Name: Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez l'analyse de la phagocytose de Leishmania par microscopie confocale et transfection de cellules THP-1. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-parasite et le recrutement protéique aux vacuoles parasitophores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions l’Institut Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brésil et le département de microscopie pour leur aide. Ce travail a été soutenu par INOVA-FIOCRUZ numéro 79700287000, P.S.T.V. détient une subvention pour la productivité dans la recherche du CNPq (305235/2019-2). Les plasmides ont été aimablement fournis par Mauricio Terebiznik, Université de Toronto, CA. Les auteurs tiennent à remercier Andris K. Walter pour la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.

Les cellules ont été obtenues à partir de donneurs sains après l’approbation des procédures par les comités nationaux d’éthique de la recherche (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultures cellulaires
<ol><li>Macrophages dérivés de monocytes humains NOTE: Pour obtenir des macrophages dérivés de monocytes humains pour la différenciation in vitro en macrophages, prélever du sang de donneurs sains et purifier les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme décrit par D. English et B. R. Andersen21.<ol><li>Après avoir recueilli le sang périphérique (50 mL), versez-le dans un tube hépariné, puis diluez le sang 1:1 dans une solution tampon phosphate (PBS) à température ambiante. Placer délicatement le sang hépariné dilué sur le milieu de gradient de densité préalablement réparti.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 252 × g pendant 30 min à 24 °C pour éviter l’hémolyse. REMARQUE: Réglez la rupture de la centrifugeuse pour éviter le mélange des couches de gradient. Après centrifugation, des couches de gradient discontinues sont formées de bas en haut : érythrocytes, milieu de gradient de densité, cycle PBMC et plasma.</li>
		<li>Transférer l’anneau PBMC, situé entre le milieu de gradient de densité et les couches de plasma, dans un nouveau tube et remplir de PBS pour éliminer l’excès de milieu de gradient de densité.</li>
		<li>Laver les cellules une fois et centrifuger à 190 × g pendant 10 min à 4 °C.</li>
		<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu RPMI complet.</li>
		<li>Compter les cellules et plaquer 2 × 106 cellules dans 500 mL du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté en 25 mM d’acide N-[2-hydroxyéthyl]pipérazine-N′-[2-éthane sulfonique] (HEPES), 2 g/L de bicarbonate de sodium, 2 mM de glutamine, 20 g/mL de ciprofloxacine et 10 % de sérum fœtal bovin inactivé (FBS) (milieu RPMI complet) pendant 7 jours à 37 °C sous 5 % de CO2 dans une plaque de 24 puits pour permettre aux monocytes de se différencier en macrophages par adhérence.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultures THP-1<ol><li>Cultiver la lignée cellulaire THP-1 à une concentration de 2 × 105 cellules dans 10 mL de milieu RPMI complet dans une fiole de culture de 75 cm2 .</li>
		<li>Maintenir les cultures cellulaires dans un incubateur à 37 °C sous 5% de CO2 pendant 7 jours.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 720 × g pendant 10 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans un milieu RPMI complet.</li>
		<li>Compter les cellules dans une chambre de Neubauer.</li>
		<li>Cellules en plaques sur lamelles de verre de 13 mm à une concentration de 2 × 105 cellules par puits dans 500 μL de milieu RPMI complet contenant 100 nM d’acétate de myristate de phorbol (PMA) à 37 °C sous 5% de CO2 pour permettre la différenciation des cellules THP1 en macrophages.</li>
		<li>Après trois jours, laver deux fois les cellules avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer le milieu contenant de la PMA.</li>
		<li>Incuber des cellules THP-1 différenciées dans un milieu RPMI complet sans PMA à 37 °C sous 5% de CO 2 pendant2 jours supplémentaires avant de commencer l’expérimentation.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultures de parasites et coloration rouge CellTracker
REMARQUE: Pour visualiser les parasites par microscopie à fluorescence, effectuez une coloration à l’aide du colorant fluorescent rouge CellTracker (CMTPX). Alternativement, d’autres marqueurs, y compris la carboxyfluorescéine, peuvent être utilisés conformément aux instructions du fabricant ou des promastigotes exprimant de manière constitutive GFP, RFP ou d’autres gènes rapporteurs fluorescents. Les parasites utilisés pour infecter les cellules sont ceux en phase stationnaire de croissance obtenus à partir d’une culture axénique promastigote ne dépassant pas 7 passages.
<ol><li>Cultiver Leishmania spp. promastigotes à 1 x 10 5 parasites par 1 000 μL de milieu dans une fiole de culture cellulaire contenant5 mL de milieu de Schneider supplémentés en gentamicine à 50 μg/mL et 10 % de FBS.</li>
	<li>Après avoir incubé des cultures axéniques de parasites dans une demande biochimique en oxygène (B.O.D.) à 24 °C, effectuer un comptage quotidien dans une chambre de Neubauer. Vérifiez la forme du parasite (mince, allongé) et la mobilité pendant 5 jours. Les parasites sont considérés comme en phase stationnaire de croissance lorsque deux comptages consécutifs avec 8 heures d’intervalle affichent des quantités similaires.</li>
	<li>Lorsque vous atteignez la phase stationnaire de croissance, incuber les parasites dans 4 mL de solution de NaCl à 0,9% avec 1 μM CMTPX pendant 15 min à 37 °C sous 5% de CO2 en évitant le contact avec la lumière.</li>
	<li>Ajouter FBS à une proportion de 1:1 et incuber la suspension du parasite pendant 1 minute supplémentaire.</li>
	<li>Laver les parasites trois fois avec du PBS, puis les centrifuger à 1 781 × g pendant 10 min.</li>
	<li>Suspendre la pastille parasitaire dans 1 000 μL de milieu complet RPMI.</li>
	<li>Comptez les parasites dans une chambre de Neubauer.</li>
</ol>3. Évaluation de la liaison de Leishmania aux macrophages
<ol><li>Graine 2 × 10cellules 5 THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 μL de milieu RPMI complet par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.</li>
	<li>Cultiver des cellules à 37 °C sous 5% de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% et incuber dans un milieu RPMI complet à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter des promastigotes en phase stationnaire tels que décrits par A. L. Petersen22 dans un rapport de 10:1 avec les plaques de puits, puis centrifuger à 720 × g pendant 5 min sous 4 °C.</li>
	<li>Incuber à 4 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Lavez les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer les promastigotes non internalisés.</li>
	<li>Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les lames de couverture avec 15 mMNH4Cl pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS 0,15 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber avec une solution bloquante (3% BSA dans PBS) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS, puis perméabiliser avec du PBS-Saponin à 0,15 % pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter la phalloïdine (diluée 1:1 200) pendant 1 h à température ambiante et protéger de la lumière.</li>
	<li>Montez les lamelles de recouvrement à l’aide d’un support de montage.</li>
	<li>Acquérir des images au moyen d’un microscope confocale à fluorescence à l’aide d’un objectif 63×/1,4.</li>
</ol>4. Évaluation de la phagocytose de Leishmania par les macrophages
<ol><li>Graine 2 × 10cellules 5 THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 μL de milieu RPMI complet par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.</li>
	<li>Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO2.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois dans une solution de NaCl à 0,9 % et incuber dans un milieu RPMI complet dans une plaque de 24 puits à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter la phase stationnaire Leishmania spp. comme décrit par A. L. Petersen22 à un rapport 10:1 (parasite:cellule hôte), puis centrifuger à 720 × g pendant 10 min sous 4 °C.</li>
	<li>Incuber les cellules à 4 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Lavez les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer les promastigotes non internalisés.</li>
	<li>Incuber les cellules dans un milieu RPMI supplémenté à 37 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min.</li>
	<li>Montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré.</li>
	<li>Compter pas moins de 400 cellules dans des champs aléatoires sous un microscope à fluorescence en utilisant un objectif de 100×/1,4.</li>
</ol>5. Évaluation de la maturation vacuole induite par Leishmania
NOTE: La transfection cellulaire THP-1 doit être effectuée comme décrit par M. B. Maess, B. Wittig et S. Lorkowski 23. Nous résumons ici ce protocole, avec un minimum de modifications. La nucléofection est une méthode de transfection spécifique qui nécessite un nucléofector. Comme méthode alternative, les cellules peuvent être transfectées en utilisant la lipofectamine24 et la transduction du lentivirus25.
<ol><li>Pour étudier la biogenèse de la PV induite par Leishmania, transfecter des cellules THP1 avec PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 ou Rab 728,29,31 plasmides. REMARQUE: Cette méthodologie peut être utilisée pour transfecter les cellules THP-1 avec d’autres gènes que ceux énumérés ci-dessus.</li>
	<li>Cellules THP-1 de semence à 1,5 x 107 dans 75 cm² de flacons de culture tissulaire contenant 10 mL de milieu RPMI complet supplémenté avec 100 ng/mL de PMA et 50 μM de 2-mercaptoéthanol pendant 48 h.</li>
	<li>Laver les cellules une fois dans une solution de NaCl à 0,9%.</li>
	<li>Détacher les cellules à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique et centrifuger (250 × g) pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Resuspendre les cellules THP-1 dans 1 mL de milieu RPMI et effectuer des comptages dans une chambre Neubauer.</li>
	<li>Centrifuger à nouveau les cellules THP-1 à 250 × g pendant 10 min à température ambiante. Jetez le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre 2 × 106 cellules dans 100 μL de solution de Nucleofector et incuber avec 0,5 μg du plasmide codant pour la protéine d’intérêt, marqué avec une protéine fluorescente.</li>
	<li>Transférer la suspension contenant des cellules THP-1 et de l’acide nucléique dans la cuvette Nucleofector.</li>
	<li>Transfect de cellules THP1 à l’aide du programme Nucleofector Y-001.</li>
	<li>Récupérer les cellules transfectées (2x106) et les ensemencer dans un milieu RPMI de 500 μL sur des plaques de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm (4 puits/transfection).</li>
	<li>Incuber les cellules THP-1 dans un milieu RPMI complet à 37 °C pendant 0,5, 2, 4, 6, 12 et 24 h.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.13 et 3.13.</li>
</ol>6. Évaluation du recrutement de LC3 à Leishmania spp. PVs
REMARQUE : Le marqueur membranaire autophagique LC3 peut être utilisé pour déterminer si les phagosomes présentent des caractéristiques autophagiques. Le recrutement de CL3 dans les PV induites par Leishmania peut être évalué pendant l’infection par immunomarquage des cellules avec l’anticorps anti-LC3, comme décrit précédemment par C. Matte32 et B. R. S. Dias33.
<ol><li>Semer 2 × 10cellules 5 THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans un milieu RPMI complet de 500 μL sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.</li>
	<li>Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO2.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois dans une solution de NaCl à 0,9% et incuber dans un milieu RPMI complet.</li>
	<li>Ajouter des promastigotes Leishmania spp. en phase stationnaire tels que décrits par A. L. Petersen22 dans un rapport de 10:1 (parasite: cellules hôtes) et centrifuger les cellules à 720 × g pendant 5 min sous 4 °C.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 30 min ou 4 h. Ensuite, lavez deux fois et fixez les cellules pour évaluer le recrutement de CL3 dans les membranes photovoltaïques induites par Leishmania aux premiers stades de l’infection.<ol><li>Alternativement, pour évaluer le recrutement de CL3 sur les membranes PV aux stades ultérieurs de l’infection, laver deux fois un autre groupe de macrophages à 4 h d’infection pour éliminer tous les promastigotes non internalisés. Incuber les cellules infectées dans un milieu RPMI complet pendant 12 h et 24 h supplémentaires, pour finalement laver deux fois et fixer. REMARQUE: Les cellules fixes peuvent être conservées dans une solution de PBS ou de NaCl à 0,9% à 4 °C jusqu’à l’étiquetage.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloquer et perméabiliser simultanément les cellules fixées dans 0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 20% de sérum de chèvre normal, 6% de lait en poudre écrémé et 50% de FBS pendant 20 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les cellules avec l’anticorps anti-LC3 (1: 200) dilué dans du PBS pendant 2 h à température ambiante. NOTE: En tant que contrôle négatif de l’immunomarquage, un groupe de cellules doit être incubé avec l’immunoglobuline G (IgG) de l’animal d’origine anticorps primaire à une concentration équivalente à celle utilisée pour l’anticorps primaire.</li>
	<li>Laver les cellules trois fois avec une solution de NaCl à 0,9% à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les cellules avec des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées AlexaFluor 488 (1:500) ou les anticorps secondaires conjugués à colorant fluorescent préféré pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les cellules trois fois avec une solution de NaCl à 0,9% à température ambiante.</li>
	<li>Montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré.</li>
	<li>Acquérir des images au microscope confocale à fluorescence à l’aide d’un objectif 63x/1,4.</li>
</ol>7. Acquisition de la microscopie confocale et quantification des Fidji
REMARQUE: L’acquisition d’images d’immunofluorescence doit être effectuée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Pour obtenir une meilleure résolution, utilisez un objectif 63x à immersion dans l’huile.
<ol><li>Laissez les lamelles de verre de 13 mm à température ambiante et protégez-les de la lumière au moins 30 minutes avant l’acquisition.</li>
	<li>Nettoyez les lamelles de couverture avec un mouchoir absorbant.</li>
	<li>Ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif et ajoutez la lame.</li>
	<li>Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’huile touche la glissière.</li>
	<li>Observez et ajustez la mise au point sur le microscope et choisissez l’objectif 63x avec huile.</li>
	<li>Ouvrez le programme Leica et ajustez les lasers dans les longueurs d’onde 488, 552 et 405.</li>
	<li>Sélectionnez la résolution de l’image 1 024 x 1 024.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Live , définissez la pile Z et appuyez sur l’option Commencer . Ensuite, recommencez et appuyez sur le bouton Fin . Nous recommandons 20 μm pour l’épaisseur de la tranche afin d’obtenir des images confocales avec de bonnes résolutions.</li>
	<li>Attendez l’acquisition de l’image, puis sélectionnez l’option « Projection maximale » dans les outils Leica.</li>
	<li>Enregistrez l’expérience.</li>
	<li>Exportez les images au format lif ou tiff vers un ordinateur et ouvrez le programme FIJI.</li>
	<li>Ouvrez l’expérience et définissez la pile de vues avec la pile hyper. Sélectionnez ensuite ouvrir les fichiers individuellement et assembler les tuiles.</li>
	<li>Sélectionnez l’outil mains libres dans la barre d’outils Fidji et tracez soigneusement la cellule à la main.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Analyser et mesurez pour visualiser l’intensité de fluorescence.</li>
	<li>Répétez ce processus à chaque cellule par groupe.</li>
	<li>Enregistrez les mesures et exportez-les vers un éditeur de tableur.</li>
	<li>Ajoutez ces données à un programme d’analyse statistique et effectuez l’analyse statistique.</li>
</ol>8. Analyse statistique
REMARQUE : Pour l’analyse des données et les graphiques, utilisez un programme d’analyse statistique.
<ol><li>Ouvrez le programme.</li>
	<li>Insérez les données obtenues et testez les paramètres de normalité.</li>
	<li>Pour les données avec une distribution normale, utilisez le test t de Student et pour les tests non paramétriques, le test de Mann-Whitney.</li>
	<li>Considérez les données présentant une différence statistiquement significative lorsque la valeur de p est inférieure à 0,05.</li>
	<li>Préparez des graphiques représentant les données, avec des mesures de tendance centrale (moyenne ou médiane) et des mesures de variation.</li>
</ol>

<ol><li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+leishmaniases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(2010).</li>
<li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li>
<li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania-macrophage+interactions%3A+multiple+receptors%2C+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li>
<li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+Leishmania+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li>
<li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li>
<li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+%28CR3%29+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li>
<li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li>
<li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+%28gp63%29+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li>
<li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li>
<li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation%3A+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li>
<li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li>
<li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li>
<li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li>
<li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li>
<li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li>
<li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li>
<li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response%3A+a+signaling+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li>
<li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li>
<li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496(2012).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960(2014).</li>
<li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li>
<li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li>
<li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li>
<li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li>
<li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li>
<li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li>
<li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li>
<li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li>
<li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690(2016).</li>
<li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA%2Fj-Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890(2018).</li>
<li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795(2014).</li>
<li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+and+phagocytosis%3A+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li>
<li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646(2017).</li>
<li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages%3A+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li>
</ol>

Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte ou l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs étapes qui peuvent influencer le développement de la maladie5. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction de Leishmania non opsonisée et des cellules hôtes, nous avons décrit un protocole qui utilise la microscopie confocale à fluorescence pour évaluer la phagocytose des stades précoces à avancés de l’infection à Leishmania. L’utilisation de techniques de fluoresce...

La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires du genre Leishmania, entraînant un large éventail de manifestations cliniques chez l’hôte vertébré, notamment la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la leishmaniose viscérale1. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que plus d’un milliard de personnes sont à risque, avec plus d’un million de nouveaux cas signalés chaque année2.
Les espèces du genre Leishmania sont des protozoaires intracellulaires obligatoires qui survivent à l’intérieur des cellules hôtes, y compris les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques3. L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs récepteurs de cellules hôtes et ligands parasitaires soit par interaction directe, soit par opsonisation impliquant les récepteurs du complément 4,5. Les récepteurs de surface classiques, tels que CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, récepteurs de type Toll et charognards, interviennent dans la fixation du parasite aux macrophages 6,7,8. Ces récepteurs reconnaissent les molécules à la surface de Leishmania, notamment la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) et le lipophosphoglycane glycolipidique (GPL)9. Ce sont les molécules les plus abondantes à la surface des promastigotes et jouent un rôle essentiel dans la subversion de la réponse immunitaire de l’hôte, favorisant l’établissement d’une infection parasitaire dans les cellules demammifères10. Une fois que les ligands de surface du parasite se lient aux récepteurs des macrophages, la F-actine s’accumule sur les surfaces cellulaires des mammifères, entourant les parasites au fur et à mesure qu’ils sont phagocytés. Par la suite, cela conduit à la formation d’un compartiment induit par le parasite appelé vacuole parasiphore (PV), qui présente des caractéristiques phagolysosomales11. Une fois à l’intérieur de ces phagolysosomes, les parasites subissent plusieurs altérations essentielles à la survie et à lamultiplication3.
La biogenèse des PV est un processus de trafic membranaire hautement réglementé essentiel à la survie intracellulaire de cet agent pathogène12. La formation de ce compartiment résulte d’événements de fusion séquentielle entre les phagosomes et les compartiments de la voie endocytaire de l’hôte. Des études classiques de biologie cellulaire ont révélé que la maturation des PV implique l’acquisition de protéines G monomères Rab 5 et Rab 7, qui sont principalement associées à une maturation précoce et tardive des endosomes, respectivement13. De plus, ces compartiments acquièrent les protéines membranaires associées aux lysosomes 1 et 2 (LAMP 1, LAMP 2), les principaux constituants protéiques de la membrane lysosomale et la protéine 1A/1B-light chain 3 (CL3) associée aux microtubules, un marqueur autophagosome14. Malgré des similitudes apparentes, la cinétique de formation de PV15,16 et la morphologie de ces compartiments varient selon les espèces de Leishmania. Par exemple, une infection causée par L. mexicana ou L. amazonensis induit la formation de grands compartiments contenant un grand nombre de parasites17. En revanche, d’autres espèces, comme L. braziliensis et L. infantum, forment des vacuoles plus petites qui ne contiennent normalement qu’un ou deux parasites dans chaque vacuole18.
Malgré cette connaissance de l’interaction entre la cellule hôte et la leishmanie, les événements initiaux déclenchés par le contact entre les récepteurs de l’hôte et les ligands du parasite n’ont pas été entièrement élucidés. Ces événements sont connus pour être des déterminants de l’issue de l’infection parasitaire et dépendent des espèces parasitaires, du type de récepteurs de la cellule hôte recrutés pour reconnaître les parasites et de l’activation des voies de signalisation des macrophages19,20. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les molécules impliquées dans la biogenèse des PV induites par Leishmania et de déterminer le(s) rôle(s) joué(s) par ces molécules dans l’établissement et l’issue de l’infection. Ici, nous décrivons une méthode de surveillance des événements précoces survenant au cours de la phagocytose de Leishmania, y compris la liaison, l’internalisation, la formation et la maturation des phagosomes. Ce travail pourrait aider à clarifier la participation de PLC, Akt, Rab5, Rab7 et LC3 dans la formation de PV induite par différentes espèces de Leishmania. Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour étudier la participation d’autres protéines impliquées dans la maturation PV. Les études futures élargiront les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l’interaction Leishmania-cellule hôte et contribueront à la conception de nouvelles stratégies chimiothérapeutiques.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Chèvre conjuguée anti-lapin IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Tem varios no site</td><td></td></tr><tr><td>anti-LC3 Anticorps</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-1384</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rouge (CMTPX) Colorant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Centr&iacute ; fuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacine</td><td>Isofarma</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à fluorescence (Leica SP8)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence (Olympus Lx73)</td><td>Olympus</td><td>Olympus Lx73</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2-éthane-sulfonique)</td><td>Gibco</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Dispositif</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Solution de nucléofecteur</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de myristate de Phorbol (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade kit</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Schneider’s Insect medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X</td><td></td></tr></tbody></table>

Étude de la phagocytose de leishmania à l’aide de la microscopie confocale

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

La phagocytose est un processus orchestré qui implique des étapes distinctes : la reconnaissance, la liaison et l’internalisation. Les phagocytes professionnels absorbent les parasites Leishmania par phagocytose, consistant à reconnaître les ligands sur les surfaces des parasites par de multiples récepteurs de cellules hôtes. La liaison de Leishmania aux membranes des macrophages se produit par le récepteur du complément de type 1 (CR1) et le récepteur du complément de type 3 (CR3) et les récepteurs de reconnaissance de formes. Le lipophosphoglycane (LPG) et la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) sont les principaux ligands impliqués dans les interactions macrophage-leishmania . Après la reconnaissance initiale des ligands du parasite par les récepteurs de la cellule hôte, les parasites deviennent intériorisés, survivent et se multiplient dans les vacuoles parasitophres. Le processus de maturation des vacuoles induites par Leishmania implique l’acquisition de molécules à partir de vésicules intracellulaires, y compris la protéine G monomère Rab 5 et Rab 7, la protéine membranaire associée lysosomale 1 (LAMP-1), la protéine membranaire associée lysosomale 2 (LAMP-2) et la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 associée aux microtubules (CL3).
Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes en utilisant la microscopie confocale, y compris (i) la liaison (ii) l’internalisation et (iii) la maturation du phagosome. En ajoutant à l’ensemble des connaissances entourant ces déterminants de l’issue de l’infection, nous espérons améliorer la compréhension de la pathogenèse de l’infection à Leishmania et soutenir la recherche éventuelle de nouvelles cibles chimiothérapeutiques.

Ce rapport vise à évaluer les événements précoces survenant au cours de la phagocytose de L. braziliensis isolé chez des patients présentant la forme L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL de CL. En utilisant la microscopie confocale, nous avons étudié les principaux événements associés à la phagocytose des parasites: liaison, internalisation et maturation du phagosome. Nous avons d’abord évalué la liaison et la phagocytose de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL par des macrop...

Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes.

Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Nous décrivons ici des méthodes pour évaluer les premiers états de durcissement au cours de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes. Cette technique présente comme le principal avantage, permettant l’étude des différents états de phagocytose de Leishmania et la participation de plusieurs protéines.Il convient de noter que cette technique peut également être étendue à d’autres types d’études, y compris l’infection par des bactéries, des levures ou l’engloutissement par d’autres types de cellules. Les personnes qui essaient cette technique devraient prendre soin du temps d’exposition des cellules à la solution de Nucleofector. De plus, nous suggérons de commencer à tester la transfection en utilisant un maximum de deux plasmides.La démonstration de la procédure sera Amanda Reboucas, une doctorante de notre laboratoire. Pour commencer, ensemencez 0,2 million de cellules THP-1, ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 microlitres RPMI par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 millimètres. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius sous 5% de diox

investigating-the-phagocytosis-of-leishmania-using-confocal-microscopy

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Un test parasite de sauvetage et de la transformation des cellules infectées...

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Cette vidéo étudie la virulence de Leishmania en traitant les macrophages avec des promastigotes métacycliques, ce qui entraîne la formation d'amastigotes intracellulaires. La confirmation de la virulence de Leishmania est obtenue par coloration fluorescente à l'acide nucléique. Ces connaissances peuvent contribuer au développement de nouveaux traitements contre la leishmaniose.

Évaluation de la virulence de Leishmania dans les macrophages en culture

Cette vidéo présente un test permettant de quantifier la croissance intracellulaire des parasites dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM). Les cellules macrophages sont infectées par les stades invasifs mobiles et non mobiles de Leishmania, les promastigotes métacycliques et les amastigotes, respectivement. Les parasites envahissent les macrophages, s’intériorisent dans une vacuole parasitophore et se multiplient à l’intérieur. La croissance intracellulaire du parasite est...

Un test in vitro pour quantifier la croissance intracellulaire du parasite dans les macrophages

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes...

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .

Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour générer des souches de L. panamensis et de L. donovani exprimant le gène de l’eGFP en tant que transgène intégré stable à l’aide du système pLEXSY. Les parasites transfectés ont été clonés par dilution limite, et les clones ayant l’intensité de fluorescence la plus élevée chez les deux espèces ont été sélectionnés pour une utilisation ultérieure dans les tests de dépistage de médicaments.

Développement de souches d’espèces de Leishmania avec expression constitutive de eGFP

Nous présentons ici une évaluation longitudinale de hamsters dorés infectés par voie intrapéritonéale (IP) ou intragingivale (IG) par L. infantum-Luc par imagerie bioluminescente et par PCR. Les hamsters ont été évalués 1 jour après l’infection (1 dpi), 1 semaine après l’infection (8 dpi) et 3 semaines après l’infection (22 dpi) et euthanasiés à la 50e dpi et 8 mois après l’infection.

In vivo Imagerie de hamsters infectés par Leishmania infantum par inoculation gingivale d’amastigotes axéniques exprimant la luciférase

Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d'imagerie confocale.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Découvrez l'analyse de la phagocytose de Leishmania par microscopie confocale et transfection de cellules THP-1. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-parasite et le recrutement protéique aux vacuoles parasitophores.

Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale

Explorer plus de vidéos