Name: Approches de l’intelligence artificielle pour évaluer les cils primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Découvrez une méthode d'intelligence artificielle pour l'analyse automatisée des cils primaires in vitro et in vivo. Cette approche permet une quantification rapide, reproductible et sans biais de la longueur et de l'intensité des cils.

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Ce travail a été financé par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 à l’ONF et l’American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 à RB. Nous remercions Rich Gruskin, directeur général de Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft et Teresa Mastracci pour leurs commentaires perspicaces sur le manuscrit.

1. Acquérir des images brutes
<ol><li>Fixer et étiqueter les échantillons au besoin20.<ol>
<li>Imagez les cils à l’aide d’un microscope confocal à la profondeur de bits maximale en utilisant la même taille de pixel avec une résolution Nyquist.</li>
		<li>Exportez des images en tant que fichiers monochromes au format .tif (Tagged Image Format). REMARQUE: Ce protocole explique comment utiliser le module Ai spécifiquement dans le logiciel NIS Elements. Si les images ont été acquises en tant que fichiers .nd2, l’exportation d’images en tant que fichiers .tif n’est pas nécessaire et l’utilisateur peut passer directement à l’étape 2.3. Si les images ont été acquises sur un autre système, une licence NIS Elements peut être achetée séparément et .tif fichiers peuvent être convertis comme indiqué dans les étapes suivantes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Entraînez l’IA à identifier les cils
<ol><li>Ouvrez le jeu de données de formation.<ol>
<li>Sélectionnez environ 50 exemples d’images avec au moins un ccil par image pour entraîner le logiciel et copiez-les dans un seul dossier. Ce dossier est utilisé pour diriger le logiciel lors de l’ouverture des images. Ouvrez ces 50 images dans un seul document ND2 avec au moins un ciliium par image. Sélectionnez Fichier > Importer/Exporter > Créer un fichier ND à partir de la séquence de fichiers.</li>
		<li>Sélectionnez le dossier contenant le jeu de données de formation. Cela ouvrira la liste des fichiers au centre de la fenêtre de dialogue. Définissez manuellement l’organisation des fichiers à l’aide d’au moins une option dans le menu déroulant ci-dessus. Les options sont multipoint (pour plusieurs fichiers de projection maximum), série Z (pour une image de pile z), temps (pour une image time-lapse) et longueur d’onde (pour les fichiers de plusieurs canaux).</li>
		<li>Entrez les valeurs numériques correspondantes sous chaque option sélectionnée. Sélectionnez Aucun lorsque les options ne sont pas sélectionnées. Cliquez sur Convertir pour ouvrir le document ND.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrer les images.<ol>
<li>Entrez la taille en pixels dans le coin inférieur gauche de l’image : cliquez avec le bouton droit sur Non étalonné > Calibrer le document > Taille des pixels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifiez les cils.<ol>
<li>Identifiez manuellement les cils en traçant avec précision des structures ciliaires individuelles sur tous les cadres ouverts à l’aide de la détection automatique ou de l’objet Draw dans la barre d’outils binaire. Cela dessinera des masques binaires sur les objets d’intérêt. Ces binaires serviront d’exemples d’objets pour former le logiciel à identifier les cils sur les caractéristiques basées sur les pixels dans l’analyse expérimentale future d’images. Sélectionnez Afficher > contrôles d’analyse > barre d’outils binaire > Draw Object. REMARQUE : Supprimez toute image qui n’a pas de fichiers binaires car le logiciel ne commencera pas l’entraînement à moins qu’il ne soit en mesure de détecter les fichiers binaires sur toutes les images ouvertes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Train Ai.<ol>
<li>Commencez à former le logiciel. Cela ouvrira la boîte de Segment.ai du train. Sélectionnez NIS.ai > train Segment.ai.</li>
		<li>Dans la zone Train Segment.ai, sélectionnez le canal source à utiliser pour la formation. Si des fichiers de plusieurs canaux sont ouverts, sélectionnez un seul canal comme canal source. Sélectionnez ensuite les binaires de vérité de terrain appropriés sur lesquels entraîner l’Ai. Enfin, sélectionnez le nombre d’itérations nécessaires pour entraîner l’IA en fonction de la taille et de la distribution des binaires. REMARQUE: Si les binaires sont facilement détectables depuis l’environnement et bien répartis dans toute l’image, le logiciel peut avoir besoin de moins de 1000 itérations pour être formé à identifier les images. Si les images ont un faible rapport signal/bruit, il est idéal d’exécuter au moins 1000 itérations pendant l’entraînement pour permettre à l’IA d’identifier les cils dans les échantillons de test avec une grande confiance.</li>
		<li>Sélectionnez le dossier de destination pour enregistrer le fichier Ai entraîné (.sai) et cliquez sur Train pour entraîner le logiciel. Le logiciel va maintenant s’entraîner à identifier les cils en fonction des binaires tracés. Ce processus prend plusieurs heures. REMARQUE: Lors de la formation, le logiciel affichera un graphique montrant la perte d’entraînement. Le graphique montrera d’abord un pic avant de diminuer pour atteindre idéalement environ 1% de perte où il plafonne pour le reste de l’entraînement. Enregistrez le graphique pour référence ultérieure en cochant la case Enregistrer la capture d’écran du graphique dans la zone train Segment.ai (Figure supplémentaire 1).</li>
		<li>Si d’autres améliorations de la formation sont nécessaires, poursuivez la formation sur le même ensemble de données. Vous pouvez également vous entraîner sur un nouvel ensemble de données avec exactement les mêmes paramètres. Il n’est pas conseillé d’entraîner une IA déjà entraînée sur un nouvel ensemble de données avec différents paramètres ou différents objets d’intérêt. Sélectionnez S’entraîner segment.ai > continuer la formation sur > Sélectionnez Le fichier Ai formé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifiez les cils à l’aide d’ia entraînée
<ol><li>Ouvrez le jeu de données expérimental.<ol>
<li>Ouvrez les images confocales expérimentales de cils dans le logiciel en convertissant l’exemple .tif fichiers en fichiers .nd2, similaires à l’étape 2.1. Sélectionnez Fichier > Importer/Exporter > Créer un fichier ND à partir de la séquence de fichiers. REMARQUE: Les images doivent être de la même taille de pixel que celles utilisées pour l’entraînement de l’IA. Si les images sont déjà au format ND2, passez à l’étape 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrer les images.<ol>
<li>Entrez la taille des pixels dans le coin inférieur gauche de l’image. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Uncalibrated > Calibrer le document > taille des pixels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez l’Ai entraîné sur les fichiers ouverts.<ol>
<li>Commencez à identifier les cils à l’aide de l’IA. Le logiciel va maintenant dessiner des binaires sur les cils en fonction de la formation qu’il a reçue à l’étape précédente. Ce processus prendra quelques secondes. Sélectionnez NIS.ai > Segment.ai. REMARQUE: Le logiciel vous invite à sélectionner le canal si plusieurs canaux sont ouverts. Les chaînes sont répertoriées par leurs noms respectifs ici. Sinon, la case marquée 'Mono' sera automatiquement sélectionnée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vérifiez les images pour les fichiers binaires mal identifiés.<ol>
<li>Une fois que l’IA a identifié les cils et dessiné des binaires, vérifiez les images pour tout objet identifié par erreur. Si vous le souhaitez, supprimez manuellement tous les fichiers binaires mal identifiés. Sélectionnez Afficher > contrôles d’analyse > barre d’outils binaire > Supprimer l’objet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mesure de la longueur et de l’intensité des cils
<ol><li>Créez une nouvelle recette d’analyse générale 3 (GA3).<ol>
<li>Maintenant que les cils ont été identifiés et segmentés, procédez à l’analyse de différents paramètres des cils tels que les longueurs et les intensités à l’aide de l’outil GA3. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec un espace vide au centre où l’analyse sera définie. Sélectionnez Image > nouvelle recette GA3. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez les fichiers binaires à analyser.<ol>
<li>Étant donné que les cils sont déjà segmentés à l’aide de Segment.ai, GA3 détectera automatiquement les binaires correctement étiquetés en fonction de l’Ai et inclura le nœud. Sélectionnez «Binaires > Detect_AI automatique » ou « Binaires > dessiner Object_AI ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez les canaux requis pour l’analyse. GA3 détectera également automatiquement les canaux dans les images et affichera leurs onglets sous Canaux.</li>
	<li>Supprimez les objets qui touchent la bordure du cadre.<ol>
<li>Étant donné que l’Ai segmentera tous les cils comme des objets dans le cadre, il détectera également les cils incomplets le long des bords du cadre. Ces objets peuvent être supprimés manuellement à l’étape 3.4 ou automatiquement dans GA3. Sélectionnez Traitement binaire > Supprimer les objets > Toucher les bordures.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez les paramètres pour mesurer les cils.<ol>
<li>Faites glisser et déposez les paramètres à mesurer tels que la longueur des cils (Longueur) et les intensités (Somme de l’intensité de l’objet). Connectez les nœuds au nœud binaire approprié (connexion A) et aux nœuds de canal appropriés (connexion B). Passez le curseur de la souris sur la connexion du nœud pour obtenir une info-bulle afin d’indiquer à quelle connexion appartient le nœud. Sélectionnez Mesure > Taille de l’objet > Longueur et Mesure > Intensité de l’objet > Somme Intensité Obj. REMARQUE: La longueur du nœud se connecte uniquement au nœud binaire, tandis que Sum Obj Intensity se connecte à la fois aux nœuds binaires et aux nœuds de canal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajoutez les mesures dans un seul tableau.<ol>
<li>Combinez toutes les mesures dans une seule table de sortie en faisant glisser et en déposant le nœud Ajouter une colonne à l’organigramme d’analyse et connectez-le aux nœuds de mesure, Longueur et Somme Obj Intensité. Sélectionnez Gestion des données > colonne Basic > Append.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurez les cils.<ol>
<li>Mesurez les cils en cliquant sur Exécuter. Ce processus prend quelques instants pour mesurer tous les cils dans les images expérimentales. Les longueurs et les intensités apparaîtront dans une nouvelle fenêtre Résultats d’analyse. REMARQUE: Le tableau peut parfois inclure des données provenant de masques que Ai a reconnus comme des cils, mais qui étaient trop petits pour être détectés par l’œil humain et éliminés à l’étape 3.4. Ces objets peuvent être supprimés de l’ensemble de données à l’aide d’un filtre avant l’analyse statistique. Ici, un filtre de 1 μm a été utilisé pour les mesures in vitro de la longueur des cils dans la figure 2 et de 2 μm pour les cils in vivo. Cela peut être fait avant d’exporter des données en utilisant le chemin ci-dessous. Sélectionnez la fenêtre Résultats de l’analyse > Définir le filtre > Entrer la valeur > Utiliser le filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exporter des données à des fins d’analyse statistique.</li>
</ol>5. Études de colocalisation
REMARQUE: L’analyse de colocalisation peut être incluse dans la même recette GA3 utilisée pour les mesures de l’analyse de la longueur et de l’intensité des cils. Si vous utilisez la même recette, ouvrez les fichiers comme décrit ci-dessous et mesurez les longueurs et les intensités des deux canaux ainsi que les coefficients de colocalisation dans le même pipeline d’analyse.
<ol><li>Ouvrez le jeu de données expérimental.<ol>
<li>Ouvrez les images confocales expérimentales de cils dans le logiciel en convertissant les exemples de fichiers .tif en fichiers .nd2. Sélectionnez Fichier > Importer/Exporter > Créer un fichier ND à partir de la séquence de fichiers.</li>
		<li>Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez les fichiers monochromes de profondeur 16 bits parmi tous les canaux d’intérêt dans l’explorateur de fenêtres situé dans la première colonne de la fenêtre contextuelle. Sélectionnez Multipoint ou Série Z dans le premier menu déroulant et entrez une valeur correspondant au nombre total d’images ou de piles, respectivement.</li>
		<li>Dans la deuxième liste déroulante, sélectionnez Longueur d’onde et remplacez la valeur par le nombre total de canaux dans le dossier. Le logiciel déverrouillera automatiquement une fenêtre de sélection de longueur d’onde située en bas à droite de la fenêtre contextuelle. Utilisez le menu déroulant Couleur pour sélectionner la couleur de chaque couche. Indiquez à chaque canal un nom différent sous la colonne Nom. Une fois toutes les informations mises à jour, cliquez sur Convertir. Le logiciel générera automatiquement un fichier d’image entièrement superposé avec toutes les images individuelles de tous les canaux sélectionnés.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrer les images.<ol>
<li>Entrez la taille des pixels dans le coin inférieur gauche de l’image. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Uncalibrated > Calibrer le document > taille des pixels.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez l’IA entraînée sur le premier canal.<ol>
<li>Commencez à identifier les cils sur l’un des canaux ouverts (p. ex., ACIII; Figure 5A) en utilisant Ai. Le logiciel va maintenant dessiner des binaires sur des cils étiquetés ACIII en fonction de la formation qu’il a reçue pour ce canal. Ce processus prendra quelques secondes. Sélectionnez NIS.ai > Segment.ai > Canaux source > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez l’Ia entraînée sur le deuxième canal.<ol>
<li>Commencez à identifier les cils sur l’autre canal ouvert (p. ex., MCHR1; Figure 5B) en utilisant Ai. Le logiciel va maintenant dessiner des binaires sur des cils étiquetés MCHR1 en fonction de la formation qu’il a reçue pour ce canal. Ce processus prendra quelques instants. Sélectionnez NIS.ai > Segment.ai > Canaux source > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Vérifiez les images pour les fichiers binaires mal identifiés.<ol>
<li>Une fois que l’IA a identifié les cils et dessiné des binaires, vérifiez les images pour tout objet mal identifié. Supprimez manuellement tous les fichiers binaires mal identifiés si nécessaire. Sélectionnez Afficher > contrôles d’analyse > barre d’outils binaire > Supprimer l’objet.
</li>
	</ol></li>
	<li>Créez une nouvelle recette GA3.<ol>
<li>Maintenant que les cils ont été identifiés et segmentés, passez à l’analyse de colocalisation à l’aide de l’outil GA3. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec un espace vide au centre où l’analyse sera définie. Une fenêtre avec tous les fichiers binaires et canaux identifiés sera générée. Vérifiez que tous les canaux et fichiers binaires souhaités requis pour l’analyse sont présents et sélectionnés. Sélectionnez Image > nouvelle recette GA3.</li>
	</ol></li>
	<li>Supprimez les objets qui touchent la bordure du cadre.<ol>
<li>Étant donné que l’Ai segmentera tous les objets ressemblant à des cils dans le cadre, il détectera également les cils incomplets le long des bords du cadre. Ces objets peuvent être supprimés manuellement à l’étape 5.5 ou automatiquement dans GA3. Sélectionnez Traitement binaire > Supprimer les objets > Toucher les bordures.
</li>
	</ol></li>
	<li>Configurez la voie de colocalisation dans GA3.<ol>
<li>Pour mesurer le chevauchement des deux canaux au sein des cils, utilisez la corrélation de coefficient de Mander. Faites glisser et déposez le nœud Coefficient de Manders dans l’espace vide de la recette GA3 et connectez-le au binaire et aux canaux appropriés. Ici, 'connexion A' se connecte avec le binaire ACIII, 'connexion B' avec le canal MCHR1 et 'connexion C’avec le canal ACIII pour déterminer le chevauchement de MCHR1 dans le binaire ACIII. Sélectionnez Measurement > Object Ratiometry > Manders Coefficient. REMARQUE: Le logiciel permet de mesurer la colocalisation à l’aide de la corrélation de coefficient de Pearson en utilisant les mêmes étapes que celles décrites dans ce protocole40.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajoutez les mesures dans un seul tableau.<ol>
<li>Combinez toutes les mesures dans une seule table de sortie. Sélectionnez Gestion des données > colonne Basic > Append.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesurer la colocalisation.<ol>
<li>Mesurez les cils en cliquant sur Exécuter. Ce processus prend quelques instants pour mesurer tous les cils dans les images expérimentales. Les données apparaîtront dans une nouvelle fenêtre Résultats d’analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Exporter des données à des fins d’analyse statistique.</li>
</ol>

Le co-auteur Wesley Lewis est un employé de Nikon. Il n’y a pas de divulgation financière.

Les mesures de longueur et d’intensité sont des moyens courants d’analyse des cils primaires, mais il n’existe pas de méthode conventionnelle normalisée utilisée sur le terrain. L’identification et la quantification des cils primaires à l’aide de logiciels tels qu’ImageJ prennent beaucoup de temps et sont sujettes aux biais et aux erreurs de l’utilisateur. Il est donc difficile d’analyser avec précision de grands ensembles de données. Nous montrons ici que l’utilisation d’un programme d’IA peut surmonter bon nombre de ces défis, ce qui rend l’analyse à haut débit des cils primaires réalisable. Ici, nous décrivons la procédure d’entraînement d’une application basée sur l’IA pour reconnaître les cils primaires et décrivons les étapes nécessaires pour analyser la longueur et l’intensité.
Bien que la formation initiale de l’IA à reconnaître les cils nécessite beaucoup de temps de la part de l’utilisateur, une fois terminée, elle peut être utilisée sur n’importe quel ensemble de données acquis avec les mêmes paramètres. Le masque binaire généré par l’Ai est modifiable de sorte que toute erreur peut être corrigée. Cependant, les erreurs dans l’identification des cils devraient signaler à l’utilisateur que l’IA doit être davantage entraînée avec des images supplémentaires. L’un des principaux avantages de cette méthode est que l’IA peut être entraînée à reconnaître les cils dans différents types d’échantillons en 2D et en 3D. Les méthodes d’analyse antérieures générées dans les laboratoires ont diverses limites, notamment l’exigence d’un seuil manuel pour l’identification et des problèmes d’identification des cils imagés à partir de coupes de tissus où la densité cellulaire est élevée36,46,47. Ces méthodes sont également spécialisées pour l’analyse des cils tandis que l’analyse à l’aide du logiciel NIS Elements peut évaluer plusieurs aspects des images simultanément. Étant donné que l’IA décrit ici fait partie du progiciel NIS Elements, les images acquises à l’aide d’un microscope Nikon peuvent être facilement poursuivies jusqu’à l’analyse. Cependant, l’imagerie avec Nikon n’est pas nécessaire pour l’utilisation de cette méthode. Quel que soit le format de fichier de données brutes capturé, les fichiers « .tif » peuvent être ouverts par NIS Elements pour être utilisés dans l’Ai.
Cette application d’IA au sein de NIS Elements est largement disponible et fait peut-être déjà partie d’un logiciel d’analyse d’images utilisé par les laboratoires étudiant les cils primaires. Avec l’expansion de la prévalence de la technologie de l’IA, d’autres logiciels d’imagerie peuvent élargir leurs options d’analyse pour inclure un module d’IA similaire. L’application de l’analyse de l’IA à l’identification des cils peut être utilisée pour plusieurs aspects différents de l’analyse des cils. Bien que nous ayons décrit des méthodes pour quelques analyses simples telles que la longueur(Figure 2 et 3),l’intensité(Figure 4)et la colocalisation(Figure 5),une analyse plus sophistiquée peut être ajoutée au flux de travail d’analyse GA3 comme dans la Figure 6. Par exemple, au lieu de mesurer l’intensité d’un ciliium complet, les différences d’intensité au sein d’une sous-région d’un cil peuvent être intéressantes pour évaluer la localisation sous-ciliaire. Les différences d’intensité au sein d’une sous-région d’un cilium pourraient indiquer que la protéine s’accumule à la pointe ou à la base du cilium, comme la façon dont les protéines Gli sont enrichies à la pointe descils 48. En outre, cette application d’IA peut être utilisée pour identifier facilement les différences entre les génotypes ou les groupes de traitement. Bien que notre laboratoire utilise principalement cette méthode pour analyser les cils imagés à partir de coupes cérébrales ou de cultures neuronales, elle peut être appliquée à des images acquises à partir de diverses lignées cellulaires ou d’autres types de tissus. La flexibilité du type d’échantillon sur lequel cette application peut être utilisée rend cette méthode d’analyse précieuse pour de nombreux groupes différents étudiant les cils primaires ou tout organite discret évalué tel que les mitochondries, le noyau ou l’ER.

Les cils primaires sont des organites sensoriels dépassant de la plupart des types de cellules demammifères1,2,3,4. Ce sont généralement des appendices solitaires essentiels à la coordination de diverses voies de signalisation cellulaire en intégrant des signaux extracellulaires5,6,7. Les cils primaires jouent un rôle important au cours du développement embryonnaire et de l’homéostasie des tissus adultes, et la perturbation de leur fonction ou de leur morphologie est associée à plusieurs troubles génétiques, collectivement appelés ciliopathies. En raison de la nature presque omniprésente des cils, les ciliopathies sont associées à un large éventail de caractéristiques cliniques qui peuvent avoir un impact sur tous les systèmes d’organes8,9,10,11,12. Dans les modèles animaux de ciliopathies, la perte de la structure ciliaire ou de la capacité de signalisation se manifeste dans plusieurs phénotypes cliniquement pertinents, y compris l’obésité associée à l’hyperphagie3,13,14,15. Dans de nombreux systèmes modèles, il a été démontré que les changements de longueur des cils ont un impact sur leur capacité de signalisation et leurs fonctions16,17 , 18,19. Cependant, il existe plusieurs défis techniques et chronophages associés à l’évaluation précise et reproductible de la longueur et de la composition des cils.
Le système nerveux central (SNC) des mammifères adultes est un contexte biologique qui a posé un défi pour la compréhension de la morphologie et de la fonction des cils. Bien qu’il semble que les neurones et les cellules du SNC possèdent des cils, en raison des outils et des capacités limités pour observer et analyser ces cils, la compréhension de leurs fonctions reste insaisissable20. Par exemple, le marqueur prototypique des cils, la α-tubuline acétylée, ne marque pas les cils neuronaux20. La difficulté d’étudier ces cils a été en partie résolue avec la découverte de plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), de mécanismes de signalisation et de protéines associées à la membrane qui s’enrichissent sur la membrane des cils neuronaux21,22. Toutes ces observations de base simples font allusion à l’importance et à la diversité des cils du SNC, qui semblent jusqu’à présent inégalés par d’autres tissus. Par exemple, une variation de la longueur des cils et de la localisation des RCPG peut être observée dans tout le cerveau, les longueurs de certains noyaux neuronaux étant différentes de celles des autres noyaux19,23. De même, leur contenu GPCR et leur machinerie de signalisation complètent la diversité basée sur la localisation neuroanatomique et le type neuronal2,24,25,26,27,28,29. Ces observations simples démontrent que la longueur et la composition des cils du SNC des mammifères sont étroitement régulées, tout comme chez les organismes modèles, comme Chlamydomonas reinhardtii,mais l’impact de ces différences de longueur sur la fonction des cils, la signalisation et finalement le comportement reste incertain16,30,31,32.
Mesurer avec précision la longueur et la composition des cils s’avère être un défi technique sujet à l’erreur de l’utilisateur et à l’irreproductibilité. Actuellement, les cils in vivo et in vitro sont le plus souvent identifiés à l’aide d’approches immunofluorescentes qui marquent les protéines ciliaires ou les allèles rapporteurs fluorescents enrichis en cils33,34,35. Les longueurs de ces cils marqués par fluorescence sont ensuite mesurées à partir d’une image en 2 dimensions (2D) à l’aide d’outils de mesure de ligne dans des programmes d’analyse d’images tels que ImageJ36. Ce processus est non seulement fastidieux et laborieux, mais aussi sujet aux biais et aux erreurs. Ces mêmes obstacles surviennent lors de la mesure de l’intensité des cils, ce qui aide à indiquer des changements dans la structure descils 37. Pour minimiser les incohérences dans ces types d’analyses d’images, les programmes d’intelligence artificielle (IA) deviennent de plus en plus répandus et abordables38.
L’IA est l’avancement des systèmes informatiques qui utilisent l’avantage des algorithmes informatiques et de la programmation pour exécuter des tâches qui nécessiteraient généralement une intelligence humaine39. Les dispositifs d’IA apprennent à percevoir des modèles, des paramètres et des caractéristiques récurrents et à prendre des mesures pour maximiser les chances de créer des résultats positifs. L’IA est polyvalente et peut être entraînée à reconnaître des objets ou des structures d’intérêt spécifiques, tels que les cils, puis être programmée pour exécuter une variété d’analyses sur les objets identifiés. Par conséquent, des données d’image complexes peuvent être générées rapidement et de manière reproductible par Ai38. L’automatisation et l’analyse ia des images capturées augmenteront l’efficacité et l’efficience tout en limitant toute erreur et biais humain potentiel39. L’établissement d’une méthodologie basée sur l’IA pour l’identification des cils crée un moyen cohérent pour tous les groupes de recherche d’analyser et d’interpréter les données sur les cils.
Ici, nous utilisons un module Ai pour identifier les cils in vivo et in vitro sur des images 2D. À l’aide d’un ensemble d’exemples d’images, l’IA est entraînée à identifier les cils. Une fois la formation terminée, l’IA désignée est utilisée pour appliquer un masque binaire sur les cils identifiés par l’IA dans une image. Les binaires appliqués par l’Ai sont modifiables, si nécessaire, pour s’assurer que tous les cils dans les images sont correctement identifiés et que l’identification non spécifique est éliminée. Après avoir utilisé l’IA pour identifier les cils, des programmes d’analyse générale (GA) sur mesure sont utilisés pour effectuer différentes analyses telles que la mesure de la longueur des cils et de l’intensité de fluorescence. Les données recueillies sont exportées dans un tableau qui peut être facilement lu, interprété et utilisé pour des analyses statistiques (Figure 1). L’utilisation de la technologie automatisée et de l’IA pour identifier les cils et obtenir des mesures spécifiques entre les groupes expérimentaux aidera dans les futures études visant à comprendre l’impact de la fonction et de la morphologie des cils du SNC sur la communication et le comportement cellule-cellule.

<table><tbody><tr><td>Intel Xeon, 3,6 GHz, 32 Go de RAM</td><td>Processeur Intel Corporation</td><td>W-2123</td><td>utilisé pour l’exécution de NIS Elements.</td></tr><tr><td>Logiciel Nikon Elements</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>-</td><td>Logiciel Ai et GA3</td></tr><tr><td>Carte graphique Quadro RTX 4000 NVIDIA</td><td>Corporation</td><td>Quadro RTX 4000</td><td></td></tr><tr><td>Windows 10 Professionnel 64 bits</td><td>Microsoft Inc.</td><td>-</td><td>Système d’exploitation utilisé pour l’exécution de NIS Elements</td></tr><tr><td>Workstation</td><td>HP Development Company, L.P.</td><td>HP&nbsp ; Z4G4</td><td>Station de travail utilisée pour l’exécution de NIS Elements</td></tr></tbody></table>

approches de l’intelligence artificielle pour évaluer les cils primaires

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Les cils sont des appendices cellulaires à base de microtubules qui fonctionnent comme des centres de signalisation pour une diversité de voies de signalisation dans de nombreux types de cellules de mammifères. La longueur des cils est hautement conservée, étroitement régulée et varie entre différents types de cellules et de tissus et a été impliquée dans l’impact direct sur leur capacité de signalisation. Par exemple, il a été démontré que les cils modifient leur longueur en réponse à l’activation des récepteurs couplés à la protéine G ciliaire. Cependant, mesurer avec précision et de manière reproductible les longueurs de nombreux cils est une procédure longue et laborieuse. Les approches actuelles sont également sujettes aux erreurs et aux biais. Les programmes d’intelligence artificielle (IA) peuvent être utilisés pour surmonter bon nombre de ces défis en raison de capacités qui permettent l’assimilation, la manipulation et l’optimisation de vastes ensembles de données. Ici, nous démontrons qu’un module d’IA peut être formé pour reconnaître les cils dans des images provenant d’échantillons in vivo et in vitro. Après avoir utilisé l’IA entraînée pour identifier les cils, nous sommes en mesure de concevoir et d’utiliser rapidement des applications qui analysent des centaines de cils dans un seul échantillon pour la longueur, l’intensité de fluorescence et la colocalisation. Cette approche impartiale a augmenté notre confiance et notre rigueur lors de la comparaison d’échantillons de différentes préparations neuronales primaires in vitro ainsi que dans différentes régions du cerveau au sein d’un animal et entre les animaux. De plus, cette technique peut être utilisée pour analyser de manière fiable la dynamique des cils de n’importe quel type de cellule et de tissu de manière élevée sur plusieurs échantillons et groupes de traitement. En fin de compte, les approches basées sur l’IA deviendront probablement la norme à mesure que la plupart des domaines évolueront vers des approches moins biaisées et plus reproductibles pour l’acquisition et l’analyse d’images.

L’utilisation de l’intelligence artificielle (IA) pour analyser les images émerge comme une approche puissante, moins biaisée et rapide par rapport aux méthodes couramment utilisées. Ici, nous avons formé Ai à reconnaître un organite cellulaire, des cils primaires, et à analyser des propriétés telles que la longueur et l’intensité de la coloration de manière rigoureuse et reproductible.

Approches de l’intelligence artificielle pour évaluer les cils primaires

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Les méthodes actuelles d’analyse des cils sont laborieuses et sujettes aux erreurs et aux biais. Notre approche vise à rationaliser le temps et les efforts tout en atténuant les erreurs potentielles. Le principal avantage qu’offre cette technique est une rigueur et une reproductibilité accrues et une analyse quantitative des images.Ce type d’approche n’est pas seulement pertinent pour l’analyse des cils, mais peut être largement appliqué à de nombreuses questions biologiques cellulaires, y compris celles traitant d’autres organites et protéines cytosquelettiques. Pour commencer, ouvrez le jeu de données d’apprentissage, sélectionnez fichier dans le menu, cliquez sur Importer l’exportation et sélectionnez Créer un fichier ND à partir de la séquence de fichiers. Sélectionnez le dossier contenant l’ensemble de données d’entraînement et la liste des fichiers s’ouvrira au centre de la fenêtre de dialogue.Définissez manuellement l’organisation des fichiers à l’aide d’au moins une option dans le menu déroulant. Entrez les valeurs numériques correspondantes sous chaque option sélectionnée et sélectionnez aucune lorsque les options ne sont pas sélectionnées. Cliquez sur Convertir pour ouvrir le document ND.Pour calibrer l’image, faites un clic droit sur l’option non calibrée dans le coin inférieur gauche de l’image. Cliquez sur calibrer le document, puis sur Taille des pixels, entrez la valeur et cliquez sur OK. Sélectionnez les contrôles d’analyse de vue, ouvrez la barre d’outils binaire et sélectionnez détecter automatiquement ou dessiner un objet à la main pour identifier les cils en traçant avec précision les structures ciliaires individuelles sur tous les cadres ouverts.Pour former l’IA, sélectionnez nis. ai, cliquez sur segment de train. ai pour ouvrir le segment de train.ai, puis sélectionnez le canal source à utiliser pour la formation. Sélectionnez les binaires GroundTruth appropriés pour entraîner l’IA. Sélectionnez le nombre requis d’itérations pour entraîner l’IA en fonction de la taille et de la distribution binaires, puis sélectionnez le dossier de destination pour enregistrer le fichier AI formé et cliquez sur train pour entraîner le logiciel. Ce processus prend plusieurs heures.Ouvrez les images confocales expérimentales des cils comme décrit précédemment en convertissant l’échantillon. TIF aux fichiers ND2. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez multipoint dans le premier menu déroulant et entrez une valeur correspondant au nombre total d’images.Dans la deuxième liste déroulante, sélectionnez la longueur d’onde et remplacez la valeur par le nombre total de canaux dans le dossier. Le logiciel déverrouillera automatiquement une fenêtre de sélection de longueur d’onde, située en bas, à l’extrémité droite de la fenêtre contextuelle. Dans la fenêtre de sélection de la longueur d’onde, utilisez le menu déroulant couleur pour sélectionner la couleur de chaque couche.Indiquez à chaque canal un nom différent sous la colonne Nom. Une fois toutes les informations mises à jour, cliquez sur Convertir. Calibrez les images comme décrit précédemment.Assurez-vous que la taille en pixels du jeu de données expérimental est cohérente avec celle du jeu de données d’apprentissage. Identifiez les cils sur le premier canal en utilisant l’IA entraînée de l’étape précédente. Ouvrez nis.ai dans le menu, sélectionnez segment. ai, puis sélectionnez AC3 dans les canaux sources. Identifiez ensuite les cils sur le deuxième canal en sélectionnant MCHR1 dans les canaux sources.Le logiciel dessinera des binaires sur les cils étiquetés. Ensuite, vérifiez les images pour tout binaire mal identifié. Sélectionnez Supprimer l’objet dans la barre d’outils binaire pour supprimer manuellement les fichiers binaires mal identifiés.Une fois que les cils ont été identifiés et segmentés, analysez différents paramètres de cils, tels que les longueurs et les intensités, à l’aide de l’outil d’analyse générale trois. Sélectionnez l’image dans le menu et cliquez sur nouvelle recette GA3. Une nouvelle fenêtre avec un espace vide au centre sera ouverte.GA3 détectera automatiquement les binaires correctement étiquetés en fonction de l’IA et inclura le nœud correspondant. GA3 détectera également automatiquement les canaux dans les images et affichera leurs onglets sous les canaux. L’IA segmentera tous les cils comme des objets dans le cadre et détectera les cils incomplets le long des bords du cadre.Pour les supprimer, sélectionnez traitement binaire, supprimez des objets, puis faites glisser le nœud bordures tactiles dans l’espace vide et connectez le nœud aux fichiers binaires appropriés. Pour mesurer la longueur des cils, sélectionnez la taille de l’objet de mesure, puis la longueur. Faites glisser et déposez le paramètre au centre et connectez-vous au nœud binaire approprié.Pour mesurer l’intensité des cils, sélectionnez une certaine intensité d’objet. Faites glisser et déposez le paramètre au centre et connectez-vous au nœud binaire et au canal d’intérêt appropriés. Dans le menu de mesure, accédez à ratiométrie d’objet et sélectionnez le coefficient de Mander pour configurer la voie de colocalisation dans GA3 en mesurant le chevauchement de deux canaux dans des cils individuels.Faites glisser et déposez le nœud de coefficient de Mander dans l’espace vide et connectez-le au binaire et aux canaux appropriés. ApEn les mesures et la table unique en ouvrant le menu de gestion des données. Dans la catégorie de base, sélectionnez la colonne ApEn, puis cliquez sur Exécuter maintenant pour mesurer les cils.Toutes les mesures apparaîtront dans un seul tableau de sortie. Les images représentatives montrent que l’IA entraînée a correctement identifié les cils in vitro dans les images de cellules IMCD, de cultures hypothalamiques primaires et de cultures hippocampiques, mais pas d’autres structures non ciliaires telles que les ponts cytocinétiques. La longueur des cils variait de 0,5 à 4,5 micromètres dans les cellules IMCD et de deux à 12 micromètres dans la culture hypothalamique et hippocampique.L’IA a mesuré les longueurs des cils marqués AC3 in vivo dans les images de notre noyau arqué, de notre noyau paraventriculaire et de notre région cornu ammonis. Selon l’analyse, les cils hypothalamiques in vivo variaient de un à 15 micromètres, comme on le voit dans les barres blanches et brunes. Alors que les cils et la région de cornu ammonis variaient de un à 10 micromètres, comme on le voit dans les barres grises.Fait intéressant, l’intensité du MCHR1 ciliaire était plus forte dans le noyau paraventriculaire que dans le noyau arqué. Les intensités de MCHR1 par rapport à AC3 ont été tracées pour mesurer leur chevauchement. La majorité des cils étaient positifs pour les deux marqueurs, tandis que certains cils étaient positifs pour AC3 ou MCHR1.Pour quantifier la colocalisation de MTHR1 dans AC3, le coefficient de chevauchement de Mander a été mesuré et il y a eu une augmentation significative du chevauchement dans le noyau paraventriculaire que dans le noyau arqué. Pour mesurer l’intensité le long des cils, la polarité des cils a été définie en utilisant Centrin2-GFP comme marqueur basal du corps. Cela a permis de distinguer la base des cils des pointes des cils positifs de cerise ARL13B-M.Des changements dans l’intensité de l’ARL13B le long de la longueur des cils ont été observés lorsque l’intensité de l’ARL13B était plus élevée à la base qu’à l’extrémité du ciliium dans le noyau arqué, vu à gauche, ainsi que le PVN, vu à droite. Lors de l’analyse des données avec cette approche, il est important de s’assurer que la qualité et la résolution de l’ensemble de données expérimentales sont cohérentes avec celles utilisées pour former l’IA. L’utilité principale de cette approche est qu’après avoir détecté les cils par l’IA, l’utilisateur peut être créatif sur les propriétés analysées en personnalisant le flux de travail d’analyse intégré dans le logiciel.

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JoVE Journal

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