Un test d’activité enzymatique à haut débit pour sonder l’interaction de petites molécules avec la dNTPase SAMHD1

Cette méthode nous permet de caractériser quels agents chimiothérapeutiques sont hydrolysés par SAMHD1 et peut être utilisée comme test de criblage pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette enzyme. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, peu coûteuse et qu’elle fournit une grande quantité d’informations sur la façon dont différentes petites molécules interagissent avec cette enzyme. Miriam, une postdoctorante du groupe, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, préparez le tampon de réaction SAMHD1 complet en ajoutant Tween-20 et TCEP aux concentrations finales de 0,005 % et 0,3 millimolaire respectivement. Préparer la solution d’arrêt de l’EDTA en ajoutant de l’EDTA à une concentration finale de 7,9 millimolaires dans un tampon de réaction SAMHD1 complet. Préparez la solution de travail vert de malachite ou MG en mélangeant 10 parties de solution mère MG avec 2,5 parties de molybdate d’ammonium à 7 % et 0,2 partie de 11 % de Tween-20.

À l’aide d’une pipette multicanaux, diluer en série les composés d’essai dans le solvant concerné à 100 fois la concentration finale dans une plaque transparente en polypropylène à fond rond à 96 puits. diluer davantage ces composés à 25 fois la concentration finale avec un tampon de réaction SAMHD1 complet pour maintenir la concentration finale de solvant en dessous de 1 %Transférez cinq microlitres de composant dilué dans les puits appropriés d’une plaque d’essai transparente à fond plat de 384 puits et répétez la procédure avec des échantillons de contrôle contenant uniquement des solvants. Pour la préparation du mélange maître enzymatique, diluer la protéine humaine SAMHD1 recombinante et la pyrophosphatase recombinante dans un tampon de réaction SAMHD1 complet jusqu’à quatre fois la concentration finale souhaitée.

Préparer l’activateur ou le substrat dGTP en diluant la solution dans un tampon réactionnel SAMHD1 complet pour atteindre une concentration de 50 micromolaires. Aux puits contenant des dilutions de composés et un contrôle de solvant uniquement, distribuer cinq microlitres de mélange maître de pyrophosphatase SAMHD1 et, dans les puits de contrôle sans enzyme, ajouter cinq microlitres de tampon de réaction SAMHD1 complet. Versez ensuite 10 microlitres de solution de dGDP dans tous les puits pour démarrer la réaction et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.

Pour arrêter la réaction, ajoutez 20 microlitres de solution d’arrêt EDTA. Après avoir ajouté 10 microlitres de solution de travail MG à tous les puits, mélangez le contenu à l’aide d’un agitateur de plaque orbital à micropuits et centrifugez la plaque à 1000 x g pendant une minute. Incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante et lire l’absorption à 630 nanomètres dans un lecteur de plaques à micropuits.

Calculez l’écart-type des puits témoins positifs, puis calculez la moyenne. De même pour les puits témoins négatifs, calculez l’écart-type, puis calculez la moyenne. Calculer le facteur Z est un indicateur de la qualité du dosage.

Normaliser chaque valeur d’absorbance aux valeurs moyennes des témoins positifs et négatifs. Définition du contrôle positif sur l’activité 100%SAMHD1 et du contrôle négatif sur l’activité 0%SAMHD1. L’activité de SAMHD1 est fonction de la concentration du composé et s’adapte à une courbe dose-réponse à pente variable à quatre paramètres, permettant de déterminer la concentration inhibitrice à moitié maximale du composé.

Diluer les stocks d’analogues nucléotidiques et compléter le tampon de réaction SAMHD1 à quatre fois la concentration finale et transférer cinq microlitres dans les puits appropriés d’une plaque d’essai de 384 puits. Pour préparer l’enzyme SAMHD1 ou le mélange maître de pyrophosphatase, diluer la protéine humaine recombinante SAMHD1 et la pyrophosphatase d’Escherichia coli dans un tampon de réaction SAMHD1 complet jusqu’à ce qu’il atteigne le double de la concentration finale souhaitée. Préparer uniquement une solution de pyrophosphatase en diluant la pyrophosphatase recombinante d’Escherichia coli jusqu’à deux fois la concentration finale souhaitée dans le tampon de réaction SAMHD1 complet.

De même, préparer les activateurs GTP et dGTP alpha S en diluant le stock dans un tampon réactionnel SAMHD1 complet à quatre fois la concentration finale. Distribuer cinq microlitres de l’activateur, soit du GDP ou du dGTP alpha S, soit un tampon de réaction SAMHD1 complet dans les puits appropriés d’une plaque d’essai de 384 puits contenant les analogues nucléotidiques. Démarrer la réaction en distribuant 10 microlitres de mélange maître de pyrophosphatase SAMHD1, de pyrophosphatase seule ou de tampon de réaction SAMHD1 complet dans les puits appropriés et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.

Après avoir arrêté la réaction à l’aide d’une solution d’arrêt EDTA, ajoutez 10 microlitres de solution de travail MG dans tous les puits. Une fois le contenu mélangé, centrifugez la plaque à 1000 x g pendant une minute et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Mesurez ensuite l’absorbance à 630 nanomètres.

Calculez les valeurs moyennes d’absorbance pour les puits de réaction de la pyrophosphatase uniquement, qui seront la valeur de fond. Ensuite, soustrayez la valeur de fond des puits correspondants dans les réactions SAMHD1 ou pyrophosphatase. Enfin, tracez les valeurs d’absorbance corrigées pour chaque analogue nucléotidique avec des conditions tampon GTP et dGTP alpha S.

Dans la présente étude, l’absorbant a augmenté avec l’augmentation de la concentration de phosphate de sodium après l’incubation avec le réactif vert de malachite et a atteint la saturation à une concentration de 0,25 millimolaire. La plage de détection linéaire du phosphate est visible de 0,004 à 0,03 millimolaire. La nécessité d’avoir des composants d’essai pour obtenir une activité mesurable de SAMHD1 est illustrée.

Ni SAMHD1 ni la pyrophosphatase seules ne pourraient générer un phosphate organique en présence de dGTP. Cependant, lorsque tous les composants du test étaient présents, une augmentation du signal a été observée. Les courbes dose-réponse obtenues pour les composés inhibiteurs de SAMHD1 ont montré que l’augmentation des concentrations inhibe efficacement l’activité de SAMHD1.

L’hydroxyurée n’inhibe pas l’activité de SAMHD1 in vitro, ce qui a été indiqué par une activité non affectée de SAMHD1 avec des doses croissantes d’hydroxyurée. La liaison du dGTP aux deux sites allostériques active SAMHD1, permettant l’hydrolyse ultérieure de ce nucléotide, tandis que les trois autres dNTP canoniques nécessitent d’abord l’activation du GTP du premier site allostérique avant de pouvoir se lier au deuxième site allostérique puis d’être hydrolysés sur le site catalytique. Pour les analogues nucléotidiques, la clofarabine triphosphate est un activateur allostérique du site deux et un substrat car l’activité est observée en présence de GTP.

Alors que la cytarabine triphosphate n’est capable d’occuper le site catalytique que lorsque le dGTP alpha S est nécessaire pour observer l’activité. Aucune activité n’a été observée avec la gemcitabine triphosphate. Suite à l’identification de petites molécules inhibant SAMHD1 dans ce test par des approches physiques, telles que des tests de décalage thermique, il est possible d’interroger l’engagement de la cible.

La méthode présentée ici nous a aidés à comprendre quels médicaments anticancéreux peuvent être hydrolysés par SAMHD1 et à établir cette enzyme comme une cible thérapeutique potentielle pour surmonter la résistance aux médicaments.