Analyse de la restriction SAMHD1 par cytométrie en flux dans les cellules myéloïdes humaines U937
13 juin 2021
La méthode décrite ici est établie pour déterminer l’étendue de la restriction du VIH-1 par la protéine inhibitrice cellulaire SAMHD1. Les cellules U937 de la lignée myéloïde humaine sont transduites avec un vecteur d’expression SAMHD1 co-exprimant YFP, différenciées puis contestées avec la RFP VIH. Le niveau de restriction est déterminé par analyse par cytométrie de flux.
Avec un intérêt croissant pour le rôle des facteurs cellulaires dans l’infection par le VIH des macrophages, nous avons développé un système d’analyse flexible, en particulier pour SAM HG one, qui n’est pas exprimé dans les cellules U937. Le principal avantage du système est sa flexibilité. Une fois configuré, il peut être utilisé pour analyser une variété de protéines, de cellules ou de virus cibles.
Il est important de maintenir la santé des cellules et d’être à l’aise avec la cytométrie en flux multicolore. Allumez le cytomètre et l’ordinateur 10 minutes avant de commencer l’analyse. Assurez-vous que les déchets sont vides et que le réservoir de la gaine est plein.
Ensuite, connectez-vous et ouvrez le logiciel d’analyse. Après avoir déplacé le bras, retirez le tube d’eau. Réglez le débit sur élevé et appuyez sur prime.
Attendez que la lumière s’éteigne et répétez ce processus trois fois de plus. Replacez le tube d’eau et faites fonctionner à un débit élevé pendant trois minutes. Ensuite, réglez le débit sur faible et appuyez sur veille jusqu’à l’acquisition.
Sélectionnez expérience, nouvelle expérience, et appuyez sur OK pour sélectionner une expérience vide, faites un clic droit sur l’expérience et ajoutez un nouveau spécimen. Appuyez sur OK pour vider le panneau. Faites un clic droit pour renommer avec un nom approprié et ouvrez l’échantillon en cliquant sur le signe plus pour afficher un nouveau tube.
Double-cliquez sur le tube pour voir les paramètres du cytomètre dans l’inspecteur. Dans le menu des paramètres, supprimez les fluorochromes inutiles à l’exception du laser bleu 53030 et du laser jaune 61020. Dans la feuille de calcul, créez un diagramme de points de zone de diffusion avant par rapport à la zone de dispersion latérale, un histogramme YFP, un histogramme RFP et un diagramme à points RFP par rapport à YFP en cliquant sur l’icône correspondante et en modifiant les axes en cliquant sur l’étiquette de l’axe.
Chargez la commande non infectée et non transduite et appuyez sur Exécuter sur la machine. Appuyez ensuite sur acquérir dans le tableau de bord d’acquisition. Ajustez les tensions de diffusion avant et latérale dans le tableau de bord pour positionner les cellules dans le quadrant inférieur gauche.
Faites le tour de cette population et étiquetez-la comme P un. Faites un clic droit sur les autres tracés et sélectionnez Afficher P un pour retirer les débris de l’analyse suivante. Ajustez les tensions RFP et YFP vers le bas afin que le pic se trouve à gauche de l’histogramme.
Chargez le contrôle monocolore pour YFP et appuyez sur acquérir. Ajustez la tension YFP dans le tableau de bord afin que les cellules les plus fluorescentes se trouvent dans la plage du détecteur. Répétez ensuite la même chose pour le contrôle RFP.
Sélectionnez l’expérience. Accédez à la configuration de la compensation et sélectionnez créer des contrôles de compensation et acceptez de basculer vers une feuille de calcul normale, puis sélectionnez une feuille de calcul normale non tachée. Appuyez sur la fuite et acquérez pour le contrôle non taché.
Dessinez une porte P autour des cellules intactes et enregistrez. Retirez le tube et mettez la machine en veille. Faites un clic droit sur P one.
Cliquez sur Appliquer à tous les contrôles de rémunération et passez à la feuille de travail normale de la DP. Appuyez sur l’exécution et enregistrez le contrôle RFP monochrome et le logiciel fermera automatiquement les cellules positives. Mettez la machine en veille et répétez la même chose pour la commande YFP.
Sélectionnez expérimenter, accédez à la configuration de la rémunération, sélectionnez calculer la rémunération, puis cliquez sur le lien et enregistrez. Basculez vers la feuille de calcul globale et revenez au tube de l’échantillon. Acquérir les cellules transduites avec SAM HD de type sauvage une infectée par la RFP du VIH et vérifier que quatre populations distinctes peuvent être vues dans les coins des quadrants alignés verticalement et horizontalement pour YFP et RFP.
Retirez le tube et appuyez sur la touche veille. Rechargez l’échantillon non transduit et non infecté et appuyez sur Exécuter. Dans le tableau de bord d’acquisition, réglez la porte d’arrêt sur P un et les événements pour enregistrer 30 000 événements.
Enregistrement de presse. Répétez la même chose pour les autres échantillons et témoins en appuyant sur le tube suivant entre chaque tube. Renommez les exemples lors de l’exécution ou de la post-percée et exportez les données sous forme de fichiers FCS à points.
Ouvrez le logiciel et faites glisser tous les fichiers FCS dans le tableau de bord. Sélectionnez les contrôles de compensation et faites-les glisser dans le sous-dossier de compensation. Double-cliquez sur le tube non transduit et non infecté pour ouvrir le fichier et diffuser vers l’avant un ou vers l’autre un tracé.
Sélectionnez l’outil polygonal et la porte sur la population cellulaire intacte à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche et nommez-les cellules. Déplacez l’étiquette afin qu’elle ne masque pas les cellules. Faites glisser cette porte vers toute la population de tubes dans la barre de tous les échantillons.
Faites défiler toute la population à l’aide des boutons fléchés horizontaux pour vous assurer que le point de contrôle approprié pour chaque tube. Double-cliquez sur les cellules et ajustez les axes en hauteur par rapport à la surface. Sélectionnez la grande population unique à l’aide d’une porte rectangulaire pour exclure les doublets et permettre au logiciel de suggérer de la nommer automatiquement en tant que cellules uniques.
Ensuite, faites glisser cette porte vers toutes les populations de cellules et vérifiez que le contrôle est approprié pour tous les échantillons. Sélectionnez la population de cellules individuelles pour l’échantillon non infecté et non transduit. Changez l’axe Y en laser bleu compensé pour YFP et l’axe X en laser jaune compensé pour RFP.
Sélectionnez l’outil de contrôle du quadrant et cliquez à l’extrémité supérieure droite de la population de cellules négatives. Appliquez ce point de contrôle préliminaire à toutes les populations de cellules uniques en la faisant glisser sur la porte parente dans la barre de tous les échantillons. Si les portes du quadrant ne séparent pas la population de manière satisfaisante, placez les quadrants individuels à l’aide de l’outil polygonale.
Faites défiler jusqu’au type sauvage SAM HD un seul échantillon pour vérifier le bon blocage entre les cellules YFP YFP négatives non transduites et YFP positives. Utilisez la vue de contour pour distinguer les cellules négatives des cellules YFP faibles. Utilisez la meilleure distinction entre YFP négatif et positif qui est valide pour tous les échantillons et faites défiler les échantillons pour vérifier le point de contrôle en ce qui concerne la positivité YFP.
Faites défiler jusqu’à l’échantillon non transduit infecté par la DP VIH et vérifiez si le point de contrôle entre l’appel d’offres négatif non infecté et le DP positif infecté est correct. Utilisez la vue de contour si nécessaire et faites défiler les échantillons restants pour vérifier que le point de contrôle est valide pour tous les échantillons. Chaque échantillon nécessite quatre quadrants.
T1 YFP positif, T2 double positif, Q3 RFP positif et T4 double négatif. Ouvrez l’éditeur de tableau et faites glisser les quatre portes du quadrant dans le tableau de bord. Sélectionnez pour classer et exceller dans la liste déroulante.
Choisissez la destination de votre fichier et cliquez sur créer une table. Enregistrez la feuille de calcul générée conformément aux conventions locales d’affectation de noms de fichiers. Cliquez sur l’icône de l’éditeur de mise en page pour exporter les représentations des tracés et des stratégies de gating.
Sélectionnez chaque population et faites-la glisser dans l’éditeur avec les axes, l’étiquetage et l’espacement requis. Pour créer une mise en page avec les mêmes tracés que ceux affichés pour tous les échantillons de la section de lot, saisissez-en un dans la colonne et appuyez sur Créer un rapport de lot. Dans le menu Fichier, sélectionnez l’échelle à la largeur et évitez les sauts de page.
Ensuite, enregistrez dans le format de fichier requis. Dans la feuille de calcul exportée, générez les colonnes comme décrit dans le manuscrit texte. Utilisez un logiciel d’analyse de données approprié pour faire la moyenne des données répliquées pour chaque construction SAM HD et calculer les valeurs du rapport de restriction.
Des diagrammes représentatifs YFP par rapport à RFP ont été générés pour des données optimales et sous-optimales. Le graphique de données sous-optimal indique que l’infection par le VIH était trop faible et a créé des difficultés d’indemnisation et de contrôle. Le ratio de restriction était de 0,5, ce qui est supérieur au ratio attendu de 0,3.
Les diagrammes du rapport de restriction pour les variantes de SAM HD one en ce qui concerne le type sauvage et le contrôle négatif ont été générés pour les données optimales et sous-optimales. Dans les données optimales, le type sauvage a montré la restriction attendue d’environ 0,2 et le témoin négatif HD 206 à sept AA avait le rapport de restriction de 1,0. La variante R372D était significativement différente du type sauvage, mais pas significativement différente du témoin négatif et perdait la capacité de restreindre.
Dans les données sous-optimales, le témoin négatif s’est comporté comme prévu, mais le type sauvage a montré un rapport de restriction de 0,5 en raison du faible taux d’infection. Le R143D a montré un phénotype intermédiaire statistiquement différent du type sauvage et du témoin négatif. La variante G209S était significativement différente du type sauvage mais pas significativement différente du témoin négatif et a donc perdu la capacité de restreindre.
Il est important d’avoir beaucoup de vos cellules de contrôle, en particulier si vous débutez dans la cytométrie en flux. Suite à cela ou en parallèle, l’analyse biochimique des mêmes mutants peut être effectuée pour former une image holistique.
Aperçu
Cet article décrit un dosage souple de cytométrie en flux à deux couleurs pour analyser l'activité de restriction de SAMHD1 contre le VIH-1 dans les cellules U937. La méthode permet une évaluation quantitative de la restriction virale médiée par SAMHD1 et la caractérisation de variants de SAMHD1, offrant ainsi une plateforme robuste pour l'étude des interactions hôte-virus dans les cellules myéloïdes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- SAMHD1 est une protéine cellulaire qui restreint la réplication du VIH-1 dans les cellules myéloïdes quiescentes.
- Les cellules U937 sont couramment utilisées en raison de leur faible expression endogène de SAMHD1.
- La cytométrie en flux permet une quantification précise des populations cellulaires infectées et transduites.
- Comprendre la fonction de SAMHD1 et ses variants est essentiel pour élucider les mécanismes de restriction virale.
Objectif de l'étude
- Développer et utiliser un dosage par cytométrie en flux à deux couleurs pour mesurer la restriction du VIH-1 par SAMHD1 dans les cellules U937.
- Évaluer l'impact des mutations de SAMHD1 sur l'activité de restriction.
- Fournir un système souple permettant d'analyser diverses protéines, types cellulaires et virus.
Méthodes utilisées
- Transduction de cellules U937 par des particules de type virus de la leucémie murine exprimant SAMHD1 et YFP.
- Différenciation des cellules à l'aide de myristate d'acétate de phorbol pour induire un phénotype quiescent.
- Infection par des particules de type virus VIH-1 exprimant RFP comme rapporteur.
- Analyse par cytométrie en flux pour distinguer et quantifier les populations positives pour YFP et RFP.
- Analyse des données pour calculer les rapports de restriction et comparer les constructions de SAMHD1 de type sauvage et mutantes.
Résultats principaux
- L'expression de SAMHD1 dans les cellules U937 entraîne une réduction de cinq fois de l'infection par le VIH (rapport de restriction d'environ 0,2).
- Les constructions mutantes de SAMHD1 (par exemple, HD206-7AA) perdent leur activité de restriction (rapport de restriction d'environ 1,0).
- Des variants tels que R372D et G209S perdent également la restriction, tandis que R143D présente un phénotype intermédiaire.
- La performance du test dépend de taux d'infection optimaux ainsi qu'une compensation et un positionnement des portes adéquats en cytométrie de flux.
Conclusions
- Le test de cytométrie en flux à deux couleurs est efficace pour quantifier la restriction du VIH-1 médiée par SAMHD1.
- Le système est adaptable à l'analyse de différentes variantes de SAMHD1 et de diverses conditions expérimentales.
- Des contrôles appropriés et des stratégies de sélection des événements sont essentiels pour obtenir des résultats fiables.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'analyse quantitative de la restriction du VIH-1 médiée par SAMHD1 dans les cellules U937 fournit une plateforme robuste pour explorer les interactions hôte-pathogène et valider fonctionnellement des cibles dans le cadre de la découverte d'antiviraux. Le dosage par cytométrie en flux à deux couleurs permet une mesure précise des phénotypes de restriction et soutient l'élimination des risques mécanistiques liés aux variants candidats. Ce protocole est directement pertinent pour le tri précoce de portefeuilles et pour renforcer la confiance prédictive dans l'évaluation des cibles antivirales.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la validation fonctionnelle de SAMHD1 en tant que facteur de restriction dans un contexte cellulaire contrôlé.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en quantifiant l'impact de substitutions d'acides aminés spécifiques sur l'activité de restriction.
- Permet une analyse comparative de constructions de type sauvage et mutantes afin d'évaluer la pertinence de la cible.
Développement de tests et criblage
- Établit un dosage reproductible et quantitatif permettant d'évaluer les phénotypes de restriction sur plusieurs constructions.
- Standardise les stratégies de sélection des populations cellulaires et de compensation pour des lectures fiables en cytométrie en flux à haut contenu.
- Prépare des systèmes cellulaires validés pour le criblage en aval de modulateurs de SAMHD1 ou de variants viraux.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les phénotypes de restriction avec la différenciation cellulaire et le statut métabolique afin d'améliorer la pertinence pathologique.
- Permet l'adaptation pour étudier les effets des modulateurs de SAMHD1, soutenant ainsi l'exploration de biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité allant de la découverte mécanistique à la validation dans des modèles précliniques lors de l'évaluation des facteurs d'hostilité restrictifs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cet essai s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis les premières études mécanistiques jusqu'à l'identification de candidats et la validation préclinique des facteurs de restriction de l'hôte.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur la fonction de SAMHD1 et l'analyse des voies associées dans les cellules myéloïdes.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles pour comparer l'activité de restriction entre différents construits et conditions.
- Analytique : Propose des mesures de rapport de restriction et des sorties statistiques pour des comparaisons fiables entre conditions.
- Recherche translationnelle : Permet d'évaluer l'activité de restriction dans divers états de différenciation et de métabolisme, facilitant ainsi l'alignement translationnel.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme souple et adaptable pour analyser diverses protéines, types cellulaires et cibles virales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études hôte-pathogène.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des tests pour des applications à haut débit.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller ou de non-aller et améliore l'efficacité du capital en permettant une détection précoce des risques associés aux cibles antivirales.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des cibles et des constructions candidates.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux multicolore et en stratégies de sélection des populations cellulaires pour une acquisition de données précise.
- Dépend de l'accès à un équipement de cytométrie en flux et à un logiciel d'analyse compatible.
- Exige une standardisation rigoureuse entre équipes des contrôles, de la compensation et des protocoles de sélection des populations cellulaires.
- Peut être adapté à différents systèmes cellulaires et constructions virales moyennant une optimisation appropriée.
- La performance du test est sensible aux taux d'infection et à la précision de la sélection des populations cellulaires, ce qui peut affecter la fiabilité des données.
