Name: Coloration du Ca2+ cytoplasmique avec Fluo-4/AM dans la pulpe de pomme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez l'imagerie du Ca²⁺ cytosolique dans les protoplastes de pulpe de pomme à l'aide de Fluo-4/AM. Cette méthode non invasive permet d'étudier les dynamiques calciques dans les cellules végétales vivantes.

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Ce travail a été soutenu par le projet d’amélioration des variétés agricoles de la province du Shandong (2019LZGC007) et l’équipe d’innovation des arbres fruitiers du système technologique moderne de l’industrie agricole du Shandong (SDAIT-06-05).

1. Extraction de protoplastes
<ol><li>Préparer la solution de base : 20 mM deCaCl2,5 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 0,4 M de D-sorbitol. REMARQUE: Le pH de la solution de base a été ajusté à 5,8 avec un tampon Tris de 0,1 M, filtré à travers des filtres solubles dans l’eau de 0,22 μm et stocké à 4 °C.</li>
	<li>Préparer la solution enzymatique : Mélanger 0,3 % (p/v) de Macerozyme R-10 et 0,5 % (p/v) de cellulase R-10 avec la solution de base.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de solution enzymatique dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Choisissez une pomme saine et mûre. Ensuite, coupez la pâte en 10 x 5 x 1 mm3 (Figure 1A-1C).</li>
	<li>Placer les morceaux de pulpe de pomme dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant une solution enzymatique, puis fermer le tube (Figure 1D).</li>
	<li>Incuber le tube à 28 °C pendant 1 h, en agitant à 70 tr/min dans un shaker dans l’obscurité.</li>
	<li>Lavez les morceaux de pulpe. Aspirer toute la solution enzymatique, puis ajouter 0,5 mL de la solution de base.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 2 min à température ambiante.</li>
	<li>Pour obtenir une suspension de protoplaste, aspirer la solution par le fond du tube de centrifugation (Figure 1E).</li>
</ol>2. Coloration par fluorescence des ions calcium à petites molécules
<ol><li>Préparer la solution de chargement Fluo-4/AM avec 2 mM de Fluo-4/AM, 20 % de F-127 et 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS:80 mM Na2HPO4,1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4et 26 mM KCI) dans un rapport de 1:1:2.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM à 99 μL de la suspension de protoplaste présente dans les tubes centrifuges de 1,5 mL. Assurez-vous que la concentration finale du colorant fluorescent est de 5 μM. Mélangez la solution, puis fermez le tube.</li>
	<li>Traitement La3+ : Préparer une solution de La3+ de 100 μM avec 98 μL de suspension de protoplaste, 1 μL de 10 mM De La3+et 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM. Mélanger la solution et fermer le tube.</li>
	<li>Incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les protoplastes par centrifugation à 300 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer 70 μL de la solution et ajouter 70 μL de la solution de base.</li>
	<li>Incuber la suspension de protoplaste à 37 °C pendant 30 min pour se désestérifier complètement.</li>
	<li>Aspirer 15 μL de la suspension de protoplaste et égoutter sur une lame.</li>
	<li>Observer au microscope à fluorescence(figure supplémentaire S1). REMARQUE: Utilisez un appareil photo couleur avec une sensibilité élevée, c’est-à-dire un capteur CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) avec une résolution de pixels de 3,45 μm.</li>
	<li>Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (20x). Réglez la luminosité sur 0,5. REMARQUE: L’éclairage est des cubes de lumière LED à intensité réglable avec un ensemble de filtres à revêtement dur intégré. La longueur d’onde d’excitation de Fluo-4/AM est de 490 nm.</li>
</ol>3. Test de viabilité du protoplaste
<ol><li>Préparer la solution diacétate de fluorescéine (FDA) : Dissoudre la FDA dans l’acétone jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1 mg/mL.</li>
	<li>Préparer la solution de travail FDA avec 1 μL de la solution stock et 99 μL d’acétone.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de solution de travail FDA à 99 μL de suspension de protoplaste. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas, puis fermer le tube. REMARQUE: La concentration finale de la FDA est de 100 μg / L.</li>
	<li>Tache à température ambiante pendant 5 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Préparez les lames et observez-les au microscope à fluorescence.</li>
	<li>Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (Figure 1F).</li>
</ol>4. Analyse d’images
<ol><li>Analysez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et de tableur (p. ex., Image-Pro Plus et Excel 2010).</li>
	<li>Sélectionnez deux diamètres verticaux parmi les protoplastes pour calculer l’intensité de fluorescence (Figure supplémentaire S2). Mesurer l’intensité de fluorescence de tous les protoplastes sous différents traitements a été mesurée. Pour le traitement final, utilisez un logiciel de retouche photo.</li>
</ol>5. Analyse statistique
<ol><li>Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique (Figure supplémentaire S3). Les données sont présentées dans moyenne ± SD. Le test tde l’étudiant a été utilisé pour analyser les différences entre les groupes expérimentaux.</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
<li>Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+apple+fruit+firmness--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal-+American+Pomological+Society%22%5BJournal%5D)">Factors affecting apple fruit firmness--a review.</a> Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).</li>
<li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+softening+of+apple+%28Malus+domestica%29+fruit%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Experimental+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li>
<li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+across+plant+membranes%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li>
<li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+horticulturae%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li>
<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
<li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Horticulture+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li>
<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca%282%29%28%2B%29+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics.</a> Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca%282%29%28%2B%29+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators.</a> Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2%2B-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320(2016).</li>
<li>Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+is+required+for+calcium+homeostasis+and+proper+pollen+tube+tip+growth+in+Petunia%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia.</a> Planta. 245 (5), 909-926 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADK2+positively+modulates+abscisic+acid-induced+stomatal+closure+by+affecting+accumulation+of+H2O2%2C+Ca2%2B+and+nitric+oxide+in+Arabidopsis+guard+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells.</a> Plant Science. 262, 81-90 (2017).</li>
<li>Niu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+availability+regulates+the+development+of+root+hairs+in+Arabidopsis+thaliana+%28L.%29+Heynh%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.</a> Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).</li>
<li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91(2020).</li>
<li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Journal%22%5BJournal%5D)">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li>
<li>Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hyperpolarization-activated+calcium+channels+in+apical+pollen+tubes+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia.</a> New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx6+regulates+left%2Fright+patterning+in+mouse+embryos+through+effects+on+nodal+cilia+and+perinodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling.</a> PLoS One. 3 (6), 2511(2008).</li>
<li>DeSimone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+taste+receptor+cell+%5BCa2%2B%5Di+modulate+chorda+tympani+responses+to+salty+and+sour+taste+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).</li>
<li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2%2B+in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye%2C+calibration+of+traces%2C+measurements+in+the+presence+of+plasma%2C+and+buffering+of+cytosolic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).</li>
<li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+Ca2%2B+in+cells+of+intact+wheat+roots%3A+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li>
<li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2%2B+and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2%2B+release+to+the+cytoplasm+and+%5BCa2%2B%5Dc+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53(2010).</li>
<li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Dans cette étude, des protoplastes viables ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Notez que cette méthode nécessite des pommes fraîches. Le présent protocole permet l’isolement rapide d’un grand nombre de protoplastes de la pulpe de fruit pour une utilisation dans des études de recherche. L’applicabilité de cette méthode ne se limite pas à « Fuji »; les protoplastes de la pulpe de pomme de 'Dounan' et 'Honey Crisp' peuvent également être extraits par le même protocole(Figure supplémentaire S4). La so...

Ca2+ joue un rôle important dans la transduction du signal végétal et le métabolisme1,2. En outre, il régule les caractéristiques de qualité des fruits3,4, y compris la dureté, la teneur en sucre et la susceptibilité aux troubles physiologiques pendant le stockage5,6. Le Ca2+ cytoplasmique joue un rôle important dans la transduction du signal et régule la croissance et le développement des plantes7. La perturbation de l’homéostasie cellulaire du calcium peut induire une fosse amère dans les pommes8, la maladie des taches brunes dans les poires9et la pourriture ombilicale dans les tomates10, affectant la qualité des fruits et causant de graves pertes économiques3,11. L’imagerie calcique a une résolution spatiale et temporelle suffisante et est une méthode importante pour observer la dynamique du Ca2+ dans les cellules vivantes12,13.
À l’heure actuelle, il existe deux méthodes principales pour l’imagerie calcique intracellulaire dans les cellules vivantes: l’une utilise des sondes fluorescentes chimiques à petites molécules14, et l’autre est le capteur de codage génique (GECI)15,16. Compte tenu de la difficulté d’établir un système transgénique stable dans les arbres fruitiers et du développement plus long des fruits, GECIS ne convient pas à l’imagerie par fluorescence ca2+ des fruits.
Les sondes fluorescentes à petites molécules telles que Fluo-4/AM présentent un avantage particulier : leur forme d’ester AM (dérivé d’ester acétoxyméthyléfiable aux cellules) peut être facilement chargée en vrac dans des cellules vivantes sans avoir besoin de transfection, ce qui la rend flexible, rapide et non cytotoxique17. Fluo-4 / AM pourrait être chargé avec succès dans le tube pollinique de Pyrus pyrifolia18 et Petunia,19 ainsi que dans les cellules de garde20 et les poils racinaires d’Arabidopsis 21.
À l’heure actuelle, il existe peu de rapports sur la coloration par fluorescence de calcium des cellules de la pulpe22. En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que les pommes. Les pommiers sont mondialement reconnus comme une espèce économique importante, et les pommes sont considérées comme un aliment sain23. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables à partir de pulpe de fruit de pomme par hydrolyse enzymatique, puis chargé des réactifs fluorescents à petites molécules dans le cytoplasme pour détecter ca2+.

<table><tbody><tr><td>10&times ; solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (solution tamponnée au phosphate) est une solution tampon de phosphate, qui peut fournir un environnement ionique relativement stable et une capacité tampon de pH. Il s’agit d’une solution saline tampon souvent utilisée en biologie pour le clonage moléculaire et la culture cellulaire. Le pH est de 7,4.</td></tr><tr><td>Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>Tampon biologique</td></tr><tr><td>CaCl2&middot ; Le chlorure de calcium 2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>est un produit chimique blanc ou gris, principalement sous forme granulaire.</td></tr><tr><td>Cellulase R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>Dégrade les parois cellulaires végétales.</td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>Il a de bonnes propriétés hydratantes, prévient le dessèchement et empêche le sucre, le sel, etc. de cristalliser.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 est un polyol tensioactif non ionique (poids moléculaire d’environ 12500 Daltons), qui s’est avéré bénéfique pour favoriser la dissolution des colorants insolubles dans l’eau et d’autres matériaux dans les milieux physiologiques.</td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA est un substrat d’estérase perméable aux cellules qui peut servir de sonde de viabilité qui mesure à la fois l’activité enzymatique, qui est nécessaire pour activer sa fluorescence, et l’intégrité de la membrane cellulaire, qui est nécessaire à la rétention intracellulaire de leur produit fluorescent</td></tr>.<tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>L’indicateur de calcium fluorescent vert Fluo-4/AM est une version améliorée de l’indicateur de calcium Fluo-3/AM. Le Fluo-4/AM se charge plus rapidement et est plus lumineux à la même concentration. Il peut être bien excité avec un laser ionique argon de 488 nm.</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>Observez l’image de fluorescence.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>Dégrader les tissus végétaux pour séparer les cellules individuelles.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>Il est largement utilisé dans la préparation de tampons dans les expériences de biochimie et de biologie moléculaire.</td></tr></tbody></table>

coloration du ca2+ cytoplasmique avec fluo-4/am dans la pulpe de pomme

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Le Ca2+ cytosolique joue un rôle clé dans le développement des plantes. L’imagerie calcique est la méthode la plus polyvalente pour détecter les changements dynamiques dans le Ca2+ dans le cytoplasme. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables de cellules pulpaires par hydrolyse enzymatique. Des protoplastes isolés ont été incubés avec le réactif fluorescent à petites molécules (Fluo-4/AM) pendant 30 min à 37 °C. Les sondes fluorescentes ont réussi à coloré le Ca2+ cytosolique mais ne se sont pas accumulées dans les vacuoles. La3+,un bloqueur de canaux Ca2+, a diminué l’intensité de la fluorescence cytoplasmique. Ces résultats suggèrent que Fluo-4/AM peut être utilisé pour détecter les changements dans le Ca2+ cytosolique dans la chair du fruit. En résumé, nous présentons une méthode pour isoler efficacement les protoplastes des cellules de chair du fruit et détecter le Ca2+ en chargeant un réactif fluorescent de calcium à petites molécules dans le cytoplasme des cellules pulpaires.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons utilisé la méthode enzymatique pour obtenir des protoplastes viables à partir de la pulpe (Figure 1). Certains protoplastes avaient des vacuoles, tandis que d’autres n’en avaient pas. Alors que les protoplastes ne présentaient aucune fluorescence lorsque l’indicateur fluorescent Ca2+ n’y était pas chargé. Lorsque Fluo-4/AM a été chargé dans les protoplastes, le cytoplasme, mais pas la vacuole, est devenu fluorescent (<strong class=...

Des protoplastes isolés de cellules de pulpe de pomme ont été chargés d’un réactif fluorescent de calcium pour détecter la concentration cytoplasmique de Ca2+.

Coloration du Ca2+ cytoplasmique avec Fluo-4/AM dans la pulpe de pomme

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que la pomme, il peut réguler la dureté, la teneur en sucre, la période de stockage et le désordre physiologique pendant le stockage. L’imagerie calcique est la méthode la plus occidentale pour détecter les changements dynamiques dans les ions calcium dans le cytoplasme. Les indicateurs fluorescents à petites molécules, tels que fluo-4 / AM, ont une sélectivité spécifique aux ions calcium et peuvent être chargés de manière non invasive par incubation d’estérification, qui est flexible, rapide et non cytotoxique.Ce protocole introduira une méthode de chargement de petites molécules de réactif fluorescent chimique fluo-4/AM dans des protoplastes végétaux. Extraction de protoplaste Ajouter 0,5 millilitre de solution enzymatique dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Choisissez une pomme saine et mûre, puis coupez la pulpe en 10 fois 5 fois 1 millilitre cube.Placez les morceaux de pâte dans une solution enzymatique, puis fermez le tube. Incubé le tube à 28 degrés pendant une heure. Enchaîné à 70 tr/min dans l’obscurité.Après cela, lavez les morceaux de pulpe, aspirez toute la solution enzymatique, puis ajoutez une solution de base de 0,5 millilitre. Centrifuger à une vitesse de 300 g pendant 2 minutes. La suspension de protoplastes peut être obtenue en aspirant la solution inférieure.Coloration du réactif de fluorescence chimique à petites molécules. Préparer la solution de chargement fluo-4/AM avec un fluo-4/AM de 2 millimolaires, 20% d’éthyl127, et la solution saline tamponnée au phosphate 10X dans un rapport de un à un à deux. Ajouter 1 solution de charge de microlitres de fluo-4/AM à 99 microlitres de suspension de protoplaste.La concentration finale de colorants fluorescents est de 5 micromolaires. Mélanger la solution puis fermer le tube. Dans le même temps, le fer lanthane est le calcium ou l’unicité du petit agent fluorescent chimique moléculaire.Ajouter un microlitre ou 10 microlitres de fer lanthane de plus, puis une solution de charge de microlitre de fluo-4/AM à 98 microlitres de suspension de protoplastes. La concentration finale de fer lanthane est de 100 micromolaires. Mélanger la solution puis fermer le tube.Incuber à 37 degrés pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après cela, centrifugez à la vitesse de 300 G pendant deux minutes. Aspirer à 17 microlitres et ajouter une solution de base de 17 microlitres.Incuber la suspension de protoplaste à 37 degrés pendant 30 minutes pour complètement Après cela, aspirer 50 microlitres de suspension de protoplastes et goutter sur une glissière. Observez au microscope à fluorescence. Sélectionnez le grossissement 20x et le canal GFP à observer.Réglez uniformément la luminosité à 0,5. Une étape critique de cette méthode proposée consiste à laver la tache dans les protoplastes et à les incuber pendant 30 minutes. Un lavage insuffisant provoque un soutien excessif sur la fluorescence pendant l’observation et l’incubation permet une meilleure charge ou la sonde dans le cytoplasme.Test de viabilité des protoplastes Prendre 99 microlitres de suspension de protoplastes après une incubation à 37 degrés pendant 30 minutes. Ajouter 1 ml au niveau de la solution FD à la suspension de protoplastes. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas plusieurs fois, puis fermer le tube.Restez à température ambiante pendant cinq minutes dans l’obscurité. Préparez les lames et observez-les au microscope à fluorescence avec canal GFP. Nous vous présentons les résultats Suivant la première figure.Nous utilisons la méthode enzymatique pour obtenir des protoplastes de la pulpe. Certains protoplastes avaient une vacuole alors que d’autres n’en avaient pas. Les protoplastes ont été colorés avec FD pendant cinq minutes et montrent le florescent dans le cytoplasme indiquant qu’une température élevée, 37 degrés n’affecte pas la viabilité ou les protoplastes Figure deux.Les protoplastes n’ont montré aucune fluorescence dans l’un des indicateurs de fluorescence des fers à calcium ou il n’est pas chargé dans eux. Que dans fluo-4 / AM a été chargé dans le protoplaste, le cytoplaste, mais pas une vacuole est devenu fluorescent. Lanthane Les fers qui bloquent efficacement les canaux calciques sont la membrane cellulaire ont été ajoutés à la charge Protoplast fluo-4 / AM.À la concentration finale de 100 fers de lanthane micromolaires, ils réduisent considérablement l’intensité de la fluorescence du calcium. Ces résultats ont en outre démontré que le fluo-4 / AM reste efficacement dans les fers de calcium dans le cytoplaste et qu’il montre des changements dynamiques dans la teneur en fers de calcium. Figure trois Les résultats fluo-4/AM ont été analysés à l’aide de la coloration fluo-4/AM approuvée par le logiciel IMH plus 6.0 avec ajout de fers lanthanes réduisant considérablement la valeur de floraison des fers calciques cytoplasmiques.Dans cette vidéo, tous les protoplastes ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Nous avons chargé avec succès les sondes fluorescentes dans un protoplaste à 37 degrés. De plus, la méthode n’a pas affecté la viabilité des protoplastes.En résumé, la méthode décrite ici en nature détaillée. Les changements dynamiques dans les ions calcium cytoplasmiques dans les cellules de la pulpe de pomme fournissant ainsi 10 supports égaux pour les objectifs ultérieurs des études liées au calcium.

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JoVE Journal

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Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

L'activité spontanée de développer des réseaux neuronaux peuvent être mesurées en utilisant AM-ester formes de colorants indicateurs sensibles au calcium. Modifications du calcium intracellulaire, indiquant l'activation neuronale, sont détectés comme des changements transitoires de la fluorescence indicateur avec un ou deux photons d'imagerie. Ce protocole peut être adapté pour une gamme de stade de développement qui dépendent des réseaux...

Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure de coloration pour visualiser le dépôt de cellulose dans les parois cellulaires d’Arabidopsis thaliana, une plante dicotylédones, en utilisant du blanc de calcofluor, qui se lie spécifiquement aux glucanes liés à β, présentant une fluorescence sous la lumière UV.

Coloration blanche au calcofluor : une méthode simple pour la visualisation par fluorescence induite par les UV des dépôts de cellulose dans les parois cellulaires des sections de tiges de plantes dicotylédones

Nous décrivons l'utilisation de colorants styryles FM à l'image synaptique recyclage des vésicules dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles. Ce protocole peut être appliqué non seulement à évoquer, mais aussi spontané et activités synaptiques miniatures. Le protocole élargit le choix des événements synaptiques qui peuvent être évaluées de manière efficace.

Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures

La composition de la paroi cellulaire végétale varie selon les types de tissus et peut inclure la lignine, la cellulose, les hémicelluloses et la pectine. Diverses techniques de coloration ont été développées pour visualiser les différences au niveau du type de cellule. Cet article est une compilation des techniques de coloration de la paroi cellulaire couramment utilisées.

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L'essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l'identification de ligand (s) d'activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).

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Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ Ψm) pour séquestrer le calcium (Ca2 +), ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique 2+ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries Ca2 + d'absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

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Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

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Les colorants fluorescents vitaux sont des outils essentiels pour les analyses d'imagerie des cellules vivantes dans la biologie des cellules fongiques modernes. Cet article détaille l'application de colorants fluorescents établis et moins connus pour suivre la dynamique de la membrane plasmatique, l'endo-/exocytose et la morphogénèse de la paroi cellulaire dans les champignons filamenteux.

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Ici, une méthode est décrite pour rendre les tissus végétaux transparents tout en maintenant la stabilité des protéines fluorescentes. Cette technique facilite l’imagerie en profondeur des tissus végétaux nettoyés sans sectionnement physique.

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Coloration du Ca²⁺ cytoplasmique avec Fluo-4/AM dans la pulpe de pomme

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