Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane
20 novembre 2021
Une sonde de force biombrane (BFP) est une technique de spectroscopie de force dynamique (DFS) in situ. BFP peut être utilisé pour mesurer la constante de ressort des interactions moléculaires sur les cellules vivantes. Ce protocole présente une analyse de la constante de ressort pour les liaisons moléculaires détectées par BFP.
Cette vidéo décrit les procédures étape par étape sur l’utilisation de biomembrane Force Probe, ou BFP pour mesurer la constante de ressort moléculaire. En force, le BFP a récemment émergé dans la surface de la cellule native ou dans l’analyse de spectroscopie de force dynamique SITU. L’objectif principal de cette technique est de mesurer la génétique de liaison à une seule molécule.
Cette procédure d’analyse de données est un message simple mais puissant et fournit des informations mécaniques, en particulier la force dynamique et l’inflammation de la membrane cellulaire exprimant les molécules. Au cours du cycle d’expérience BFP, le pari du microbiome de la sonde avec le globule rouge et l’homologation, la cellule cible et la liaison moléculaire du récepteur du ligand entre la sonde et la cible peut être considéré comme un système cérébral connecté en série. Selon la loi de Hooke, la réciproque de la constante de ressort totale d’un système de ressort connecté en série est égale à la somme de la constante de ressort inverse de chaque composant, comme le montre l’équation.
La constante de ressort des globules rouges est calculée en fonction du mouvement des événements, qui dépend de la radiale de la micropipette de la sonde dans l’orifice. Les globules rouges, la zone de contact circulaire entre les globules rouges et l’homologation et la pression d’aspiration de la micro-pipette. Les données routières BFP sont obtenues par un instrument virtuel de vue à gauche fait maison, qui contrôle le mouvement de la micro-pipette cible par un traducteur DE SON.
Un cycle tactile PFP complet se compose de cinq étapes. Approche.Impinge.Contact. Se rétracter et se dissocier. Au début, la position Robusto APICS est notée comme X est égal à 0 en noir deshine.
La cible est ensuite entraînée par une pièce ou un traducteur pour empiéter et comprimer le robusto pour provoquer un mouvement d’homologation négatif. Vous le notez comme X plus petit que zéro dans la ligne de tiret rouge. Dans l’étage de rétraction, le busto rouge se déplace de la position X plus petite que zéro vers la position X égale à zéro appelée phase de compression.
Si une liaison est formée entre le complexe de molécules du récepteur du ligand, le globule rouge serait encore plus différent d’une autre direction positive. Cette période X supérieure à zéro est appelée phase de traction de l’étape de rétraction. L’étape de rétraction est la partie la plus critique pour déterminer la constante de ressort de la molécule de liaison.
Collectez des données routières force versus temps à l’aide de la plateforme d’acquisition de données BSP. Chaque expérience enregistre généralement 50 à 200 cycles tactiles, Ouvrez le logiciel d’analyse de données PFP. Cliquez sur l’icône du dossier jaune et sélectionnez le fichier de données de ligne correspondant en double-cliquant dessus.
Nous sommes au programme. Cliquez ensuite sur les boutons fléchés haut et bas pour basculer entre les événements. Utilisation des critères d’exclusion des valeurs aberrantes pour filtrer les événements non valides.
Sélectionnez le type de données d’exportation qui est forcé au format d’heure et choisissez la plage d’état appropriée. Cliquez sur le bouton Exporter les données du tracé. Les données exportées sont enregistrées sous forme de fichier texte par défaut.
Ce fichier texte contient deux colonnes de données. C’est la première colonne représentant les papas de temps et la deuxième colonne représentant la force correspondante à chaque point temporel. Tracez la courbe force/temps à l’aide d’un tableur pour obtenir la courbe forcée versus déplacement.
Multipliez la valeur temporelle de chaque point de données par le mouvement Willow Steel PSO. Élilinez le premier point de données à zéro en soustrayant la plus petite valeur de déplacement de chaque point de données. Cette transformation horizontale n’affecte pas le calcul ultérieur de la constante de ressort.
Dans la courbe force/déplacement, deux groupes d’acteurs distincts étaient différents si la nouvelle pente de force peut être identifiée. Chacun représentant la phase de compression et la phase de style 10. Ajustez une ligne de régression à chaque groupe de données.
La ligne avec une pente plus raide représente la constante totale du ressort à une phase de compresseur notée K1. Et la ligne qui était la plus petite en haut représente la ligne à cette phase de style 10 désignée comme K2.As que j’ai mentionnée, la constante totale du ressort est la réciproque du fils de la constante de ressort de série de chaque composant. Pendant la phase de compression du mode battement-cellule, la liaison moléculaire n’est pas étirée, de sorte que la constante du ressort de liaison moléculaire n’est pas prise en considération. La constante de ressort de la cellule cible est décrite comme l’équation affichée où K1 représente la constante totale du ressort pendant la phase du compresseur.
Dans la phase de style 10 du mode beat to sell, la constante totale du printemps est la constante du soleil du printemps uverse de la liaison moléculaire des globules rouges. Et la cellule cible, utilisez l’équation affichée pour calculer la constante du ressort de liaison du moléculeur, qui K2 représente la constante totale du ressort. Vous lisez la phase des 10 arrêts.
En mode beat to beat, puisque la déformation B est négligeable, le terme qui décrit l’inverse de la constante de ressort de la cellule cible se rapproche de zéro, donc la constante totale de ressort dans la phase de compresseur est équivalente à la constante de ressort de globule rouge montrant l’équation suivante. Dans la phase de traction, la constante de ressort de la liaison moléculaire peut être calculée en soustrayant l’effet du globule rouge montrant l’équation suivante. Collecter les constantes de ressort de l’attitude d’intégration du vent latéral B, du complexe Beta 3, de la cellule K562 et du complexe d’intégration d’attitude de Febrifugine B Beta, calculer la moyenne et l’écart-type des constantes de ressort dérivées à l’échelle de Newton ou de nanomètres.
Maintenant, vous devriez avoir une meilleure compréhension des exigences pour mesurer et ressorter la constante à partir des données VFD. Les différences entre le mode beat to cell et le mode beat to beat doivent être remarquées. Différents services de présentation de molécules auront des défenses différentes à la mesure de la constante de ressort.
En conclusion, cette procédure étape par étape décrit comment effectuer une analyse de la constante de ressort moléculaire à l’aide de BFP. Nous prévoyons que des efforts futurs seront déployés pour automatiser et intégrer l’acquisition de données BFP et l’analyse DFS dans un seul programme de repos informatique. Rendre l’ensemble de l’analyse des données d’exploitation BFP plus convivial et plus élevé tout au long.
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Aperçu
La sonde de force de biomembrane (BFP) est une technique de spectroscopie de force dynamique utilisée pour mesurer la constante de ressort des interactions moléculaires sur des cellules vivantes. Ce protocole décrit l'analyse des constantes de ressort pour les liaisons moléculaires détectées par BFP.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectroscopie de force dynamique
- Interactions moléculaires
- Mécanique de la membrane cellulaire
Contexte
- La technique BFP mesure la liaison de molécules uniques.
- Elle fournit des informations mécaniques sur les membranes cellulaires.
- L'analyse est basée sur la loi de Hooke.
- Elle implique des interactions entre des sondes et des cellules cibles.
Objectif de l'étude
- Mesurer les constantes de ressort moléculaires.
- Analyser la dynamique des liaisons moléculaires.
- Améliorer la compréhension des interactions des membranes cellulaires.
Méthodes utilisées
- Utilisation de la sonde de force de biomembrane (BFP).
- Analyse de spectroscopie de force dynamique in situ.
- Analyse des données d'interactions moléculaires.
- Application de la loi de Hooke pour le calcul de la constante de ressort.
Principaux résultats
- Mesure réussie des constantes de ressort moléculaires.
- Aperçu de la dynamique des liaisons moléculaires.
- Démonstration de l'efficacité de BFP dans l'analyse de cellules vivantes.
- Validation des modèles théoriques par des données expérimentales.
Conclusions
- BFP est un outil puissant pour étudier les interactions moléculaires.
- La technique améliore notre compréhension de la mécanique cellulaire.
- Les applications futures peuvent inclure des études biologiques plus larges.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Measuring molecular spring constants via biomembrane force probe spectroscopy provides quantitative mechanical insights into ligand-receptor interactions, supporting target validation by characterizing bond stability and conformational dynamics. This approach enables mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular mechanics to functional signaling, informing go/no-go decisions before compound screening. The method enhances predictive confidence in target selection by revealing force-dependent binding behaviors that correlate with physiological mechanosensing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying bond stiffness and rupture forces under physiological loading rates.
- Operational Value: Enables direct comparison of molecular variants or mutants to identify stabilizing mutations that prolong bond lifetime.
- Scientific Value: Clarifies force-dependent conformational changes in receptors, supporting allosteric mechanism validation.
- Operational Value: Provides benchmark data for structure-guided design of therapeutics with optimized mechanical resilience.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-displacement curves that serve as orthogonal readouts for binding affinity in assay triage.
- Operational Value: Standardizes spring constant measurements across replicates using outlier exclusion criteria and regression fitting.
- Scientific Value: Distinguishes specific from nonspecific interactions based on tensile phase slope characteristics in bead-bead mode.
- Operational Value: Enables high-throughput collection of 50-200 touch cycles per experiment for robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular spring constants to cellular mechanosensing outputs, informing pathophysiological relevance in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from purified systems to native cell surfaces via bead-cell and bead-bead modes.
- Scientific Value: Measures cell contribution to total spring constant, deconvolving target-specific molecular mechanics from probe or cell artifacts.
- Operational Value: Facilitates cross-platform comparison of molecular mechanics using standardized Hooke's law-based analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanical phenotyping of targets after initial binding confirmation but before large-scale screening, helping prioritize targets with favorable force-stability profiles.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring how molecular bonds respond to mechanical perturbation, revealing catch-bond or slip-bond behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spring constant outputs that enable rank-ordering of ligand variants or therapeutic candidates.
- Analytics: Employs linear regression on force-displacement data to derive spring constants (K1, K2) from compressive and tensile phases, enabling condition comparison.
- Translational Research: Links molecular mechanics to cell-scale responses by measuring target cell contribution in bead-cell mode, supporting mechanistic continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nanotool for mechanical phenotyping across diverse receptor-ligand systems, reducing revalidation effort in follow-up campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, quantitative measures of bond elasticity and force-dependent kinetics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized data acquisition, outlier filtering, and exportable force-time datasets for external validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying mechanically fragile targets early, reducing investment in high-risk pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on bond stability metrics, complementing traditional affinity and selectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dynamic force spectroscopy, micropipette manipulation, and force calibration using red blood cell standards.
- Depends on custom-built BFP setup with piezoelectric translators and homemade virtual instrumentation for precise displacement control.
- Necessitates cross-team standardization of outlier criteria, time-range selection, and regression fitting protocols across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-cell to bead-bead mode to isolate molecular contributions from cellular mechanics.
- Limited by the need for stable molecular tethering and functional ligand-receptor expression on probe or target surfaces to avoid artifactual signals.
