+liver+cancer%3A+Zebrafish+models+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).</li>
<li>Goessling, W., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+important+tool+for+liver+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An important tool for liver disease research.</a> Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).</li>
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<li>de Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+modulates+innate+immune-mediated+inflammation+and+early+progression+of+NAFLD-associated+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+device+for+improved+experimental+manipulation+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+entrapment+device+for+imaging+live+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose+leads+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+that+is+reversed+by+mechanistic+target+of+rapamycin+%28mTOR%29+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition.</a> Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).</li>
<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+directly+induces+acute+inflammasome-dependent+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation.</a> Nature Communication. 5, 5864(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Avec une incidence accrue de CHC, en particulier de HCC induit par la NASH, il est très important de disposer de modèles plus efficaces pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le CHC associé à la NASH. La déconvolution des interactions cellule-cellule au niveau du foie est cruciale pour mieux comprendre la progression de la maladie hépatique et l’hépatocarcinogenèse. L’approche décrite dans ce protocole offre un moyen unique d’analyser la progression de la maladie hépatique in vivo et de manière non invasive.
La préparation du régime alimentaire est essentielle au succès de l’établissement d’un modèle de CHC associé à la NASH. Il est important de laisser l’éther diéthylique s’évaporer complètement à l’intérieur de la hotte pour éviter les effets nocifs, tout en préparant les régimes pour le poisson zèbre. Pour utiliser ces régimes avec des larves (5-12 jours après la fécondation), il est extrêmement important de broyer les régimes en particules fines pour assurer l’apport alimentaire par les larves. L’utilisation d’analogues d’acides gras marqués par fluorescence peut être utilisée pour évaluer l’apport alimentaire chez les larves.
Avant de placer les larves dans les boîtes de reproduction et de commencer la procédure d’alimentation, il est crucial de s’assurer que l’échantillonnage expérimental est uniformisé en mélangeant les larves de différentes plaques. Cette étape est importante car différents microenvironnements, à partir du jour 0, sont favorisés dans chacune des plaques et peuvent affecter la réponse inflammatoire.
Une autre étape importante consiste à compter les larves, pour savoir combien de nourriture est nécessaire pour chaque boîte d’alimentation. Si la quantité de nourriture n’est pas suffisante pour le nombre de larves présentes dans chaque boîte, l’un des deux scénarios se produira : 1) les larves seront sous-alimentées; 2) les larves seront suralimentées. Une alimentation inexacte conduira à des conditions malsaines associées à la malnutrition ou à la surnutrition, telles que l’inflammation, ce qui affectera considérablement le microenvironnement hépatique. Si une alimentation inexacte se produit, les larves présenteront des problèmes de mouvement. À ce stade de développement, les larves doivent nager intensivement, donc si des problèmes de mouvement sont remarqués, les larves ont été élevées dans des conditions malsaines (malnutrition ou exposition à des doses toxiques de cholestérol dues à une suralimentation). Pour cette raison, les procédures d’alimentation doivent être étroitement contrôlées pour les deux régimes, normaux et enrichis en cholestérol. Certains tests peuvent être effectués pour traiter rapidement de la précision de l’alimentation et de la santé des larves, y compris la présence d’hépatomégalie (taille du foie) et l’inflammation des tissus et des organes, en particulier le foie et l’intestin (infiltration accrue visible des neutrophiles et des macrophages).
Le nettoyage quotidien et le remplacement de 95% de l’E3 sont essentiels pour réduire la croissance des micro-organismes dans les boîtes d’alimentation et améliorer la santé et la survie des larves. Alternativement, les larves peuvent être placées dans un système de rack autonome. Pour de meilleurs résultats, placez 60 à 80 larves dans un réservoir de 3 litres. Maintenez le débit d’eau au minimum en ajustant le débit à un mode d’égouttement rapide et en nourrissant les larves 3-4 mg deux fois par jour (AM et PM). Le débit d’eau doit être vérifié régulièrement pour assurer un débit correct dans chaque réservoir. Dans notre laboratoire, cette méthode nous donne une survie de 95 à 100% avec une alimentation à court terme de 10% de HCD. De plus, cette méthode a considérablement réduit la charge de travail inhérente au nettoyage quotidien et à l’échange d’eau nécessaires dans le protocole d’alimentation statique décrit.
Alors que nous avons utilisé un régime enrichi en cholestérol à 10% pour induire la NASH dans une exposition à court terme (5 jours suffisent pour induire une stéatohépatite), des modifications du régime alimentaire peuvent être effectuées et étendues pour utiliser du fructose 18, des acides gras (tels que l’acide palmitique)19 ou des protocoles d’alimentation qui peuvent être étendus en utilisant un régime enrichi en cholestérol à 4%20. Actuellement, il existe peu de cibles thérapeutiques réussies pour le CHC et aucune pour la NASH. L’utilisation de modèles de poisson-zèbre offre une occasion unique d’élargir nos connaissances sur l’hépatocérogenèse mais aussi un système de vertébrés inégalé pour effectuer des criblages de médicaments à haut débit. Les techniques décrites dans ce protocole faciliteront les découvertes futures et les cibles thérapeutiques pour les maladies du foie et l’hépatocarcinogenèse.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer agressif avec des options thérapeutiques limitées. Il a été constaté que plus de 30% de tous les patients atteints de CHC sont obèses et ont NASH, une forme agressive de NAFLD 1,2,3,4. La consommation de régimes riches en calories augmente considérablement la disponibilité des acides gras qui provoque des changements métaboliques locaux et systémiques et déclenche la stéatose, les lésions hépatocytes, l’inflammation et la fibrose - toutes les caractéristiques clés de la NASH. La progression de la NASH vers le CHC implique l’accumulation de lipides dans le foie, ce qui déclenche une inflammation et une altération de la composition des cellules immunitaires 5,6,7. Il est particulièrement intéressant et important de comprendre comment le microenvironnement hépatique et le paysage des cellules immunitaires sont modifiés au cours de la progression de la maladie hépatique, et comment il change en raison de certains facteurs étiologiques. Pour mieux identifier l’impact de l’excès de cholestérol sur le microenvironnement hépatique et le paysage des cellules immunitaires, nous avons développé un modèle unique de poisson zèbre du CHC associé à la NASH. L’utilisation de ce modèle nous a permis de mieux comprendre l’impact de l’alimentation et de la surnutrition sur le microenvironnement hépatique et la progression de la maladie hépatique.
Les modèles de mammifères, tels que les échantillons de souris et de tissus humains, ont été essentiels pour comprendre la pathogenèse de la stéatohépatite et de la stéatose8. Les souris sont le modèle préféré pour les maladies du foie et le cancer, mais elles manquent de clarté optique au niveau cellulaire, tandis que les échantillons de tissus humains manquent souvent de l’environnement 3D que les modèles animaux sont capables d’imiter. Ces obstacles ont fait du poisson-zèbre un modèle puissant dans la communauté des chercheurs. Le poisson zèbre a des similitudes remarquables avec les humains, avec au moins 70% de conservation des gènes. Ils maintiennent le microenvironnement hépatique, la composition cellulaire hépatique, la fonction, la signalisation et la réponse aux blessures 9,10. En utilisant un régime riche en cholestérol (HCD) en combinaison avec un modèle établi de poisson zèbre transgénique de HCC, nous avons développé un modèle de poisson zèbre de HCC associé à la NASH.
Nous présentons ici un protocole expliquant comment générer un modèle de poisson-zèbre associé au CHC associé à la NASH et comment étudier le microenvironnement hépatique et traiter les caractéristiques de malignité précoce in vivo. En utilisant la microscopie confocale non invasive en combinaison avec des lignées transgéniques de poisson zèbre avec membrane et noyau d’hépatocytes marqués par fluorescence, nous pouvons traiter les caractéristiques de malignité précoce en analysant la morphologie du foie (surface, volume et surface), la morphologie cellulaire et nucléaire (zone des hépatocytes, zone nucléaire, rapport N:C, circularité nucléaire, score des micronoyaux / hernie nucléaire) et l’angiogenèse (densité des vaisseaux). Le microenvironnement des cellules immunitaires est également une caractéristique importante de l’hépatocarcinogenèse11,12,13,14, par conséquent, nous montrons également comment analyser la composition des cellules immunitaires hépatiques chez les larves de CHC associées à la NASH, en utilisant des lignées de poisson-zèbre transgéniques avec des cellules immunitaires marquées (neutrophiles, macrophages et cellules T). Les techniques décrites sont uniques au modèle et extrêmement utiles pour évaluer le microenvironnement hépatique et la composition des cellules immunitaires dans la progression de la maladie hépatique.

<table><tbody><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Facilement dégradé. Mémorisation -20&deg ;C.</td></tr><tr><td>Corning Netwells carrier kit 15 mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Corning Netwells inserts</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>Hautement volatile.</td></tr><tr><td>Pince Dumont #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4 % paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Golden Pearl Diet 5&ndash ; 50 nm Active Spheres</td><td>Saumure Crevettes Direct</td> <td>-</td> <td>N’importe quelle nourriture en poudre sèche commerciale pour les larves peut être utilisée.</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert graduées</td><td>Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack</td><td>Crystalgen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O solution 0,5 % isopropanol</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>Système de vide pour la collecte des larves</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M205 FCA THUNDER Imager Modèle Organisme Grand</td><td></td></tr><tr><td>disque rotatif Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>S9i avec base</td><td></td> transéclairée</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Programme de traitement d’images Java open-source.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>Bitplane ; Oxford Instruments.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Le cancer du foie est actuellement la troisième cause de décès lié au cancer dans le monde, et le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 75 à 90% de tous les cas de cancer du foie. Avec l’introduction de traitements efficaces pour prévenir et traiter l’hépatite B / C, la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et la forme plus agressive connue sous le nom de stéatohépatite non alcoolique (NASH) deviennent rapidement les principaux facteurs de risque de développer un CHC dans les sociétés modernes. Pour mieux comprendre le rôle de la NASH dans le développement du CHC, nous avons conçu un poisson-zèbre HCC associé à la NASH. La clarté optique et la traçabilité génétique des larves de poisson zèbre en font un modèle attrayant et puissant pour étudier le microenvironnement hépatique et la composition des cellules immunitaires à l’aide d’une imagerie fluorescente vivante non invasive. Ce protocole décrit comment utiliser un modèle de poisson-zèbre HCC associé à la NASH pour étudier l’effet du surplus de cholestérol dans le microenvironnement hépatique et son impact sur la composition des cellules immunitaires aux premiers stades de la maladie. Tout d’abord, nous nourrissons les larves de CHC (s704Tg), qui expriment la bêta-caténine activée spécifique des hépatocytes, avec un régime riche en cholestérol à 10% pendant 8 jours pour développer un modèle de CHC associé à la NASH. Nous décrivons ici comment utiliser différentes lignées transgéniques pour évaluer plusieurs caractéristiques de malignité précoce dans le foie par microscopie confocale non invasive, telles que la région du foie, la cellule et la morphologie nucléaire (zone des hépatocytes, zone nucléaire, rapport nucléaire: cytoplasmique (rapport N: C), circularité nucléaire, score des micronoyaux / hernie nucléaire) et angiogenèse. Ensuite, en utilisant des lignées transgéniques avec des cellules immunitaires marquées (neutrophiles, macrophages et cellules T), nous montrons comment analyser la composition des cellules immunitaires hépatiques chez les larves de CHC associées à la NASH. Les techniques décrites sont utiles pour évaluer le microenvironnement hépatique et la composition des cellules immunitaires aux premiers stades de l’hépatocarcinogenèse, mais elles peuvent également être modifiées pour étudier de telles caractéristiques dans d’autres modèles de maladies hépatiques.

En introduisant un régime riche en cholestérol à court terme dans un modèle de poisson zèbre de carcinome hépatocellulaire (CHC), qui surexprime une forme constitutivement active spécifique aux hépatocytes de bêta-caténine (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, nous sommes en mesure de créer un modèle de CMC associé à la NASH chez les vertébrés non-mammifères. La progression de la maladie hépatique peut être surveillée tôt en mesurant la stéatose hépatique, la taille du foie, l’hépatocytes, la morphologie nucléaire, l’angiogenèse et l’infiltration des cellules immunitaires (Figure 1).
Les larves de CHC nourries avec un régime alimentaire normal ne présentent aucune stéatose hépatique légère, mesurée par coloration Oil Red O. Cependant, les larves de CHC nourries avec un régime riche en cholestérol montrent une augmentation significative de la stéatose hépatique (Figure 2).
Un marqueur bien connu de la maladie du foie est l’hépatomégalie17. Pour évaluer la taille du foie, les larves de CHC peuvent être croisées avec une lignée transgénique exprimant spécifiquement un marqueur fluorescent sur les hépatocytes, tel que le Tg (fabp10a: H2BmCherry). Pour évaluer l’hépatomégalie, une évaluation de la zone hépatique (2D), de la surface hépatique et du volume hépatique (3D) est effectuée. Après 8 jours d’exposition à un surplus de cholestérol, une hypertrophie hépatique a été observée chez les larves de CHC (Figure 3).
En utilisant l’imagerie vivante non invasive, des lignées de poissons transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les membranes des hépatocytes (telles que Tg(fabp10a: Life-actin-EGFPP) et dans les noyaux d’hépatocytes (tels que Tg(Fabp10a: H2B-mCherry) peuvent être utilisées pour évaluer les altérations de la morphologie cellulaire et nucléaire associées à la malignité des hépatocytes. La surface hépatocytaire a été augmentée dans le HCC associé à la NASH (Figure 4A,B,D), ainsi que dans la zone nucléaire (Figure 4C,E) et le rapport nucléaire:cytoplasmique (Figure 4F). Une diminution significative de la circularité nucléaire a également été observée dans le groupe HCD+HCC (Figure 4G). La lipotoxicité déclenche des dommages à l’ADN, une caractéristique de la cancérogenèse en présence de micronoyaux. En utilisant le marqueur H2B-mCherry, nous avons observé une plus grande incidence de micronoyaux chez les larves de CHC nourries avec un régime riche en cholestérol (Figure 4H).
Le système vasculaire hépatique peut facilement être évalué dans des modèles de poisson zèbre à l’aide d’une ligne marquée transgénique, telle que Tg (kdrl:mCherry ou Tg(fli:EGFP), qui marquent le système vasculaire. Une augmentation significative de la densité des vaisseaux a été observée chez les larves HCC+HCD (figure 5).
Pour observer la réponse inflammatoire déclenchée au début du CHC associé à la NASH, une lignée de poissons transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et les neutrophiles, telles que Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP), a été croisée avec la lignée transgénique HCC. L’infiltration des neutrophiles et des macrophages se produit dans le CHC et le HCC nourris avec HCD, ce qui a été évalué par quantification du nombre et de la densité des neutrophiles/macrophages dans le foie et les environs (zone environnante jusqu’à 75 μm) (Figure 6A-H). Néanmoins, le HCC+HCD a montré une augmentation significative du nombre et de la densité des neutrophiles (figures 6F-H). 13 jours après la fécondation, le système immunitaire adaptatif est déjà fonctionnel. Utilisation d’une lignée de poissons transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans des cellules T, telles que Tg(lck: EGFP), et en combinaison avec la lignée transgénique HCC; nous avons évalué l’impact du surplus de cholestérol sur le recrutement des lymphocytes T dans le foie. Une diminution significative de la densité et du nombre total de lymphocytes T a été observée chez les larves de CHC nourries avec HCD (Figure 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lignées de poisson-zèbre transgénique</td>
			<td>Référence ZFIN</td>
			<td>Test</td>
		</tr><tr><td>Casper</td>
			<td>RoyA9; MitfaW2</td>
			<td>Osis de stéatose hépatique</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vénus / fabp10a:H2B-mCherry )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>Morphologie du foie</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vénus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>Hépatocytes et morphologie nucléaire</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Vénus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>Angiogenèse</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vénus;  mfap4:Tomate-CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>Recrutement de macrophages et de neutrophiles</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vénus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>Recrutement de lymphocytes T</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Lignées de poissons-zèbres transgéniques à utiliser dans différents essais.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre de larves</td>
			<td>Taille de la boîte d’alimentation</td>
			<td>Quantité de nourriture par jour (mg)</td>
			<td>Volume E3 (ml)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>Petit bac d’élevage</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>Petite/Grande boîte d’élevage</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>Grand bac d’élevage</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Configurer les conditions des boîtes d’alimentation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Phénotype</td>
			<td>Méthode de notation</td>
		</tr><tr><td>Aucun</td>
			<td>Noyaux normaux, pas de micronoyaux ou de hernie</td>
		</tr><tr><td>Douleur légère</td>
			<td>Faible nombre de micronoyaux (moins de 5 par champ de vision) et/ou hernie</td>
		</tr><tr><td>Modérée/sévère</td>
			<td>Nombre modéré à élevé de micronoyaux (plus de 5 par champ de vision) et/ou hernie</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Score des micronoyaux et des hernies nucléaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> Figure 1 : Diagramme de protocole résumant les principales étapes expérimentales et l’approche d’analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> Figure 2 : Essai de contrôle pour la stéatose hépatique - coloration ORO. Les larves de CHC ont été nourries avec un régime alimentaire normal ou riche en cholestérol et une coloration Oil Red O (ORO) a été effectuée pour évaluer la stéatose hépatique. (A) Schéma de la plaque de 12 puits pour effectuer une coloration ORO séquentielle à l’aide des inserts de puits en maille. (B) Image d’un outil de cils utilisé pour manipuler les larves. (C) Images représentatives de foies colorés au rouge huile; Larves HCC et HCC+HCD. (D) Graphique du chi carré montrant le pourcentage de larves présentant différents scores de stéatose hépatique. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives de la taille du foie. Des larves transgéniques de CHC exprimant un marqueur hépatique (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) ont été imagées en direct et de manière non invasive sur un microscope confocale à disque rotatif inversé à l’aide d’un zWEDGI. (A) Reconstitutions 3D représentatives du foie chez les larves HCC et HCC+HCD. (B-D) Graphique montrant les altérations morphologiques du foie, y compris la surface hépatique (B), la surface hépatique (C) et le volume hépatique (D) chez les larves CHC et HCC + HCD. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> Figure 4 : Images représentatives de la morphologie des hépatocytes et des noyaux. Des lignées transgéniques de CHC exprimant des protéines fluorescentes dans les membranes hépatocytes (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) et dans les noyaux d’hépatocytes (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) ont été imagées. (A-C) Reconstructions 3D représentatives des noyaux F-actine et hépatocytes des larves HCC et HCC+HCD. Les pointes de flèches ouvertes montrent des noyaux élargis; les pointes de flèches blanches montrent un noyau avec une forme modifiée; et les flèches rouges montrent des micronoyaux et une hernie nucléaire. (D-G) Graphiques montrant les moyennes des paramètres cellulaires et nucléaires chez les larves de HCC et HCC+HCD âgées de 13 jours. (D) Zone des hépatocytes. e) Domaine nucléaire. (F) Rapport nucléaire/cytoplasme. G) Circularité nucléaire. Chaque point représente des moyennes par larve. Les diagrammes à points montrent des graphiques ± chi carrés moyens MEB (H) montrant le pourcentage de larves avec un score différent des micronoyaux et de la hernie nucléaire. Barre d’échelle = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> Figure 5 : Images représentatives du système vasculaire hépatique. Lignées transgéniques de CHC exprimant des protéines fluorescentes dans des noyaux d’hépatocytes (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) et dans des cellules endothéliales (Tg)fli:EGFP)). (A) Reconstructions 3D représentatives du système vasculaire hépatique chez les larves HCC et HCC+HCD. (B-C) Graphique montrant l’indice de densité des vaisseaux par surface hépatique (B) volume (C) chez les larves de CHC et de HCC+HFCD. Les diagrammes à points montrent la moyenne ±SEM. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> Figure 6 : Images représentatives du paysage des cellules immunitaires du foie. Lignée transgénique de CHC exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et les neutrophiles (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) ou dans les lymphocytes T (Tg(lck-EGFP). (A, C, F) Reconstitutions 3D représentatives du foie et du recrutement leucocytaire dans la région hépatique chez des larves de CHC et HCC+HCD âgées de 13 jours. (B) Schéma de la zone hépatique imagée. (D-E) Graphique montrant la densité et le nombre de macrophages (D) dans la région hépatique chez les larves de CHC et de HCC + HCD. (G-H) Graphique montrant la densité et le nombre de neutrophiles (G) dans la région du foie chez les larves de CHC et de HCC + HCD. (G) Reconstructions 3D représentatives du recrutement des lymphocytes T dans la zone hépatique chez les larves CHC et HCC+HCD. (H-I) Graphique montrant la densité et le nombre de lymphocytes T (H) dans la région hépatique chez les larves de CHC et de HCC+HCD. Les diagrammes à points montrent la moyenne ±SEM. Barre d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Tableau des tampons et solutions <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ici, nous présentons comment générer un modèle de poisson zèbre associé à la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) associé au carcinome hépatocellulaire (CHC) pour étudier l’impact du surplus de cholestérol sur le microenvironnement hépatique et le paysage des cellules immunitaires.

Analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Nos modèles et protocoles de cancer du foie du poisson zèbre offrent une occasion unique de visualiser in vivo, de manière non invasive, le microenvironnement hépatique et le paysage immunitaire à l’aide de la microscopie intravitale. La transparence des larves de poisson zèbre est sans aucun doute le principal avantage de ce système, qui nous permet d’effectuer une microscopie intravitale non invasive et de mieux comprendre le microenvironnement et l’infiltration de cellules immunitaires d’un tissu et d’un organe profonds, tels que le foie. Notre modèle néphrotique induit par l’alimentation et les techniques d’imagerie décrites dans ce protocole peuvent facilement être appliqués aux interactions alambiquées cellule-cellule dans d’autres maladies du foie ou domaines de recherche, y compris le syndrome métabolique et les maladies cardiovasculaires.Cassia Michael, notre technicienne de laboratoire, et le Dr Francisco Juan Martinez-Navarro, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, pesez quatre grammes de nourriture sèche commerciale pour les larves de poisson zèbre dans deux béchers en verre de 25 millilitres, l’un pour l’alimentation normale et l’autre pour le régime riche en cholestérol à 10%, ou HCD. Pesez 0,4 gramme de cholestérol dans un bécher en verre de 10 millilitres et couvrez le bécher de papier d’aluminium.Dans une hotte, mesurer cinq millilitres d’éther diéthylique à l’aide d’une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 20. Ensuite, ajoutez l’éther diéthylique au bécher de régime normal et mélangez-le immédiatement avec la nourriture sèche à l’aide d’une spatule. Mesurez encore cinq millilitres d’éther diéthylique à l’aide de la même seringue et de la même aiguille et ajoutez-les au bécher contenant du HCD.Mélanger immédiatement en aspirant de haut en bas avec la seringue. Ajouter rapidement la solution de cholestérol au bécher HCD et mélanger immédiatement avec une spatule jusqu’à ce que la solution soit uniforme. Laissez les béchers dans le capot jusqu’à 24 heures pour évaporer complètement l’éther diéthylique.Le lendemain, broyez les régimes en fines particules à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Transférez chaque régime dans un petit sac en plastique étiqueté ou un tube à centrifuger de 50 millilitres et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Installez des lignes de poissons transgéniques le jour moins un.Le jour zéro, ramassez les œufs dans une passoire à mailles après le frai des poissons. À l’aide d’un flacon de lavage avec E3, rincez soigneusement les œufs et transférez-les soigneusement dans des boîtes de Petri de 10 centimètres avec un milieu E3. Nettoyez les plaques de tous les débris qui pourraient s’être accumulés dans les nichoirs, y compris les œufs morts ou non fécondés afin d’éviter la croissance incontrôlée de micro-organismes et les défauts de développement des larves qui en résultent.Ensuite, divisez les œufs à une densité de 70 ou 80 œufs par plat contenant 25 millilitres d’E3. Le premier jour, vérifier et nettoyer les embryons morts ou présentant des défauts de développement sous une lunette de dissection équipée d’une base de transillumination. Le cinquième jour, mélanger les larves de tous les plats dans une boîte de Petri de 15 centimètres et ajouter E3 sans bleu de méthylène. Répartir les larves dans les boîtes d’alimentation et les nourrir comme décrit dans le manuscrit du texte.Gardez les larves dans la salle du poisson zèbre ou dans un incubateur à 28 degrés Celsius dans un cycle sombre-lumière et nourrissez-les deux fois par jour du jour 5 au jour 12. Enlevez les débris alimentaires quotidiennement ainsi que 90 à 95% du milieu à l’aide d’un système de vide fixé à un embout de pipette d’un millilitre. Ensuite, versez soigneusement le nouvel E3 sans bleu de méthylène dans un coin de la boîte d’alimentation pour éviter d’endommager les larves.Alternativement, les larves peuvent être divisées en réservoirs de trois litres avec de l’eau du système et placées en tant qu’unité système autonome avec un faible débit d’eau. Cette alternative permet d’économiser le temps nécessaire au processus de nettoyage quotidien et le système de filtration aide à garder les larves en bonne santé jusqu’au bout. Le jour 13, préparez les plats de collecte en fonction du nombre de conditions expérimentales qui ont été mises en place.Versez suffisamment d’E3 sans bleu de méthylène pour couvrir le fond de chaque plat. Ensuite, avec précaution, à l’aide du système de vide, aspirez l’eau des boîtes d’alimentation. Lorsque le niveau d’eau commence à baisser, soulevez lentement la boîte d’alimentation pour faire nager les larves jusqu’à l’un des coins, puis aspirez dans la direction opposée.Une fois qu’il ne reste qu’environ 20 à 30 millilitres de liquide, décanter soigneusement les larves dans la boîte de Petri de collection préparée et placer le ruban étiqueté de la boîte d’alimentation sur le couvercle de la boîte. Sur un stéréomicroscope à fluorescence, cribler les larves anesthésiées pour les marqueurs fluorescents souhaités. Ajoutez ensuite la tricaïne E3 dans les chambres du dispositif de blessure et de piégeage.Enlevez les bulles d’air des chambres et du canal de retenue à l’aide d’une micropipette P-200. Retirez tout excès de tricaïne E3, en ne laissant que suffisamment de volume pour remplir les chambres. Ensuite, transférez une larve anesthésiée dans la chambre de chargement du dispositif de blessure et de piégeage et positionnez-la pour l’imagerie du lobe gauche à l’aide d’un outil de cils.Imagez la morphologie de toutes les cellules nécessaires dans le foie sous un microscope confocal comme décrit dans le manuscrit du texte. Ouvrez le logiciel Fiji. Ouvrez ensuite le fichier image et cochez l’option Fractionner les canaux dans l’onglet Options d’importation de bioformat.Après avoir créé des projections d’intensité maximale pour chaque canal, créez un retour sur investissement entourant le foie larvaire et mesurez la zone hépatique. Ensuite, ajoutez une barre d’échelle comme référence et créez un deuxième retour sur investissement comprenant la zone du foie et 75 micromètres de la zone environnante. Dans le menu Plugins, sélectionnez l’option Analyser suivie de Compteur de cellules et comptez les cellules immunitaires à l’intérieur de la zone de recrutement.Notez le nombre de cellules immunitaires recrutées sur une feuille de calcul. Calculer les densités de neutrophiles, de macrophages et de lymphocytes T en normalisant le nombre de cellules immunitaires par région hépatique. Les larves de poisson-zèbre HCC nourries avec un régime alimentaire normal ne présentent pas de stéatose hépatique, telle que mesurée par la coloration Oil Red O.Cependant, les larves de CHC nourries avec HCD montrent une augmentation significative de la stéatose hépatique. Après huit jours d’exposition à un surplus de cholestérol, une hypertrophie du foie a été observée chez les larves de CHC. Pour évaluer l’hépatomégalie, la zone du foie, la surface hépatique et le volume hépatique ont été évalués.Dans le CHC associé à la stéatohépatite non alcoolique, la zone hépatocytes, ainsi que la zone nucléaire, et le rapport nucléaire/cytoplasmique ont augmenté. Une diminution significative de la circularité nucléaire a également été observée dans le groupe CHC nourri avec un régime riche en graisses. En utilisant le marqueur H2B-mCherry, une plus grande incidence de micronoyaux a été détectée chez les larves de CHC nourries avec HCD.L’évaluation du système vasculaire hépatique a montré une augmentation significative de la densité des vaisseaux chez les larves de CHC nourries avec HCD. L’infiltration de macrophages et de neutrophiles s’est produite dans le CHC et le HCC nourris avec des larves de HCD. La quantification des neutrophiles dans les macrophages du foie et de son voisinage a montré une augmentation significative du nombre et de la densité des cellules chez les larves de CHC nourries avec HCD.En revanche, une diminution significative de la densité des lymphocytes T en nombre total a été observée chez les larves de CHC nourries avec HCD. Le nettoyage des réservoirs et l’alimentation sont les étapes les plus importantes pour assurer la viabilité des larves et éviter le développement de stéatose ou de foie et d’inflammation chronique systémique chez les témoins en raison d’une mauvaise qualité de l’eau ou d’une mauvaise alimentation. D’autres méthodes telles que la microscopie accélérée et l’analyse de l’interaction entre les différentes cellules peuplant le foie peuvent être effectuées.De plus, la recherche d’ARN unicellulaire de foies disséqués à différents stades du cancer du foie peut être effectuée pour comprendre pleinement comment le paysage immunitaire du foie évolue avec la progression de la maladie.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Pour aider à évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération biliaire du foie due au poisson-zèbre, nous avons établi un modèle de lésion hépatique dans lequel les hépatocytes exprimant la nitroréductase sont génétiquement ablatés lors d’un traitement au métronidazole.  Dans ce protocole, nous décrivons comment manipuler, surveiller et analyser habilement l’ablation des hépatocytes et la régénération hépatique induite par les voies biliaires.

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

Une fibrose soutenue avec dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire conduit à la cirrhose. L’abus d’alcool est l’une des principales causes de maladies graves du foie. Nous avons établi un modèle de foie fibrotique de poisson-zèbre induit par l’éthanol pour étudier les mécanismes et les stratégies de promotion de la régénération des hépatocytes lors de lésions induites par l’alcool.

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Les poissons-zèbres sont en train de devenir un modèle précieux de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Il décrit des protocoles d’alimentation des larves riches en lipides, l’imagerie en direct d’analogues lipidiques fluorescents alimentaires et la quantification de l’apport alimentaire. Ces techniques peuvent être appliquées à une variété de techniques de dépistage, d’imagerie et d’enquête basée sur des hypothèses.

Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire

Ce protocole décrit des analyses histologiques des foies provenant de larves de poissons zèbres qui ont été traitées avec 2% d'éthanol pendant 24 h. Un tel traitement aigu de l'éthanol entraîne une stéatose hépatique et un gonflement du système vasculaire hépatique.

Analyses histologiques de lésions hépatiques alcooliques aiguës dans le poisson zébré

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Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

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