Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille

Ce protocole expose les cellules cancéreuses en suspension à de brèves impulsions de stress de cisaillement des fluides pour imiter certains aspects de la façon dont les cellules cancéreuses métastatiques sont exposées à des forces hémodynamiques lorsqu’elles sont dans le système circulatoire. C’est une technique relativement simple pour appliquer de brèves impulsions de contrainte de cisaillement de fluide de haut niveau. Lorsque vous essayez ce protocole, soyez prudent sur les aiguilles non bouchées et ne les pliez pas car cela modifierait la contrainte de cisaillement de force appliquée.

Cette procédure peut produire des aérosols, alors utilisez des mesures de sécurité appropriées. Pour commencer, libérez 70 à 90% des cellules PC3 confluentes de la boîte de culture tissulaire en aspirant le milieu de croissance et en lavant la boîte de 10 centimètres avec cinq millilitres de PBS sans calcium et magnésium. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de 0,25% de trypsine.

Après la trypsinisation, observez le détachement des cellules sous un microscope inversé. Pour inhiber la trypsine, ajoutez cinq millilitres de milieu DMEM/F12 contenant 10% fbS. Ensuite, placez la suspension cellulaire dans un tube conique et déterminez la concentration cellulaire et le nombre total de cellules.

Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant trois minutes, puis aspirer le surnageant et ressuspend la pastille dans un milieu de culture tissulaire sans sérum. Coupez autour du fond du tube de polystyrène de 14 millilitres à la ligne de sept millilitres et placez la suspension de cellules mélangées dans le tube coupé. Prélever séparément des échantillons de contrôle statiques de cellules avant l’exposition au stress de cisaillement du fluide pour l’utiliser pour effectuer des essais.

Pour exposer l’échantillon de suspension cellulaire restant à une contrainte de cisaillement du fluide, aspirez la suspension cellulaire dans une seringue de cinq millilitres et fixez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30. Placez et fixez la seringue avec une aiguille non capuchonée sur une pompe à seringue et réglez le débit pour atteindre le niveau souhaité de contrainte de cisaillement du fluide. Faites fonctionner la pompe à seringue et prélever l’échantillon cisaillé dans le tube coupé à un angle d’environ 45 degrés pour réduire la mousse.

Retirez soigneusement la seringue de la pompe à seringue et utilisez une pince pour retirer l’aiguille, en prenant soin de ne pas la toucher. Répétez la procédure jusqu’à ce que la suspension cellulaire ait été exposée au nombre souhaité d’impulsions de contrainte de cisaillement du fluide. Effectuer des tests de viabilité avec les échantillons statiques avant d’exposer les cellules à une contrainte de cisaillement du fluide.

Pour les essais enzymatiques, transférer 100 aliquotes de microlitres des échantillons statiques en double dans une plaque de 96 puits. Ensuite, prélever 100 microlitres d’échantillons après une exposition au stress de cisaillement du fluide et les placer dans une plaque de 96 puits. Ajouter 20 microlitres d’une solution de résazurine de 0,15 millilitre par millilitre à chaque puits d’échantillonnage et aux puits contenant 100 microlitres de milieu seul.

Incuber les plaques de puits dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis mesurer la fluorescence et l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques et obtenir le pourcentage de cellules viables en comparant le signal moyen de chacun des échantillons exposés à la contrainte de cisaillement du fluide à l’échantillon de contrôle moyen à statique. De même, prélever des aliquotes à partir d’échantillons statiques pour effectuer une cytométrie en flux et des essais clonogènes comme décrit dans le manuscrit textuel. Dans l’analyse représentative, la viabilité des cellules cancéreuses épithéliales mammaires par biopsie syngénique a été évaluée à l’aide de la conversion de la résazurine après avoir exposé les cellules à un certain nombre d’impulsions de stress de cisaillement des fluides.

Même si chaque lignée cellulaire présentait des profils de résistance différents, il n’y avait pas de différence significative de viabilité après 10 impulsions d’exposition au stress de cisaillement du fluide. D’autres lignées cellulaires cancéreuses provenant de diverses origines tissulaires ont démontré la viabilité de plus de 20 % après 10 impulsions de stress de cisaillement des fluides, à l’exception des cellules MIA PaCa-2, qui ont montré une viabilité inférieure à 10 % en raison de la sensibilité à la destruction mécanique due au stress de cisaillement des fluides. Lors de la collecte de l’échantillon statique avant d’appliquer une contrainte de cisaillement des fluides, assurez-vous que la suspension cellulaire est mélangée de manière homogène.

Retirez soigneusement l’aiguille avec une pince et ne pliez pas ou ne touchez pas l’aiguille. En plus de mesurer la viabilité cellulaire, on peut évaluer les changements dans l’expression des gènes, la signalisation cellulaire, la prolifération et la migration. En utilisant cela comme modèle d’exposition au stress de cisaillement des fluides, on peut étudier à la fois comment les cellules cancéreuses résistent à la destruction par le stress de cisaillement des fluides et évaluer les effets du stress de cisaillement des fluides sur la biologie des cellules cancéreuses.

Cette technique a été utilisée par notre laboratoire et d’autres pour explorer les effets du stress de cisaillement des fluides sur les cellules tumorales circulantes. Ces études ont montré que la contrainte de cisaillement des fluides modifie rapidement les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses et que cela contribue à la capacité des cellules cancéreuses à résister à la destruction par le stress de cisaillement des fluides.