Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques de la cavité buccale

Les saccharibactéries sont des parasites obligatoires qui nécessitent une co-culture avec des bactéries hôtes appropriées. En tant que saccharibactéries orales humaines peuvent être facilement isolées pour la plupart des individus utilisant des espèces bactériennes hôtes connues. Ce protocole permettra à tout investigateur ou laboratoire d’isoler ses propres souches en co-culture binaire.

Cette technique utilise des dispositifs et des équipements simples présents dans la plupart des laboratoires microbiologiques et a été utilisée avec succès pour la culture de plus de 30 isolats représentant six espèces de saccharibactéries. Ce protocole peut être utile pour l’isolement d’autres espèces de rayonnement candidates suivies, ainsi que des saccharibactéries de différents environnements et d’autres mammifères si des hôtes actinobactériens appropriés peuvent être identifiés et isolés. Andrew Collins, un ancien boursier postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, commencez des cultures de bactéries hôtes telles que l’arachnia propionica, avec suffisamment de temps pour qu’elles atteignent une phase stationnaire précoce. Pour lancer la culture, inoculez deux à cinq millilitres de bouillon de soja tryptique contenant 0,1% d’extrait de levure avec de l’arachnia propionica et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, assemblez les porte-filtres avec des membranes filtrants de 0,2 micromètre gravées sur chenilles.

Enveloppez-les dans du papier d’aluminium et stérilisez par autoclavage, ainsi que des tubes à centrifuger et des ensembles de bouchons. Stériliser les fournitures supplémentaires en cas de contact accidentel avec des surfaces non stériles. Recueillir la plaque dentaire en grattant le long de la ligne de gencive, à l’aide d’un point de papier stérile, curette gracieuse, ou un cure-dent stérile ou pipette pointe, et le transférer à un tampon approprié tel que MRD ou PBS.

Conservez l’échantillon sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à aller plus loin. Ressuscitez vigoureusement la plaque dentaire à l’aide d’une combinaison de vortex et de pipetage avec une petite pointe de pipette, puis ajoutez l’échantillon de plaque remise en suspension à un tube contenant neuf millilitres de tampon MRD. Déballez soigneusement un ensemble de filtre stérile à l’aide d’une technique aseptique.

Démêchez un quart de tour et serrez à nouveau le porte-filtre pour vous assurer que les filets sont correctement engagés et que l’appareil est correctement fermé. Laver la membrane en faisant passer 10 millilitres de tampon MRD à travers l’appareil, à l’aide d’une seringue. Pour appliquer l’échantillon sur le filtre lavé, retirez le piston d’une seringue et fixez-le à l’appareil filtrant.

Placez un tube de centrifugation stérile sous cet appareil filtrant pour attraper le filtrat, puis versez l’échantillon dentaire dispersé dans la seringue et chargez-le sur le filtre. Appliquez ensuite une légère pression sur le piston pour pousser l’échantillon à travers le filtre. Lavez la membrane avec un autre tampon MRD de 10 millilitres et collectez le flux dans le même tube que l’échantillon filtré.

Ensuite, coiffez le tube aseptiquement et maintenez sur la glace. Faites une marque d’orientation sur le tube et le capuchon pour identifier l’emplacement de la pastille cellulaire après centrifugation. Placer le tube dans une centrifugeuse à grande vitesse avec la marque sur la face supérieure et centrifuger les échantillons à 60 000 G pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après centrifugation, versez soigneusement le surnageant, en gardant la pastille sur la face supérieure du tube. Puis ressusciter la pastille dans un à deux millilitres de tampon MRD en vortexant vigoureusement. Préparer les tubes de culture en aliéquotant deux millilitres de milieux de croissance appropriés dans les tubes.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de culture pendant la nuit d’organismes hôtes et 100 à 200 microlitres d’échantillon filtré ressuscité à chaque tube. Incuber les échantillons combinés dans des conditions appropriées pour l’organisme hôte. Faire passer les cellules tous les deux à trois jours en transférant 200 microlitres de la culture binaire vers deux millilitres de milieu de croissance frais dans un nouveau tube.

Si les cultures passées ne montrent aucune croissance à 200 microlitres de culture hôte non infectée, lors de la passaging des cellules, renvoyer les tubes inoculés à l’incubateur. Aliquote 24 microlitres du mélange maître PCR dans un tube PCR de 0,2 millilitre. À une microlitre de culture infectée par des saccharibactéries, placez le tube dans un cycleur Thermo.

Définissez le programme PCR comme décrit dans le manuscrit de texte. Chargez et exécutez les produits PCR sur un gel Agros à 1%. Une bande d’environ 600 bases confirmera la présence de saccharibactéries.

Pour confirmer la pureté des cultures positives, effectuer une dilution en série de 10 fois de la co-culture de saccharibactéries dans un tampon stérile, et étaler 100 microlitres sur une plaque de gélose. Incuber la culture dans des conditions de croissance appropriées et observer les organismes contaminants. Une bande d’environ 600 bases confirmera la présence de saccharibactéries.

La détection par PCR peut sembler négative dans les cultures d’infection initiales en raison d’un faible nombre de symbiotes de saccharibactéries. Cependant, après quelques passages, un produit pcr fort devrait apparaître, indiquant qu’une infection stable s’est produite. L’essai de plusieurs espèces hôtes avec le même filtrat de saccharibactéries aura généralement un faible taux de réussite.

Comme l’interaction symbiote hôte est très spécifique. Au fur et à mesure que les cultures infectées se développent, une croissance turbide normale devrait apparaître. Au fur et à mesure que la symbiose s’établit, les cultures infectées apparaîtront moins turbide que les cultures d’organismes hôtes non infectés.

Une culture contaminée peut être purifiée en cueillant des colonies infectées après le placage. Les colonies infectées peuvent parfois être identifiées par une forme de colonie irrégulière par rapport aux colonies non infectées. La proportion d’une colonie régulière dépend du titre des saccharibactéries dans la culture binaire.

Si le titre est faible, moins de colonies apparaîtront irrégulières, ce qui facilite la sélection des colonies infectées et le démarrage d’une culture binaire pure. Les cultures peuvent ne pas sembler positives pour plusieurs passages. On aura donc besoin de quelques patients.

Il est également nécessaire de vérifier régulièrement la contamination des cultures binaires, car cela peut déstabiliser la culture et entraîner la mort des saccharibactéries. La culture binaire peut être utilisée pour toutes sortes d’expériences de laboratoire. L’ADN et l’ARN peuvent être extraits pour le séquençage du génome et l’analyse du transcriptome, respectivement.

La pathogénicité peut également être étudiée à l’aide de modèles animaux.