Modifications de la méthode de Langendorff pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes

Ce protocole pourrait aider à améliorer le rendement auriculaire d’un cœur de souris perfusé. Le principal avantage de cette méthode est que les myocytes auriculaires et ventriculaires peuvent être isolés simultanément dans les mêmes conditions de digestion. Cette méthode pourrait fournir un aperçu des mécanismes des maladies cardiaques au niveau cellulaire et subcellulaire.

Après avoir euthanasié un mâle C57 noir six souris âgé de huit à 10 semaines, utilisez une pince à tissu pour soulever la peau du xiphoïde. Ensuite, à l’aide de ciseaux à tissu, faites une incision latérale mineure à travers la peau. Effectuez une dissection émoussée entre la peau et le fascia.

Étendez l’incision cutanée vers les aisselles en forme de V des deux côtés et continuez l’incision à travers la cage thoracique. Ensuite, à l’aide d’une pince tissulaire, serrez le sternum et déviez la cage thoracique vers le haut pour exposer complètement le cœur et les poumons. À l’aide d’une pince incurvée, décollez le péricarde.

Si le thymus recouvre les grands vaisseaux, utilisez deux pinces incurvées pour déchirer le thymus des deux côtés, puis tirez doucement la base du cœur vers la queue jusqu’à ce que l’aorte et ses artères ramifiées soient visibles comme un vaisseau sanguin en forme de Y. Transectez l’aorte à l’artère carotide commune gauche, puis coupez l’artère brachiocéphale. Excisez le cœur et immergez-le immédiatement dans une boîte de Pétri contenant la solution de Tyrode pour laver et pomper le sang résiduel.

Ensuite, transférez le cœur dans une autre boîte de Petri contenant la solution un. Sous un stéréomicroscope, à l’aide de ciseaux Iris fins, coupez tout tissu excédentaire. Expulser les bulles d’air de la seringue.

Ensuite, à l’aide de deux pinces à attacher droites, effectuez une canulation aortique rétrograde, en veillant à ce que l’ensemble du processus de canulation soit effectué sous la surface liquide. Ajustez la profondeur de canulation de manière à ce que la pointe de la canule se trouve dans l’aorte ascendante, en prenant soin de ne pas pénétrer dans les valves aortiques. Ensuite, avec une suture pré-nœud 3-O, ligaturez l’aorte jusqu’à l’encoche de la canule.

Injecter doucement la solution one de la seringue pour éliminer le sang résiduel. Ensuite, connectez le cœur cannulé à l’appareil de Langendorff, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans le cœur. Après avoir connecté le cœur cannulé à l’appareil de Langendorff, perfuser le cœur avec la solution un pendant environ deux minutes.

À l’aide d’une pipette stérile en polyéthylène à usage unique, prélever environ 2,5 millilitres de solution trois et la préchauffer au bain-marie pour une utilisation ultérieure. Ensuite, pour digérer les tissus, perfuser le cœur avec la solution restante trois pendant environ 11 à 12 minutes. Après les deux premières minutes de perfusion avec la solution trois, recycler la solution perfusée dans les réservoirs de perfusat par la pompe péristaltique pour la réutiliser jusqu’à ce que la digestion soit terminée.

Lorsque le cœur devient enflé, devenant légèrement pâle et flacide, à l’aide d’une pince dentée, pincez doucement le myocarde. Si une empreinte est visible, terminez la digestion et détachez le cœur de l’appareil. Pour isoler les myocytes artériels et ventriculaires, utilisez des pinces pour enlever les ventricules et les oreillettes et placez-les dans différentes boîtes de Pétri.

Ajoutez ensuite la solution préchauffée trois aux deux plats. À l’aide de pinces contondantes, triturez les tissus en une texture trouble, puis pipetez doucement le tissu pour une digestion uniforme sans introduire de bulles d’air. Pour arrêter l’activité enzymatique restante, à l’aide d’une pipette, transférer le tissu digéré trouble dans la solution quatre, puis centrifuger pendant 20 secondes à 192 fois G.Après avoir retiré le surnageant, remettre le sédiment cellulaire dans la solution cinq.

Pour éviter le paradoxe calcique et la surcharge en calcium, réintroduisez le calcium de manière progressive en ajoutant progressivement un total de 50 microlitres de 100 millimolaires par litre de chlorure de calcium à la suspension cellulaire. Une fois que tout le chlorure de calcium a été ajouté, stockez les cellules dans la solution de Tyrode pour l’étude de la pince patch. La profondeur de canulation est associée à la perfusion des oreillettes et de ses appendices.

Lorsque l’extrémité de la canule est à l’aorte ascendante, les deux appendices auriculaires sont gonflés, ce qui indique une perfusion suffisante des oreillettes. Cependant, lorsque l’extrémité de la canule est à la racine aortique, les deux appendices auriculaires sont essuyés, ce qui indique une perfusion insuffisante. Les myocytes auriculaires isolés par canulation à l’aorte ascendante avaient des taux de survie plus élevés que ceux isolés par canulation à la racine aortique avant et après la réintroduction du calcium.

En revanche, il n’y avait aucune différence dans les taux de survie des myocytes ventriculaires isolés par canulation au niveau de l’aorte ascendante ou de la racine aortique avant et après la réintroduction du calcium. L’enregistrement du courant de sodium dans les myocytes auriculaires et ventriculaires isolés, ainsi que les densités de courant, confirment que la qualité des cellules isolées répond aux exigences des expériences électrophysiologiques. Lorsque vous transectez l’aorte, assurez-vous de conserver une glande suffisante pour la ligature.

Sinon, la canule peut pénétrer dans la valve aortique après ligature.