Name: Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Apprenez à modéliser les effets du stress de cisaillement fluide sur les cellules tumorales circulantes à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Cette méthode simple permet d'étudier la viabilité cellulaire et la résistance mécanique dans le contexte de la métastase.

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Le développement du modèle démontré ici a été soutenu par la subvention W81XWH-12-1-0163 du DOD, les subventions R21 CA179981 et R21 CA196202 des NIH et le Sato Metastasis Research Fund.

1. Préparation des cellules
<ol><li>Libérez les cellules de la boîte de culture tissulaire lorsqu’elles sont confluentes à 70 à 90 % en suivant les directives recommandées pour la lignée cellulaire utilisée.<ol>
<li>Par exemple, aspirez le milieu de croissance des cellules PC-3 et lavez le plat de 10 cm de cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium.</li>
		<li>Aspirer le PBS avant d’ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % en utilisant le protocole du fabricant.</li>
		<li>Après avoir observé le détachement des cellules au microscope inversé, ajouter 5 mL de milieu DMEM:F12 contenant 10% de sérum bovin fœtal pour inhiber la trypsine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la suspension cellulaire dans un tube conique.</li>
	<li>Déterminez la concentration et le nombre total de cellules.</li>
	<li>Les cellules granulées par centrifugation (300 × g pendant 3 min), aspirent le surnageant et ressuspendent les cellules dans un milieu de culture tissulaire sans sérum jusqu’à 5 × 105 cellules/mL. REMARQUE: Il est essentiel que le milieu d’essai contienne au moins 1,17 mM de Ca++, car il a été démontré que le Ca++ extracellulaire est nécessaire pour la résistance cellulaire à FSS15.</li>
</ol>2. Exposition aux contraintes de cisaillement des fluides
<ol><li>Avant d’exposer les cellules au FSS, coupez un tube de polystyrène à fond rond de 14 mL à la ligne de 7 mL. Mélanger la suspension cellulaire, placer 5 mL de la suspension dans le tube coupé et prélever des échantillons de contrôle statique. REMARQUE : Le volume nécessaire au prélèvement de l’échantillon statique dépend du test de viabilité utilisé (voir l’étape 3).</li>
	<li>Aspirez la suspension cellulaire dans une seringue de 5 mL et fixez une aiguille de 30 G 1/2 po. Décapsulez l’aiguille, placez la seringue sur une pompe à seringue, fixez la seringue et réglez le débit pour atteindre le niveau souhaité de FSS. REMARQUE : Le tableau 1 indique la contrainte maximale de cisaillement de la paroi pour différentes aiguilles et débits, ainsi que le niveau minimum de FSS en fonction de la taille de la cellule (10, 15 et 20 μm). Inspecter l’aiguille avant de l’utiliser pour s’assurer qu’elle n’est pas pliée; en cas d’incertitude, remplacez l’aiguille par une nouvelle. L’intégrité de l’aiguille peut avoir un impact significatif sur le niveau de FSS appliqué.</li>
	<li>Faites fonctionner la pompe à seringue et prélever l’échantillon cisaillé dans le tube coupé à un angle d’environ 45 ° pour réduire la mousse. Prélever un échantillon en fonction du type d’essai de viabilité ou des besoins en aval.<ol>
<li>Retirez soigneusement la seringue et l’aiguille de la pompe à seringue et utilisez une pince pour retirer l’aiguille de la seringue, en prenant soin de ne pas toucher l’aiguille. REMARQUE: Les aiguilles non biseautées peuvent être utilisées de manière interchangeable avec les aiguilles biseautées comme mesure de sécurité supplémentaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez la suspension cisaillée dans la seringue, refixez soigneusement l’aiguille à l’aide d’une pince et replacez-la dans la pompe à seringue.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.3 et 2.4 jusqu’à ce que la suspension cellulaire ait été exposée au nombre souhaité d’impulsions de FSS. REMARQUE: Pour évaluer la capacité des cellules à résister à la destruction mécanique de l’exposition au FSS, la suspension cellulaire est généralement soumise à 10 impulsions de FSS. Cependant, il a été démontré que les cellules commencent à subir des adaptations biologiques en réponse au FSS après 2 impulsions24.</li>
</ol>3. Mesure de la viabilité
REMARQUE: La viabilité peut être évaluée à l’aide de tests enzymatiques (luciférase, résazurine et WST-1), en comptant les cellules intactes, en cytométrie en flux ou par des tests clonogènes.
<ol><li>Pour toutes les mesures de viabilité, prélever un échantillon avant d’exposer les cellules au FSS.<ol>
<li>Pour les essais enzymatiques, prenez des aliquotes de 100 μL en double et placez-les dans une plaque de 96 puits.</li>
		<li>Pour la cytométrie en flux, prenez une aliquote de 500 μL et placez-la dans un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Pour le dosage clonogène, prélever une aliquote de 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Essai enzymatique<ol>
<li>Prélever des échantillons de 100 μL après 1, 2, 4, 6, 8 et 10 impulsions d’exposition au FSS et les placer dans une plaque de 96 puits.</li>
		<li>Ajoutez le substrat souhaité et suivez le protocole pour le test utilisé:<ol>
<li>Pour la résazurine, ajouter 20 μL d’une solution de 0,15 mg/mL à chaque puits. Ajouter 20 μL de solution de résazurine à 0,15 mg/mL aux puits contenant 100 μL de milieu seul. Incuber pendant 2 h dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C. Mesurer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques capable de lire la fluorescence (579 excitation/ 584 émission).</li>
			<li>Pour les cellules exprimant la luciférase, ajouter 100 μL de 15 mg/mL de D-luciférine à 5 mL de milieu. Ajouter 100 μL de cette solution à chaque puits contenant des cellules. Attendez 5 min, puis lisez la plaque à l’aide d’un lecteur compatible avec la luminescence.</li>
			<li>Pour WST-1, ajouter 10 μL de WST-1 à chaque puits, y compris les puits contenant uniquement du milieu. Incuber pendant 4 h, puis lire l’absorbance entre 420 et 480 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Comparez le signal moyenné de chacun des échantillons exposés au FSS à l’échantillon de contrôle statique moyenné pour obtenir le pourcentage de cellules viables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytométrie en flux24<ol>
<li>Prélever des échantillons de 500 μL et les placer dans des tubes centrifuges de 1,5 mL après 1, 2, 5 et 10 impulsions de FSS.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons (500 × g pendant 3 min) et jeter les surnageants.</li>
		<li>Resuspendez les granulés avec 1 mL de PBS sans calcium et magnésium et centrifugez les échantillons (300 × g pendant 3 min).</li>
		<li>Suspendre les granulés avec 500 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (PBS avec 0,5% d’albumine sérique bovine et 0,1% d’azide de sodium) avec des billes de comptage et des colorants imperméables à la membrane ou viables tels que l’iodure de propidium (1,75 μg / mL).</li>
		<li>Déterminer la viabilité en comparant le rapport entre les cellules viables, normalisées pour compter les billes, dans les échantillons cisaillés et celui de l’échantillon statique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Essai clonogénique<ol>
<li>Prendre 100 μL de l’échantillon statique et ajouter 900 μL de milieu de croissance pour faire une dilution de 1:10.</li>
		<li>Prendre 100 μL de l’échantillon dilué 1:10 et ajouter 900 μL de milieu de croissance pour faire une dilution finale de 1:100.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de l’échantillon de dilution 1:100 dans chacun des 3 puits d’une boîte de 6 puits contenant 2 mL de milieu de croissance.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.4.1 à 3.4.3 avec des échantillons qui ont été soumis à 10 impulsions de FSS.</li>
		<li>Laissez les cellules se développer pendant 7 à 10 jours sans changer le milieu et vérifiez la formation de colonies. Une fois que des colonies de cellules ≥50 se sont formées, aspirez le milieu de croissance, rincez chaque puits avec 1 mL de PBS, aspirez le PBS et fixez pendant 5 minutes à l’aide de 1 mL d’éthanol glacé à 70% (EtOH). Il est important de fixer les échantillons cisaillés et statiques en même temps.</li>
		<li>Après avoir fixé les échantillons, aspirer l’EtOH et ajouter 1 à 2 mL de solution de violet cristallin (0,1% de violet cristallin dans 90% H2O, 10% EtOH) pendant 5 min.</li>
		<li>Rincer avec un excès d’eau et laisser sécher la plaque</li>
		<li>Comptez les colonies (grappes de ≥50 cellules) pour les échantillons statiques et cisaillés. Comparez le rapport entre le nombre moyen de colonies de l’échantillon cisaillé et le nombre moyen de colonies de l’échantillon statique pour déterminer la viabilité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival%2Fchemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li>
</ol>

MDH est co-fondateur, président et actionnaire de SynderBio, Inc. DLM est consultant pour SynderBio, Inc.

Cet article démontre l’application du FSS aux cellules cancéreuses en suspension à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. En utilisant ce modèle, il a été démontré que les cellules cancéreuses sont plus résistantes aux brèves impulsions de FSS de haut niveau par rapport aux cellules épithéliales non transformées15,22,24. De plus, l’exposition au FSS à l’aide de ce modèle entraîne une augmentation rapide de la rigidité cellulai...

Les métastases, ou la propagation du cancer au-delà du site tumoral initial, sont un facteur majeur sous-jacent à la mortalité par cancer1. Au cours des métastases, les cellules cancéreuses utilisent le système circulatoire comme une autoroute pour se dissémer vers des sites éloignés dans tout le corps2,3. En route vers ces sites, les cellules tumorales circulantes (CCC) existent au sein d’un microenvironnement fluide dynamique contrairement à celui de leur tumeur primaire d’origine3,4,5. Il a été proposé que ce microenvironnement fluide soit l’un des nombreux obstacles aux métastases4. Il existe un large consensus dans le concept d’inefficacité métastatique, c’est-à-dire que la plupart des CTCC entrant dans la circulation périssent ou ne forment pas de colonies métastatiques productives6,7,8. Cependant, la raison pour laquelle les métastases sont inefficaces du point de vue d’un CCT individuel est moins certaine et demeure un domaine d’investigation actif. Les CTCC sont détachés de la matrice extracellulaire, privés de facteurs solubles de croissance et de survie qui peuvent être présents dans la tumeur primaire, et exposés au système immunitaire et aux forces hémodynamiques d’une manière très différente de celle de la tumeur primaire4. Chacun de ces facteurs peut contribuer à la faible survie des CTCC, mais leurs contributions relatives ne sont pas claires. Cet article aborde la question de savoir comment les forces hémodynamiques affectent les CTCC.
L’étude des effets des forces hémodynamiques sur les CTCC est assez difficile. Actuellement, il n’existe aucun système in vitro conçu capable de reproduire l’ensemble de la dynamique spatio-temporelle (du cœur aux capillaires) et des propriétés rhéologiques du système vasculaire humain. De plus, la façon dont les CTCC vivent le système circulatoire n’est pas tout à fait claire. Les preuves expérimentales indiquent que la plupart des cellules cancéreuses ne circulent pas continuellement comme les cellules sanguines. Au contraire, en raison de leur taille relativement grande (10-20 μm de diamètre), la plupart des CCC sont piégés dans des lits capillaires (6-8 μm de diamètre) pendant des durées variables (s à jours) où ils peuvent mourir, extravaser ou être déplacés vers le lit capillaire suivant8,9,10,11. Cependant, il existe des preuves que la taille du CTC peut être plus hétérogène in vivo et que les CTC plus petits sont détectables12. Par conséquent, sur la base de la distance et de la vitesse du flux sanguin, les CTCC ne peuvent circuler librement que pendant quelques secondes entre ces périodes de piégeage, bien qu’il manque une description quantitative de ce comportement13.
De plus, selon l’endroit où les CCC pénètrent dans la circulation, ils peuvent traverser plusieurs lits capillaires dans le poumon et d’autres sites périphériques et à travers le cœur droit et gauche avant d’atteindre leur destination finale. En cours de route, les CTCC sont exposés à diverses contraintes hémodynamiques, y compris la contrainte de cisaillement des fluides (FSS), les forces de compression lors de leur piégeage dans la microcirculation et, potentiellement, les forces de traction dans des circonstances où ils pourraient présenter un roulement semblable à celui d’un leucocyte le long des parois des vaisseaux sanguins14. Ainsi, la capacité de modéliser la circulation et la compréhension du comportement CTC à modéliser sont limitées. En raison de cette incertitude, tout résultat de systèmes modèles in vitro doit être validé dans un organisme vertébré expérimental et, en fin de compte, chez des patients atteints de cancer.
Avec les mises en garde susmentionnées, cet article démontre un modèle relativement simple pour appliquer le FSS aux cellules en suspension afin de sonder les effets du FSS sur les CTC décrits pour la première fois en 201215. FSS résulte du frottement du flux sanguin contre la paroi des vaisseaux, ce qui produit un gradient de vitesse parabolique dans des conditions d’écoulement laminaire dans les plus gros vaisseaux. Les cellules éprouvent des niveaux plus élevés de FSS près des parois des vaisseaux et des niveaux plus bas près du centre du vaisseau sanguin. La viscosité du fluide, le débit et les dimensions du conduit à travers lequel l’écoulement se produit influencent FSS, comme décrit par l’équation de Hagen-Poiseuille. Cela s’applique aux flux sanguins se comportant comme des fluides newtoniens, mais ne tient pas pour la microcirculation. Le FSS physiologique varie sur plusieurs ordres de grandeur avec les niveaux les plus bas dans les lymphatiques (<1 dyn/cm 2 ) et les plus élevés dans les régionsautourdes valves cardiaques et des plaques d’athérosclérose (>500 dyn/cm2)5. Le stress moyen de cisaillement de la paroi dans les artères est de 10-70 dyn/cm2 et de 1-6 dyn/cm2 dans les veines16,17.
Dans le cœur, les cellules peuvent être exposées à des écoulements turbulents autour des folioles valvulaires où un niveau très élevé, mais de très courte durée FSS peut être expérimenté18,19. Bien que le domaine du biotraitement ait longtemps étudié les effets du FSS sur les cellules de mammifères en suspension, cette information peut être d’une valeur limitée pour comprendre les effets du FSS sur les CTCC car elle se concentre généralement sur des niveaux beaucoup plus faibles de FSS appliqués sur une longue durée20. Comme décrit ci-dessous, à l’aide d’une seringue et d’une aiguille, on peut appliquer un FSS relativement élevé (des dizaines à des milliers dedyn/cm2)pendant une durée relativement courte (millisecondes) sur une suspension cellulaire. Depuis la description initiale de ce modèle15,d’autres l’ont utilisé pour étudier les effets du FSS sur les cellules cancéreuses21,22,23. De multiples « impulsions » de FSS peuvent être appliquées à des suspensions cellulaires en peu de temps pour faciliter les analyses expérimentales en aval. Par exemple, ce modèle peut être utilisé pour mesurer la capacité des cellules à résister à la destruction mécanique par FSS en mesurant la viabilité des cellules en fonction du nombre d’impulsions appliquées. Alternativement, les effets de l’exposition au FSS sur la biologie des cellules cancéreuses peuvent être explorés en collectant des cellules pour une variété d’analyses en aval. Il est important de savoir qu’une partie de la suspension cellulaire est réservée en tant que contrôle statique pour comparer les effets du FSS de ceux qui pourraient être associés au détachement cellulaire et au temps passé en suspension.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>14 mL tubes à fond rond</td><td>Falcon - Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1/2" Aiguille</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>seringue 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 puits noir plaque inférieure</td><td>Costar - Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de bioluminescence</td><td>AMI</td><td>AMI HTX</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Fraction V</td><td>Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>cristal violet</td><td>Sigma</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>GoldBio</td><td>D-LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3005</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Au cours des métastases, les cellules cancéreuses des tissus solides, y compris les épithéliums, accèdent à la circulation lymphatique et hématogène où elles sont exposées à un stress mécanique dû au flux hémodynamique. L’un de ces stress que subissent les cellules tumorales circulantes (CCC) est le stress de cisaillement des fluides (FSS). Alors que les cellules cancéreuses peuvent présenter de faibles niveaux de FSS dans la tumeur en raison du flux interstitiel, les CTC sont exposés, sans attachement à la matrice extracellulaire, à des niveaux beaucoup plus élevés de FSS. Physiologiquement, le FSS varie sur 3-4 ordres de grandeur, avec de faibles niveaux présents dans les lymphatiques (<1 dyne/cm2) et les niveaux les plus élevés présents brièvement lorsque les cellules traversent le cœur et autour des valves cardiaques (>500 dynes/cm2). Il existe quelques modèles in vitro conçus pour modéliser différentes gammes de contraintes physiologiques de cisaillement sur différentes périodes. Cet article décrit un modèle pour étudier les conséquences de brèves impulsions (millisecondes) de FSS de haut niveau sur la biologie des cellules cancéreuses à l’aide d’un simple système de seringue et d’aiguille.

Une résistance élevée à la destruction mécanique induite par le FSS s’est déjà avérée être un phénotype conservé dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses et cellules cancéreuses fraîchement isolées de tumeurs par rapport aux comparateurs de cellules épithéliales non transformées15,24. Ici, d’autres lignées cellulaires cancéreuses provenant de diverses origines tissulaires(tableau 2)ont été testées pour démontrer que la majorité de ces cellu...

Ici, nous démontrons une méthode pour appliquer la contrainte de cisaillement des fluides aux cellules cancéreuses en suspension pour modéliser les effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes.

Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Ce protocole expose les cellules cancéreuses en suspension à de brèves impulsions de stress de cisaillement des fluides pour imiter certains aspects de la façon dont les cellules cancéreuses métastatiques sont exposées à des forces hémodynamiques lorsqu’elles sont dans le système circulatoire. C’est une technique relativement simple pour appliquer de brèves impulsions de contrainte de cisaillement de fluide de haut niveau. Lorsque vous essayez ce protocole, soyez prudent sur les aiguilles non bouchées et ne les pliez pas car cela modifierait la contrainte de cisaillement de force appliquée.Cette procédure peut produire des aérosols, alors utilisez des mesures de sécurité appropriées. Pour commencer, libérez 70 à 90% des cellules PC3 confluentes de la boîte de culture tissulaire en aspirant le milieu de croissance et en lavant la boîte de 10 centimètres avec cinq millilitres de PBS sans calcium et magnésium. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de 0,25% de trypsine.Après la trypsinisation, observez le détachement des cellules sous un microscope inversé. Pour inhiber la trypsine, ajoutez cinq millilitres de milieu DMEM/F12 contenant 10% fbS. Ensuite, placez la suspension cellulaire dans un tube conique et déterminez la concentration cellulaire et le nombre total de cellules.Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant trois minutes, puis aspirer le surnageant et ressuspend la pastille dans un milieu de culture tissulaire sans sérum. Coupez autour du fond du tube de polystyrène de 14 millilitres à la ligne de sept millilitres et placez la suspension de cellules mélangées dans le tube coupé. Prélever séparément des échantillons de contrôle statiques de cellules avant l’exposition au stress de cisaillement du fluide pour l’utiliser pour effectuer des essais.Pour exposer l’échantillon de suspension cellulaire restant à une contrainte de cisaillement du fluide, aspirez la suspension cellulaire dans une seringue de cinq millilitres et fixez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30. Placez et fixez la seringue avec une aiguille non capuchonée sur une pompe à seringue et réglez le débit pour atteindre le niveau souhaité de contrainte de cisaillement du fluide. Faites fonctionner la pompe à seringue et prélever l’échantillon cisaillé dans le tube coupé à un angle d’environ 45 degrés pour réduire la mousse.Retirez soigneusement la seringue de la pompe à seringue et utilisez une pince pour retirer l’aiguille, en prenant soin de ne pas la toucher. Répétez la procédure jusqu’à ce que la suspension cellulaire ait été exposée au nombre souhaité d’impulsions de contrainte de cisaillement du fluide. Effectuer des tests de viabilité avec les échantillons statiques avant d’exposer les cellules à une contrainte de cisaillement du fluide.Pour les essais enzymatiques, transférer 100 aliquotes de microlitres des échantillons statiques en double dans une plaque de 96 puits. Ensuite, prélever 100 microlitres d’échantillons après une exposition au stress de cisaillement du fluide et les placer dans une plaque de 96 puits. Ajouter 20 microlitres d’une solution de résazurine de 0,15 millilitre par millilitre à chaque puits d’échantillonnage et aux puits contenant 100 microlitres de milieu seul.Incuber les plaques de puits dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis mesurer la fluorescence et l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques et obtenir le pourcentage de cellules viables en comparant le signal moyen de chacun des échantillons exposés à la contrainte de cisaillement du fluide à l’échantillon de contrôle moyen à statique. De même, prélever des aliquotes à partir d’échantillons statiques pour effectuer une cytométrie en flux et des essais clonogènes comme décrit dans le manuscrit textuel. Dans l’analyse représentative, la viabilité des cellules cancéreuses épithéliales mammaires par biopsie syngénique a été évaluée à l’aide de la conversion de la résazurine après avoir exposé les cellules à un certain nombre d’impulsions de stress de cisaillement des fluides.Même si chaque lignée cellulaire présentait des profils de résistance différents, il n’y avait pas de différence significative de viabilité après 10 impulsions d’exposition au stress de cisaillement du fluide. D’autres lignées cellulaires cancéreuses provenant de diverses origines tissulaires ont démontré la viabilité de plus de 20 % après 10 impulsions de stress de cisaillement des fluides, à l’exception des cellules MIA PaCa-2, qui ont montré une viabilité inférieure à 10 % en raison de la sensibilité à la destruction mécanique due au stress de cisaillement des fluides. Lors de la collecte de l’échantillon statique avant d’appliquer une contrainte de cisaillement des fluides, assurez-vous que la suspension cellulaire est mélangée de manière homogène.Retirez soigneusement l’aiguille avec une pince et ne pliez pas ou ne touchez pas l’aiguille. En plus de mesurer la viabilité cellulaire, on peut évaluer les changements dans l’expression des gènes, la signalisation cellulaire, la prolifération et la migration. En utilisant cela comme modèle d’exposition au stress de cisaillement des fluides, on peut étudier à la fois comment les cellules cancéreuses résistent à la destruction par le stress de cisaillement des fluides et évaluer les effets du stress de cisaillement des fluides sur la biologie des cellules cancéreuses.Cette technique a été utilisée par notre laboratoire et d’autres pour explorer les effets du stress de cisaillement des fluides sur les cellules tumorales circulantes. Ces études ont montré que la contrainte de cisaillement des fluides modifie rapidement les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses et que cela contribue à la capacité des cellules cancéreuses à résister à la destruction par le stress de cisaillement des fluides.

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Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille (Vidéo) | JoVE Journal

Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille

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