Fabrication d’une encre de biomatériau d’agarose incorporée de nanocellulose cristalline pour la culture de mastocytes dérivés de la moelle osseuse

Ce protocole offre une approche simple et rapide pour filtrer les encres de biomatériaux candidats pour les effets cytotoxiques potentiels contre les cellules primaires et immunitaires sensibles avant des expériences complexes de bioimpression 3D. Après l’incubation des cellules immunitaires sur les constructions d’encre de biomatériau, les cellules peuvent être facilement extraites des constructions par lavage en douceur pour effectuer des analyses de cytotoxicité ou de biomarqueurs en aval. Ce protocole est directement pertinent pour l’ingénierie tissulaire dans laquelle les tissus bioimprimés destinés à la transplantation doivent être construits à partir de cellules primaires et d’encres biomatériaux biocompatibles.

Pour commencer, préparez une cartouche d’encre bio à installer sur la bioimprimante INKREDIBLE+3D. Tout d’abord, retirez les embouts bleus de la cartouche d’encre de biomatériau de trois millilitres et fixez une buse de bioimpression conique stérile de calibre 22 à l’extrémité de verrouillage Luer de la cartouche d’encre bio. Connectez le tube d’alimentation en pression d’air pour la tête d’impression un ou PH1 à l’extrémité opposée de la cartouche et insérez la cartouche avec sa buse de bio-impression conique attachée dans la fente verticale de PH1.

Ensuite, placez fermement la cartouche dans PH1 avec une buse de bio-impression conique s’étendant sous la tête d’impression. Serrez la vis sur PH1 dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le doigt soit serré pour verrouiller la cartouche d’encre bio en place. Notez que la bioimpression 3D peut être réalisée avec PH2 laissé vide.

Mettez la bioimprimante sous tension et lancez le logiciel de la bioimprimante sur un PC connecté à la bioimprimante 3D via un câble USB 2.0. Dans le logiciel, cliquez sur le bouton de connexion pour le synchroniser avec la bioimprimante 3D. Observez trois options dans le menu de contrôle principal de la bioimprimante 3D.

Tout d’abord, préparez la bio-impression. Deuxièmement, le menu des utilitaires. Et troisièmement, l’écran d’état.

Sélectionnez l’option préparer la bioimpression, puis faites défiler jusqu’à et sélectionnez l’option axes d’accueil. Après un étalonnage réussi des axes XYZ, la hauteur du lit d’impression diminuera légèrement et les têtes d’impression se déplaceront au-dessus du point central du lit d’impression. Pour procéder à l’étalonnage du point de départ pour la bioimpression dans des plaques de 24 puits, retirez une plaque de culture stérile de 24 puits de son emballage en plastique scellé et marquez un point sur le point central du puits D1 sur la face inférieure de la plaque avec un marqueur permanent.

Retirez le couvercle de la plaque et placez la plaque de culture à 24 puits sur le lit d’impression avec le puits D1 situé dans le coin avant gauche du lit d’impression. Dans le menu de contrôle principal, sélectionnez le menu Utilitaires, puis déplacez l’axe. Déplacez les têtes d’impression par incréments d’un millimètre le long des axes X et Y jusqu’à ce que la buse de bio-impression conique de PH1 soit directement au-dessus du point marqué sous le puits D1. Si nécessaire, affinez la position de la buse de bio-impression conique sur le point en déplaçant les têtes d’impression par incréments de 0,1 millimètre.

Enregistrez les coordonnées X et Y de la buse de bio-impression conique directement au-dessus du centre du puits D1 comme indiqué sur l’écran du panneau de commande de la bioimprimante 3D et marquez les coordonnées. Ensuite, soulevez le lit d’impression par incréments d’un millimètre jusqu’à ce que le fond du puits D1 touche presque la buse de bio-impression conique installée dans la tête d’impression un. Affinez le mouvement du lit d’impression par incréments de 0,1 millimètre si nécessaire.

Dans le menu utilitaires, sélectionnez l’option d’étalonnage de l’axe Z, puis sélectionnez et confirmez l’option d’étalonnage Z du magasin. Revenez au menu principal et sélectionnez l’option préparer la bioimpression. Faites défiler jusqu’à et sélectionnez l’option calibrer Z.

Mettez à jour le code géométrique de la plaque à 24 puits ou le code G avec les coordonnées de point de départ correctes. Ouvrez le fichier G-code de 24 puits fourni sur le logiciel de bio-impression. Mettez à jour les coordonnées X et Y de la première ligne avec les valeurs obtenues lors des étapes précédentes et enregistrez le fichier sous un nouveau nom.

Assurez-vous que la pompe pneumatique est bien connectée à l’orifice d’admission d’air arrière de la bioimprimante INKREDIBLE+3D et allumez-la. Retirez le bouton de commande avant situé sur le côté droit de la bioimprimante INKREDIBLE+3D. Assurez-vous que les manomètres numériques pour PH1 et PH2 situés à l’avant de la bioimprimante lisent chacun près de zéro kilopascal.

Faites tourner lentement le bouton de commande avant dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la pression indiquée sur la jauge gauche pour PH1 atteigne 12 kilopascals. Placez un papier de soie plié ou un morceau de film d’étanchéité imperméable sous la buse d’impression de la cartouche installée, en prenant soin de ne pas toucher la buse d’impression. Dans le menu de contrôle principal de la bioimprimante 3D, sélectionnez Préparer la bioimpression.

Accédez à et sélectionnez Activer PH1. Notez que l’encre bio commence à extruder à partir de la buse d’impression. Si nécessaire, augmentez la pression d’extrusion en faisant pivoter le bouton de commande dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que l’encre bio soit extrudée dans un filament continu et enregistrez le nouveau réglage de pression.

Sélectionnez Désactiver PH1 pour arrêter l’extrusion de l’encre bio. Retirez le papier de soie ou le film contenant l’encre bio extrudée du lit d’impression et fermez la porte de la bioimprimante. Pour effectuer une bioimpression 3D de substrats d’hydrogel rectiligne dans un format de plaque à 24 puits, sélectionnez le menu utilitaires dans le menu de contrôle principal, puis sélectionnez Désactiver l’impression SD qui permettra au logiciel de bio-imprimante de transmettre des fichiers G-code à la bioimprimante 3D pour impression.

Cliquez sur le bouton de chargement dans le logiciel de bio-impression et sélectionnez le fichier G-code de plaque de 24 puits mis à jour. Dans le panneau de commande de droite du logiciel, sélectionnez l’onglet Aperçu avant impression et cliquez sur le bouton d’impression pour commencer la bioimpression dans le puits D1. Une fois la bioimpression des constructions rectilignes terminées, recouvrez la plaque de 24 puits avec son couvercle et déplacez-la dans une armoire de biosécurité de classe II. Immerger chaque construction rectiligne dans deux gouttes de solution stérile de chlorure de calcium de 50 millimolaires et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Aspirer soigneusement la solution de chlorure de calcium de chaque construction de puits et rincer une fois dans un millilitre de 1X PBS pour éliminer l’excès de chlorure de calcium. Pour éviter la déshydratation des constructions d’hydrogel bioimprimées, maintenez les constructions rectilignes bioimprimées en 3D dans du PBS 1X frais jusqu’à ce que les mastocytes dérivés de la moelle osseuse soient prêts à être ensemencés sur les constructions. Sur la base des paramètres de diffusion avant et latérale des BMMC analysés par cytométrie en flux, il a été observé que le substrat d’hydrogel avec la plus forte concentration de CNC ne modifiait pas la taille ou la granularité native des BMMC par rapport aux BMMC cultivés en l’absence des substrats d’hydrogel d’agarose D-mannitol CNC.

L’analyse cytométrique en flux de la perméabilité des BMMC à l’iodure de propidium a démontré qu’aucune des concentrations de CNC testées n’a eu d’effet indésirable sur la viabilité du BMMC. Le substrat d’agarose CNC a augmenté l’expression des biomarqueurs des mastocytes à des concentrations DE CNC supérieures ou égales à 2,5%Cependant, les niveaux d’expression de ces récepteurs sont restés relativement constants entre 2,5% et 12,5% de CNC, ce qui suggère un effet indépendant de la concentration de CNC. Le test XTT a démontré que l’activité métabolique des BMMC cultivés sur les échafaudages d’hydrogel bioimprimés en 3D restait relativement constante à environ 100% sur tous les points temporels testés.

De même, les tests de libération de LDH et d’exclusion des colorants PI n’ont révélé aucun changement significatif dans la viabilité des BMMC. Une attention particulière portée au choix de la jauge de la buse d’impression, à l’étalonnage des axes de la bioimprimante 3D et au réglage de la pression d’extrusion garantira une impression reproductible de constructions 3D de haute qualité. La facilité avec laquelle les mastocytes peuvent être récupérés leur permet d’être sondés par un large éventail de tests biologiques pour étudier plus avant tout aspect de leurs fonctions cellulaires.