Name: Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques de la cavité buccale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez comment établir des cultures binaires stables de Saccharibacteria symbiotiques à partir de plaque dentaire. Cette méthode utilise Arachnia propionica comme hôte et permet d'obtenir plus de 30 isolats pour des études physiologiques et génomiques.

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Les auteurs souhaitent remercier Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He et Batbileg Bor pour leurs discussions utiles et pour avoir fourni des souches bactériennes. Nous remercions Susan Yost et Jessica Woods pour leur assistance technique microbienne. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Institute of Dental and Craniofacial Research des National Institutes of Health sous les numéros de bourse R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) et T32 DE007327 (AJC). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Lors de l’élaboration de ce protocole, l’approbation de la CISR a été demandée et approuvée (#14-10) et le consentement éclairé de tous les sujets a été obtenu.
1. Préparation
<ol><li>Lorsque vous travaillez avec des sujets humains, obtenir l’approbation de la CISR et le consentement éclairé nécessaires.</li>
	<li>Commencez les cultures de bactéries hôtes avec suffisamment de temps pour atteindre la phase stationnaire précoce. Par exemple, inoculer 2 à 5 mL de bouillon de soja tryptique avec 0,1 % d’extrait de levure ajouté (TSBY) avec Arachnia propionica et incuber à 37 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Assemblez les porte-filtres avec une membrane filtrante de 0,2 μm gravée sur chenilles. Envelopper l’ensemble dans du papier d’aluminium et stériliser par autoclavage.</li>
	<li>Stériliser les tubes à centrifuger et les ensembles de bouchons.</li>
</ol>2. Obtenir un échantillon de bactéries buccales
REMARQUE: Bien que de nombreux échantillons oraux contiennent des saccharibactéries (par exemple, salive, écouvillons d’amygdales, grattages de langue), la plaque dentaire est systématiquement la plus efficace.
<ol><li>Prenez un grattage de plaque à l’aide d’un point de papier stérile, d’une curette Gracey ou, si vous vous auto-échantillonnez, utilisez un cure-dent stérile ou une pointe de pipette. Transférer la plaque dans un tampon approprié, tel que le diluant de récupération maximale (MRD, NaCl à 0,85%, peptone à 0,1%) ou PBS. S’il n’est pas traité immédiatement, conservez l’échantillon sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à aller de l’avant.</li>
	<li>Ressuscitez vigoureusement la plaque dentaire dans le tampon MRD utilisant une combinaison de vortexing et de pipetage avec une petite pointe pipet.</li>
	<li>Ajouter l’échantillon de plaque remise en suspension à 9 mL supplémentaires de tampon MRD.</li>
</ol>3. Préparer le filtrat à partir d’un échantillon oral
<ol><li>À l’aide d’une technique aseptique, déballez un ensemble de filtre stérile. Détordre un quart de tour et ré-étroiler le porte-filtre pour s’assurer que les filets sont correctement enclenchés et que l’appareil est fermé correctement. À l’aide d’une seringue, lavez la membrane en faisant passer 10 mL de tampon MRD à travers l’appareil. Un mauvais assemblage est révélé à cette étape par une fuite de fluide hors du porte-filtre. En cas de fuite, procurez-vous un autre filtre stérile et répétez l’étape de lavage.</li>
	<li>Appliquez l’échantillon sur le filtre lavé. Retirez le piston d’une seringue et fixez-le à l’appareil filtrant. Versez l’échantillon dentaire dispersé, maintenant dans 10 mL de tampon MRD, dans une seringue et chargez-le sur le filtre.</li>
	<li>Placez un tube de centrifugation stérile sous l’appareil filtrant pour attraper le filtrat, puis appliquez une légère pression sur le piston pour pousser l’échantillon à travers le filtre.</li>
	<li>Répétez la procédure avec un autre tampon MRD de 10 mL pour laver la membrane, en recueillant l’écoulement dans le même tube que l’échantillon filtré. Coiffez aseptiquement le tube.</li>
</ol>4. Concentrer les cellules saccharibactéries par centrifugation
<ol><li>Faites une marque d’orientation sur le tube et le capuchon et placez le tube dans une centrifugeuse à grande vitesse avec la marque sur la face supérieure. La pastille formée par centrifugation est généralement invisible. Le marquage aidera à déterminer où se trouve la pastille de cellules de saccharibactéries lorsque la centrifugation est effectuée et que le tube est retiré de la centrifugeuse.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 60 000 x g pendant 1 h à 4 °C. REMARQUE: Cette force et ce temps sont suffisants pour granuler toutes les cellules saccharibactériennes. Cependant, les cellules de saccharibactéries peuvent être au moins partiellement granulées par centrifugation pendant aussi peu que 20 min à 20 000 x g.</li>
	<li>Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse. Versez le liquide du tube, en gardant la pastille sur la face supérieure du tube.</li>
	<li>Ressuscitez la pastille habituellement invisible dans 1-2 mL de tampon MRD par vortexing vigoureux.</li>
</ol>5. Infecter les cultures hôtes avec du filtrat enrichi en saccharibactéries
<ol><li>Préparer les tubes de culture en aliquotent 2 mL des milieux de croissance appropriés (p. ex. TSBY, BHI, etc.) dans des tubes.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de culture nocturne d’organismes hôtes à chaque tube. Ajouter 100 à 200 μL d’échantillon filtré ressuscité à chaque tube.</li>
	<li>Incuber des échantillons combinés selon ce qui convient à l’organisme hôte (p. ex. 37 °C, dans une atmosphère aérobie pour A. propionica).</li>
	<li>Faire passer les cellules tous les deux à trois jours en transférant 200 μL de culture binaire à 2 mL de milieu de croissance frais dans un nouveau tube. S’il s’avère que les cultures passées ne montrent aucune croissance (c.-à-d. que la turbidité ou la densité optique de la culture n’augmente pas après le passage dans des milieux frais), les saccharibactéries pourraient être écrasantes ou tuer tout l’organisme hôte. Pour remédier à cela, ajoutez 200 μL de culture hôte non infectée lors de la pâte des cellules. Répétez pendant au moins 5 passages.</li>
</ol>6. Confirmer l’infection par PCR
<ol><li>Après 5 passages, confirmez l’infection par PCR. Cinq passages garantiront que toutes les cellules de saccharibactéries non en croissance ont été épuisées au-delà de la limite de détection à l’aide de 25 cycles de PCR.</li>
	<li>Préparez un mastermix PCR. Une recette suggérée est la suivante, pour chaque tube nécessaire, préparer 12,5 μL 2x tampon PCR, 0,75 μL 10 μM Apprêt avant (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Apprêt inverse (1177R13- GAC CTG ACA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 et 9 μL d’eau. Mélanger par vortexing.</li>
	<li>Aliquote de 24 μL de mastermix dans un tube PCR de 0,2 mL. Ajouter 1 μL de culture infectée par les saccharibactéries à la réaction de PCR. Placer le tube dans un thermocycleur et exécuter le protocole suivant : dénéaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, 25 cycles à 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s, allongement final à 72 °C pendant 2 min, puis maintien final à 4 °C.</li>
	<li>Chargez et exécutez les produits PCR dans un gel d’agarose à 1%. Une bande de ~ 600 bases indiquera la présence de saccharibactéries.</li>
</ol>7. Vérifier la pureté et éliminer les organismes contaminants
<ol><li>Confirmer la pureté des cultures positives en plaquant la coculture de Saccharibacteria sur une gélose nutritive suffisante pour la croissance de l’organisme hôte. Effectuer une dilution en série de 10 fois de la culture dans un tampon stérile (p. ex. MRD ou PBS) et étaler 100 μL sur une plaque de gélose. Effectuer des dilutions telles qu’il y aura environ 20 à 200 colonies poussant sur la plaque d’agar.</li>
	<li>Incuber la culture dans des conditions de croissance appropriées et observer les organismes contaminants. REMARQUE: Les colonies de saccharibactéries axeniques n’ont jamais été observées, de sorte que seul l’organisme hôte est observé en croissance sur ces plaques. Plus d’un type de colonie indique habituellement une contamination. En cas de contamination, la culture doit être filtrée de nouveau pour éliminer les contaminants indésirables et réinoculée sur un hôte frais.</li>
	<li>Parfois, une double infection se produit, où deux espèces de Saccharibacteria infectent le même hôte. Pour séparer les espèces de Saccharibacteria, ressusciter les colonies individuelles dans du PBS stérile de 20 μL et utiliser 1 μL de suspension dans une réaction de PCR pour détecter les colonies infectées par les saccharibactéries.</li>
	<li>Transférer les suspensions qui ont donné un résultat positif au milieu de croissance pour démarrer une culture binaire. Le taux de réussite dépendra du titre de chaque espèce de Saccharibacteria dans la culture. Il peut être nécessaire de dépister plus de 50 colonies pour en trouver une infectée en vue de sa propagation.</li>
</ol>8. Stockage des cultures
<ol><li>Cultiver une culture binaire d’un volume suffisant (10-50 mL) pendant la nuit.</li>
	<li>Cellules granulées par centrifugation (4 000 x g pendant 10 min). REMARQUE: La centrifugation à grande vitesse n’est pas nécessaire ici car les cellules saccharibactéries seront attachées aux cellules plus grandes et plus lourdes de l’hôte et s’enduiront avec elles.</li>
	<li>Ressusciter des cellules dans le cryoprotectant. Les milieux de croissance complétés par 5% de DMSO ou 20% de glycérol sont généralement suffisants. S’assurer que l’organisme hôte est compatible avec les milieux cryoprotecteurs (p. ex. la croissance d’A. propionica est inhibée par le glycérol et les stocks congelés peuvent ne pas revivre). Tester la viabilité d’une culture hôte non infectée avec du cryoprotecteur pour s’assurer que les stocks peuvent survivre à la congélation.</li>
	<li>Ressusciter le culot cellulaire dans le même volume de culture (10-50 ml). Aliquote 0,5 mL en cryovials marqués. Congeler les cultures cellulaires à -80 °C.</li>
</ol>

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<li>Cross, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+isolation+and+cultivation+of+uncultivated+bacteria+by+reverse+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).</li>
<li>Kantor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+genomes+and+sparse+metabolisms+of+sediment-associated+bacteria+from+four+candidate+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla.</a> MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Notre méthode de filtrage de la plaque et de l’appliquer à des cultures pures d’organismes hôtes est largement basée sur des observations antérieures sur les premières saccharibactériescultivées, ' Nanosynbacter lyticus' souche TM7x11,14,15. Compte tenu de la petite taille des cellules, nous en avons déduit qu’elles pouvaient être séparées de la plaque dentaire à l’aide d’un filtre et concentrées par centrifugation. Deuxièmement, comme ces organismes vivent comme des parasites, fournir à ces cellules des cultures pures d’hôtes leur permettrait d’entrer dans une symbiose et de se développer en cultures binaires.
L’un des avantages de cette méthode est qu’elle ne nécessite pas de culture d’enrichissement ou de pression sélective. 'Nanosynbacter lyticus' souche TM7x a été cultivée à partir d’une culture d’enrichissement en utilisant la streptomycine comme agent sélectif, dont le séquençage avait suggéré serait efficace pour enrichir pour saccharibacteria. Fortuitement, l’hôte de 'Nanosynbacter lyticus' Schaalia odontolytica, est connu pour être résistant à la streptomycine16. L’utilisation d’antibiotiques comme agent sélectif pourrait également empêcher l’organisme hôte de se développer, ce qui à son tour empêcherait la croissance des saccharibactéries.
Un problème plus important de l’utilisation de cultures d’enrichissement est que les organismes à croissance rapide remplaceront rapidement les organismes d’intérêt. Dans la cavité buccale, par exemple, les espèces de Streptococcus peuvent se développer rapidement et, si du sucre est présent dans le milieu de croissance, produire suffisamment d’acide pour acidifier le milieu, en sélectionnant davantage contre les organismes d’intérêt. En évitant une culture d’enrichissement et des antibiotiques sélectifs, notre méthode fournit une approche générale qui pourrait être appliquée à un plus large éventail de saccharibactéries et d’hôtes potentiels sans les complications de ces autres méthodes.
Il y a quelques obstacles à la méthode présentée ici. Tout d’abord, cette méthode suppose que les saccharibactéries vivent dans une culture binaire. Nous n’avons pas testé de combinaisons de cultures ternaires ou ternaires pour évaluer leur efficacité, mais il existe probablement des saccharibactéries qui nécessitent des facteurs de croissance qu’un seul organisme hôte ne peut pas fournir. Tester les vastes combinaisons de bactéries buccales qui pourraient soutenir la croissance des saccharibactéries serait une tâche ardue. Deuxièmement, la méthode suppose que toutes les saccharibactéries sont suffisamment petites pour passer à travers un filtre de 0,2 μm. Il se pourrait que d’autres saccharibactéries soient plus grandes qu’on ne le croit et que le filtre sélectionne contre ces organismes. Un filtre avec une plus grande taille de pores pourrait être utilisé, mais cela risque de permettre à plus de bactéries orales indésirables d’entrer dans la co-culture infectée. Enfin, il est très difficile de trouver des espèces hôtes en dehors de celles qui ont déjà été publiées. Jusqu’à présent, les seuls hôtes réussis sont des espèces des genres Actinomyces, Schaalia, Arachnia et Cellulosimicrobium, tous membres de l’embranchement Actinobacteria15,17,18. Cependant, ces hôtes ne soutiennent que la croissance de saccharibactéries spécifiques. Pour faire l’élevage de plus d’espèces de saccharibactéries, beaucoup plus d’hôtes doivent être explorés.
Nous espérons que la méthode présentée ici aidera les recherches futures sur les saccharibactéries et d’autres organismes de RCR. Le séquençage métagénomique suggère que ces organismes ont également de petits génomes et sont soupçonnés d’être des symbiotes ou de compter sur la communauté microbienne locale pour fournir des métabolites et d’autres facteurs essentiels à leur survie19. Une stratégie de filtrage similaire pourrait être utilisée pour isoler ces organismes, à condition qu’ils soient suffisamment petits et que leurs organismes hôtes puissent être cultivés. Les méthodes décrites ici sont une première étape pour apporter les puissants outils de la culture en laboratoire à ce groupe important et diversifié de bactéries.

La culture de nouvelles espèces de bactéries et leur introduction en laboratoire permettent des expériences puissantes pour mieux comprendre leur physiologie et leurs interactions plus larges au sein de leur communauté microbienne. Bien qu’il existe des méthodes d’interrogation de ces questions sans culture (p. ex. « méta-omiques »), les interactions complexes de diverses populations microbiennes font qu’il est difficile de distinguer des variables uniques et d’en arriver à des conclusions significatives. Bien que la culture des bactéries présente de nombreux avantages, il existe de nombreux obstacles potentiels à l’isolement d’une bactérie et à sa culture en culture pure. Les besoins de croissance spécifiques potentiels comprennent le pH, la tension de l’oxygène, les vitamines, les facteurs de croissance, les molécules de signalisation ou même le contact cellulaire direct pour obtenir la croissance1. Cependant, on pense que les auxotrophies spécifiques sont le principal moyen de dissuasion à la culture de nouvelles espèces de bactéries. Les formulations de milieux standard manquent de nombreux nutriments requis par les bactéries non cultivées, tels que des vitamines spécifiques ou des sources de carbones. Ces molécules manquantes peuvent être essentielles à la physiologie des bactéries non cultivées et sont généralement fournies par un autre organisme de la communauté microbienne ou par un organisme hôte. Par exemple, des glucides complexes tels que les mucines peuvent être fournis par des hôtes animaux. L’ajout de ceux-ci aux milieux a permis la culture de plusieurs bactéries à partir d’intestins animaux, y compris Akkermansia muciniphila et Mucinivorans hirudinis2,3,4. De nombreuses bactéries pathogènes ont développé la capacité d’utiliser le fer lié à l’hémine dans les cellules animales, y compris l’agent pathogène oral Porphyromonas gingivalis5. En laboratoire, la croissance de Porphyromonas et d’autres organismes, peut être stimulée par l’ajout d’hémine6.
Récemment, de nombreuses percées dans la culture de nouveaux isolats de bactéries sont venues de la co-culture, en utilisant un organisme « nourricier » pour fournir des facteurs spécifiques aux bactéries non cultivées nécessaires à leur croissance. Une étude élégante menée par Vartoukian et ses collègues a montré que les siderophores, molécules de liaison au fer produites par les bactéries, stimulaient la croissance de plusieurs nouveaux isolats oraux. Pyoverdines, un type de siderophore produit par des espèces depseudomonades, ont été montrés pour faciliter de manière significative la croissance d’une nouvelle espèce Prevotella 7. Dans la même étude, le premier isolat oral pour l’embranchement Chloroflexi a été cultivé, utilisant également F. nucleatum comme aide pour fournir un composé encore inconnu7. Plus récemment, une bactérie du genre Ruminococcaceae a été isolée en utilisant Bacteroides fragilis comme organisme auxiliaire8. On lui a plus tard montré que l’acide aminobutyrique gamma (GABA), un neurotransmetteur inhibiteur, a été exigé pour la croissance sur des milieux de laboratoire. L’utilisation d’organismes nourriciers s’est avérée être une stratégie clé pour imiter des microenvironnements spécifiques où des bactéries non cultivées se développent, étant plus efficace que de reformuler continuellement des milieux de croissance avec différents additifs à des concentrations variables.
L’un des plus grands groupes de bactéries non cultivées se trouve dans le « Phyla Phyla Radiation » (CPR), un groupe monophylétique de plusieurs embranchements bactériens candidats9,10. Au moment d’écrire ces lignes, seuls les membres de l’embranchement des saccharibactéries au sein de la RCR ont été cultivés avec succès en laboratoire. Le premier isolat, la souche TM7xde Nanosynbacter lyticus, a été isolé à l’aide de l’antibiotique streptomycine, qui avait été prédit pour enrichir pour le TM7 non cultivé11,12. Une découverte clé de ce travail a été que le nouvel isolat s’est développé comme un parasite se développant en contact direct avec un hôte bactérien, Schaalia odontolytica, et la microscopie a montré que ces parasites étaient des bactéries ultrasmall.
À l’aide de ces indices, nous avons conçu une méthode pour établir rapidement des cocultures binaires de saccharibactéries avec leurs partenaires en filtrant la plaque dentaire et d’autres échantillons oraux à travers un filtre de 0,2 μm, en collectant des cellules dans le filtrat par centrifugation et en les utilisant pour infecter des cultures de bactéries hôtes candidates. Cette méthode a l’avantage d’éviter les cultures d’enrichissement, qui peuvent être submergées par des organismes à croissance rapide. Il évite également l’utilisation d’antibiotiques, ce qui pourrait arrêter la croissance des espèces de Saccharibacteria ciblées ou de leurs hôtes. En utilisant la méthode démontrée ici, nous avons cultivé avec succès 32 isolats de l’embranchement de Saccharibacteria.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Alphaimager</td><td>Cell Biosciences</td><td>FluorChem HD2</td><td>ou système d’imagerie sur gel UV équivalent</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon d’infusion Brain Heart (poudre déshydratée)</td><td>Becton-Dickinson</td><td>211059</td><td>Ou autres milieux de croissance adaptés aux organismes cibles</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Rotor 70-Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-500</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Électrophorèse Alimentation</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme d’électrophorèse</td><td>Bio-Rad</td><td>1704467</td><td></td></tr><tr><td>Pince à filtre</td><td>Millipore Sigma</td><td>XX6200006P</td><td>Non essentiel, permet de s’assurer que les filtres ne sont pas perforés lors de</td></tr><tr><td>la manipulation Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>950040025</td><td>Ou thermocycleur équivalent pour PCR</td></tr><tr><td>MgCl2 solution 25mM</td><td>Promega</td><td>A3513</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire eau de qualité</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819100</td><td></td></tr><tr><td>O2 Control InVitro Glove Box</td><td>Coy Laoratoires</td><td>031615</td><td>Si nécessaire pour les organismes microaérobies</td></tr><tr><td>Optima L-100 XP Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1124</td><td></td></tr><tr><td>P-10 micro pipette</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 micro pipette</td><td>Gilson</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Micro pipette P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette P-200</td><td>Gilson</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>tubes PCR 0,2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-205</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 10 &mu ; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-157</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 1000 &mu ; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-166</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 20 &mu ; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-161</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 200 &mu ; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-165</td><td></td></tr><tr><td>Filtres en polycarbonate - 47mm, 0.2 &mu ; m taille des pores</td><td>Millipore</td><td>GTTP04700</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques à bouchon à vis 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Ou autre tube adapté à la culture bactérienne</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Swin-Lok&nbsp ; - 47mm</td><td>Whatman</td><td>4200400</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel colorant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Seringues - 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (50x) concentré</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1332500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polycarbonate à paroi épaisse de 25 x 89 mm (capacité de 26,3 ml) avec bouchons Beckman</td><td>Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td><td>Northeast Laboratory Services</td><td>P1100</td><td>Ou autre plaque de gélose suffisante pour la croissance de organismes hôtes</td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique (poudre déshydratée)</td><td>Becton-Dickinson</td><td>211825</td><td>Ou autre milieu de croissance adapté aux organismes cibles</td></tr><tr><td>Chambre anaérobie en vinyle</td><td>Coy Laboratories</td><td>032714</td><td>Si nécessaire pour les organismes anaérobies</td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td></td></tr></tbody></table>

Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques de la cavité buccale

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

De nombreuses espèces bactériennes ne peuvent pas être cultivées en laboratoire à l’aide de méthodes standard, ce qui constitue un obstacle important à l’étude de la majorité de la diversité microbienne sur terre. De nouvelles approches sont nécessaires pour faire culture de ces bactéries non cultivées afin que les chercheurs puissent étudier efficacement leur physiologie et leur mode de vie à l’aide des puissants outils disponibles en laboratoire. Le rayonnement phyla candidat (RCR) est l’un des plus grands groupes de bactéries non cultivées, comprenant environ 15% de la diversité vivante sur terre. Le premier isolat de ce groupe était un membre de l’embranchement des Saccharibactéries, 'Nanosynbacter lyticus' souche TM7x. TM7x est une bactérie inhabituellement petite qui vit comme un symbiote en contact direct avec un hôte bactérien, Schaalia odontolytica, souche XH001. Profitant de la taille exceptionnellement petite de cellules et de son mode de vie comme organisme symbiotique, nous avons développé un protocole pour culturer rapidement des Saccharibacteria de la plaque dentaire. Ce protocole montrera comment filtrer une suspension de plaque dentaire à travers un filtre de 0,2 μm, puis concentrer les cellules saccharibactéries collectées et infecter une culture d’organismes hôtes. La coculture résultante peut être adoptée car toute culture bactérienne normale et l’infection est confirmée par PCR. La culture binaire résultante peut être maintenue en laboratoire et utilisée pour de futures expériences. Bien que la contamination soit une possibilité, la culture binaire peut être purifiée soit par un filtrage et une réinfection supplémentaires de l’hôte, soit par placage de la culture binaire et un dépistage des colonies infectées. Nous espérons que ce protocole pourra être étendu à d’autres types d’échantillons et environnements, ce qui mènera à la culture de beaucoup plus d’espèces dans le RCR.

La PCR pour la détection des saccharibactéries peut sembler négative (c.-à-d. aucun produit observé) dans les cultures d’infection initiales en raison d’un faible nombre de symbiotes de saccharibactéries. Cependant, après quelques passages, un produit de PCR fort devrait apparaître montrant qu’une infection stable s’est produite (Figure 1A). À l’inverse, certaines infections apparaîtront initialement positives par PCR, mais diminueront à indétectables après 1 à 4 passages (non représentés). Ceci indique qu’une grande quantité de cellules de Saccharibacteria étaient présentes dans le filtrat initial mais ont été diluées par passage et aucune n’a pu entrer dans une symbiose stable avec la culture de l’hôte. L’essai de plusieurs espèces hôtes avec le même filtrat de saccharibactéries de la cavité buccale aura généralement un faible taux de réussite (Figure 1B) car l’interaction symbiote-hôte est très spécifique. Un chercheur peut également tester le même hôte avec des filtrats de plusieurs sujets différents. Si un bon organisme hôte (tel que Arachnia propionica ou Schaalia odontolytica) est utilisé, un taux de réussite de 50% peut être attendu.
Le test par PCR est crucial. Des chercheurs expérimentés ont tenté de confirmer l’infection par microscopie, seulement pour signaler des faux positifs. Les cellules saccharibactériennes sont petites et difficiles à distinguer entre les vésicules ou les renflements irréguliers de l’enveloppe cellulaire. Un signal PCR stable à travers plusieurs passages est la clé pour confirmer une infection réussie.
Au fur et à mesure que les cultures infectées se développent, une croissance turbide normale devrait apparaître. Au fur et à mesure que la symbiose s’établira, les cultures infectées apparaîtront moins turbide que les cultures d’organismes hôtes non infectés (figure 2A). Dans certains cas, les cultures infectées peuvent sembler cesser complètement de croître et ne pas devenir turbide du tout. Cela peut être dû à une infection où les cellules saccharibactéries submergent l’organisme hôte. L’ajout d’un hôte « frais » (non infecté) à ces cultures devrait fournir une population d’hôte suffisante pour soutenir la croissance continue des parasites des saccharibactéries.
La prolifération, ou les cultures excessivement turbides, peuvent indiquer une contamination par un contaminant de laboratoire ou une autre petite bactérie buccale qui a pu passer à travers le filtre de 0,2 μm. Campylobacter et Capnocytophaga spp. sont des contaminants oraux typiques de ces expériences. Ceci peut être confirmé en plaquant la culture et en recherchant des colonies qui sont atypiques de l’organisme hôte suivies du séquençage de l’ARNr 16S. Si une contamination est observée, le filtrage de ces cultures à travers un filtre de 0,2 μm est généralement suffisant pour éliminer les contaminants. Les cellules de saccharibactéries dans le filtrat peuvent être concentrées par centrifugation et utilisées pour réinfecter une culture hôte pure.
Une autre façon de purifier une culture contaminée est de choisir des colonies infectées à partir du placage d’une culture infectée. Les colonies d’hôtes infectés peuvent parfois être identifiées par une forme de colonie irrégulière par rapport aux colonies non infectées (figure 2B-D). Ces colonies irrégulières dépendent du titre des saccharibactéries dans la culture binaire et une plus petite proportion de colonies semblera irrégulière si le titre est faible. Cela peut faciliter l’identification des colonies infectées, qui peuvent être cueillies et utilisées pour démarrer une culture binaire pure. Si aucune colonie irrégulière n’est observée sur le placage d’une culture infectée par des Saccharibactéries, il est possible que le symbiote soit à un titre faible ou ne provoque pas de colonies de forme irrégulière. Dans un tel cas, les colonies de dépistage par PCR d’apparence normale peuvent montrer une infection par les saccharibactéries, mais à un faible taux (2-10% de toutes les colonies).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> Figure 1: Résultats typiques de la PCR des infections à Saccharibactéries des cultures hôtes. (A) Un produit de PCR indiquant la présence de Saccharibactéries peut ne pas apparaître avec l’infection initiale, mais peut apparaître et devenir plus fort dans les passages ultérieurs au fur et à mesure que la coculture s’établit. (B) La plupart des hôtes infectés par le filtrat enrichi en saccharibactéries ne soutiendront pas leur croissance en raison de la spécificité de la symbiose. Dans cet exemple, seulement A. propionica a été avec succès infecté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> Figure 2: Caractéristiques de croissance des cultures infectées par les saccharibactéries. (A) Les courbes de croissance des cultures infectées et non infectées d’A. propionica montrant une culture infectée ne se développeront pas à la même densité que le témoin non infecté et apparaîtront moins turbiques. (B-D) Le placage des cocultures peut produire des colonies irrégulières, causées par des infections à Saccharibateria. Les colonies irrégulières diminueront en proportion par rapport au titre de Saccharibacteria dans la coculture. (B) Hôte avec un niveau élevé de saccharibactéries. (C) 10 fois dilués Saccharibacteria (D) Culture hôte non infectée. Les flèches blanches indiquent des exemples de colonies irrégulières. Barre d’échelle = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous démontrons une méthode pour isoler les membres difficiles à cultiver du nouvel embranchement bactérien, les saccharibactéries, en filtrant la plaque dentaire et en co-cultivant avec des bactéries hôtes.

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Les saccharibactéries sont des parasites obligatoires qui nécessitent une co-culture avec des bactéries hôtes appropriées. En tant que saccharibactéries orales humaines peuvent être facilement isolées pour la plupart des individus utilisant des espèces bactériennes hôtes connues. Ce protocole permettra à tout investigateur ou laboratoire d’isoler ses propres souches en co-culture binaire.Cette technique utilise des dispositifs et des équipements simples présents dans la plupart des laboratoires microbiologiques et a été utilisée avec succès pour la culture de plus de 30 isolats représentant six espèces de saccharibactéries. Ce protocole peut être utile pour l’isolement d’autres espèces de rayonnement candidates suivies, ainsi que des saccharibactéries de différents environnements et d’autres mammifères si des hôtes actinobactériens appropriés peuvent être identifiés et isolés. Andrew Collins, un ancien boursier postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, commencez des cultures de bactéries hôtes telles que l’arachnia propionica, avec suffisamment de temps pour qu’elles atteignent une phase stationnaire précoce. Pour lancer la culture, inoculez deux à cinq millilitres de bouillon de soja tryptique contenant 0,1% d’extrait de levure avec de l’arachnia propionica et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, assemblez les porte-filtres avec des membranes filtrants de 0,2 micromètre gravées sur chenilles.Enveloppez-les dans du papier d’aluminium et stérilisez par autoclavage, ainsi que des tubes à centrifuger et des ensembles de bouchons. Stériliser les fournitures supplémentaires en cas de contact accidentel avec des surfaces non stériles. Recueillir la plaque dentaire en grattant le long de la ligne de gencive, à l’aide d’un point de papier stérile, curette gracieuse, ou un cure-dent stérile ou pipette pointe, et le transférer à un tampon approprié tel que MRD ou PBS.Conservez l’échantillon sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à aller plus loin. Ressuscitez vigoureusement la plaque dentaire à l’aide d’une combinaison de vortex et de pipetage avec une petite pointe de pipette, puis ajoutez l’échantillon de plaque remise en suspension à un tube contenant neuf millilitres de tampon MRD. Déballez soigneusement un ensemble de filtre stérile à l’aide d’une technique aseptique.Démêchez un quart de tour et serrez à nouveau le porte-filtre pour vous assurer que les filets sont correctement engagés et que l’appareil est correctement fermé. Laver la membrane en faisant passer 10 millilitres de tampon MRD à travers l’appareil, à l’aide d’une seringue. Pour appliquer l’échantillon sur le filtre lavé, retirez le piston d’une seringue et fixez-le à l’appareil filtrant.Placez un tube de centrifugation stérile sous cet appareil filtrant pour attraper le filtrat, puis versez l’échantillon dentaire dispersé dans la seringue et chargez-le sur le filtre. Appliquez ensuite une légère pression sur le piston pour pousser l’échantillon à travers le filtre. Lavez la membrane avec un autre tampon MRD de 10 millilitres et collectez le flux dans le même tube que l’échantillon filtré.Ensuite, coiffez le tube aseptiquement et maintenez sur la glace. Faites une marque d’orientation sur le tube et le capuchon pour identifier l’emplacement de la pastille cellulaire après centrifugation. Placer le tube dans une centrifugeuse à grande vitesse avec la marque sur la face supérieure et centrifuger les échantillons à 60 000 G pendant une heure à quatre degrés Celsius.Après centrifugation, versez soigneusement le surnageant, en gardant la pastille sur la face supérieure du tube. Puis ressusciter la pastille dans un à deux millilitres de tampon MRD en vortexant vigoureusement. Préparer les tubes de culture en aliéquotant deux millilitres de milieux de croissance appropriés dans les tubes.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de culture pendant la nuit d’organismes hôtes et 100 à 200 microlitres d’échantillon filtré ressuscité à chaque tube. Incuber les échantillons combinés dans des conditions appropriées pour l’organisme hôte. Faire passer les cellules tous les deux à trois jours en transférant 200 microlitres de la culture binaire vers deux millilitres de milieu de croissance frais dans un nouveau tube.Si les cultures passées ne montrent aucune croissance à 200 microlitres de culture hôte non infectée, lors de la passaging des cellules, renvoyer les tubes inoculés à l’incubateur. Aliquote 24 microlitres du mélange maître PCR dans un tube PCR de 0,2 millilitre. À une microlitre de culture infectée par des saccharibactéries, placez le tube dans un cycleur Thermo.Définissez le programme PCR comme décrit dans le manuscrit de texte. Chargez et exécutez les produits PCR sur un gel Agros à 1%. Une bande d’environ 600 bases confirmera la présence de saccharibactéries.Pour confirmer la pureté des cultures positives, effectuer une dilution en série de 10 fois de la co-culture de saccharibactéries dans un tampon stérile, et étaler 100 microlitres sur une plaque de gélose. Incuber la culture dans des conditions de croissance appropriées et observer les organismes contaminants. Une bande d’environ 600 bases confirmera la présence de saccharibactéries.La détection par PCR peut sembler négative dans les cultures d’infection initiales en raison d’un faible nombre de symbiotes de saccharibactéries. Cependant, après quelques passages, un produit pcr fort devrait apparaître, indiquant qu’une infection stable s’est produite. L’essai de plusieurs espèces hôtes avec le même filtrat de saccharibactéries aura généralement un faible taux de réussite.Comme l’interaction symbiote hôte est très spécifique. Au fur et à mesure que les cultures infectées se développent, une croissance turbide normale devrait apparaître. Au fur et à mesure que la symbiose s’établit, les cultures infectées apparaîtront moins turbide que les cultures d’organismes hôtes non infectés.Une culture contaminée peut être purifiée en cueillant des colonies infectées après le placage. Les colonies infectées peuvent parfois être identifiées par une forme de colonie irrégulière par rapport aux colonies non infectées. La proportion d’une colonie régulière dépend du titre des saccharibactéries dans la culture binaire.Si le titre est faible, moins de colonies apparaîtront irrégulières, ce qui facilite la sélection des colonies infectées et le démarrage d’une culture binaire pure. Les cultures peuvent ne pas sembler positives pour plusieurs passages. On aura donc besoin de quelques patients.Il est également nécessaire de vérifier régulièrement la contamination des cultures binaires, car cela peut déstabiliser la culture et entraîner la mort des saccharibactéries. La culture binaire peut être utilisée pour toutes sortes d’expériences de laboratoire. L’ADN et l’ARN peuvent être extraits pour le séquençage du génome et l’analyse du transcriptome, respectivement.La pathogénicité peut également être étudiée à l’aide de modèles animaux.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Collins, A. J., et al., Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques à partir de la cavité buccale. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo démontre l’établissement et le maintien d’une culture binaire de Saccharibacteria et de sa bactérie hôte en les co-incubant séquentiellement dans un milieu de croissance spécifique à l’hôte.

Etablissement d’une culture binaire de saccharibactéries avec des bactéries hôtes

Source : Arroyo, M. C., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro . J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre l’évaluation de la viabilité d’une communauté microbienne orale synthétique lors d’une digestion orale, gastrique et intestinale simulée. La survie bactérienne est quantifiée après chaque phase, révélant un déclin progressif dû au stress digestif.

Exposer une communauté bactérienne orale synthétique à des phases simulées de digestion

Source : Collins, A. J., et al., Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques à partir de la cavité orale. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo démontre l’utilisation de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour détecter les saccharibactéries dans une culture binaire avec des Actinomyces. Le protocole décrit l’amplification de l’ADN et l’électrophorèse sur gel afin de confirmer une interaction stable hôte-parasite.

Détection des saccharibactéries en culture binaire utilisant la réaction en chaîne par polymérase

Source : Schlafer, S, et Frost Kristensen, M. Surveillance du pH extracellulaire dans des biofilms inter-royaumes à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la culture de biofilms inter-règnes de Streptococcus mutans et Candida albicans dans des conditions de type oral pour modéliser les interactions bactériennes-fongiques, permettant d’étudier la synergie microbienne, l’adhésion médiée par le glucan et la virulence acidogénique dans la pathogenèse orale.

Établissement de biofilms bactérien-fongiques inter-règnes pour l’étude de la pathogenèse orale

Source : Miquel Guennoc, C., et al. Nouvelle méthode d’analyse qualitative multi-échelle des biofilms bactériens sur des colonies fongiques filamenteuses utilisant la microscopie confocale et électronique. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la préparation d’une culture fongique sur des membranes de cellophane traitées pour soutenir la formation de colonies et la croissance radiale. Il montre ensuite la culture et la préparation des cellules bactériennes du sol pour des tests d’interaction.

Établissement d’une coculture fongique-bactérienne pour la formation de biofilms

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et...

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Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

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