Name: Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Découvrez l'analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence chez les souris Braf/Pten. Cette méthode non invasive permet le suivi longitudinal de la progression métastatique du mélanome.

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Les auteurs tiennent à remercier S. Burchielli (FTGM, Pise) pour son aide dans les procédures animales. Ce travail a été soutenu par ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financement institutionnel à LP; MFAG #17095 décerné par AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro à LP.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le ministère italien de la Santé (protocoles animaux #754/2015-PR et #684/2018-PR).
1. Induction du mélanome
REMARQUE: Des souris Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox âgées de six semaines [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] ont été utilisées dans cette étude (voir la table des matériaux).
<ol><li>Traiter les souris avec du 4-hydroxytamoxifène (4-HT) en appliquant 3 μL de 5 mM 4-HT sur ~1 cm2 de peau rasée du haut du dos, comme décrit précédemment11,16,17, pendant 3 jours consécutifs. REMARQUE: Cela activera l’enzyme Cre et provoquera un passage de wt Braf à BrafV600E et la perte de Pten. Ces deux coups sont suffisants pour induire la formation d’un mélanome.</li>
	<li>Observez que les tumeurs primaires se développent sur le site de la peinture de la peau en 2-3 semaines et atteignent un volume de 50-100 mm3 en 4 semaines. Observez également des métastases à d’autres sites cutanés, ganglions lymphatiques et poumons à ce moment (t0).</li>
	<li>Utilisez des étriers pour mesurer le volume de la tumeur primaire et des métastases sous-cutanées, et l’imagerie échographique pour mesurer le volume des ganglions lymphatiques inguinaux. Répétez ces mesures après une semaine (t1, 5 semaines après la peinture de la peau) et après deux semaines (t2, 6 semaines après la peinture de la peau).</li>
	<li>Au dernier moment, euthanasiez les souris en les surdoser de sévorane gazeux.</li>
	<li>Analysez la tumeur primaire et les ganglions lymphatiques par inspection visuelle, puis excisez-les pour des études histologiques, comme indiqué en 16.</li>
</ol>2. Procédure d’imagerie
<ol><li>Placez la souris dans une chambre d’induction pour l’anesthésie au gaz et fournissez 3% d’isoflurane en oxygène pur jusqu’à ce que l’animal soit complètement anesthésié. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par manque de réponse au pincement de la patte.</li>
	<li>Transférez l’animal sur une planche chauffée - une partie constitutive de la station d’imagerie UHFUS - en maintenant l’animal en position couchée. Utilisez une sonde rectale lubrifiée avec de la vaseline pour mesurer la température corporelle. Ajustez la température de la carte pour maintenir la température corporelle de la souris dans la plage physiologique (36 ± 1 ° C).</li>
	<li>Humidifiez les yeux de la souris avec une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie. Fournir du gaz narcotique (1,5% d’isoflurane dans de l’oxygène pur) à travers le masque nasal d’une souris. Ajuster le pourcentage d’isoflurane pour maintenir la profondeur correcte de l’anesthésie.</li>
	<li>Enduisez les pattes antérieures et postérieures de pâte conductrice et collez-les aux électrodes de la plaque ECG intégrées dans la carte. Vérifiez que les paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, signal respiratoire et température corporelle centrale) sont correctement acquis et affichés.</li>
	<li>Enlevez les poils des deux zones inguinales en appliquant un agent dépilatoire et enduisez-les d’un fluide de couplage acoustique.</li>
	<li>Serrez la sonde linéaire UHFUS (fréquence centrale de 40 MHz) dans un moteur 3D spécialisé intégré dans la station d’imagerie UHFUS, permettant un mouvement automatisé et progressif de la sonde.</li>
	<li>Orienter et ajuster correctement la position de la sonde à ultrasons pour obtenir des images à axe court du ganglion lymphatique inguinal (gauche / droite) et placer la région d’intérêt dans la zone focale.</li>
	<li>Scannez tout le volume du ganglion lymphatique inguinal sous la forme d’une séquence d’images 2D en mode B, comme décrit précédemment18. Acquérir des images à plusieurs niveaux du ganglion lymphatique par mouvement linéaire du transducteur avec des tailles de pas à l’échelle micrométrique, pour générer des données 3D en termes de boucles cinétiques automatiquement respiratives et cardiaques.</li>
	<li>Réglez l’enregistrement de l’image avec les paramètres suivants: distance de balayage comprise entre 2 et 5 mm (selon la taille des ganglions lymphatiques); taille des pas 44 μm, avec un résultat de 46 à 114 pas de balayage / tranches de ganglions lymphatiques et un temps d’acquisition de 1 à 3 minutes par animal. Stockez numériquement les images acquises au format brut (DICOM) pour d’autres analyses hors ligne.</li>
	<li>À la fin de la séance d’imagerie, interrompez l’anesthésie au gaz et laissez l’animal récupérer sur la planche chauffante en position couchée sternale. Prenez soin de l’animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la position couchée.</li>
</ol>3. Post-traitement des images échographiques
<ol><li>Ouvrez le jeu de données d’images 3D DICOM du ganglion lymphatique inguinal gauche/droit dans la plate-forme logicielle pour le post-traitement de l’image échographique.</li>
	<li>Segmentation:<ol>
<li>Sélectionnez Méthode multi-tranches pour visualiser à la fois les images actuelles et les vignettes de toutes les images correspondant à chaque image capturée lors de l’acquisition 3D.</li>
		<li>Sélectionnez la vignette de la première image pour la charger dans la vue de contour. Dans la vue de contour, cliquez avec le bouton gauche de la souris pour déposer des points le long de la bordure du ganglion lymphatique. Une fois que le nombre de points souhaité a été défini (plage 10-15), cliquez avec le bouton droit de la souris pour compléter le contour.</li>
		<li>Une fois le premier contour terminé, utilisez la vue miniature pour sélectionner l’image suivante à mettre en contour. Si nécessaire, sautez plusieurs images (moyenne de 3 images) entre les contours pour réduire le nombre de traces manuelles nécessaires pour chaque volume 3D. REMARQUE: La plate-forme logicielle pour le post-traitement de l’image échographique générera automatiquement des contours entre les traces manuelles, réduisant ainsi le temps d’analyse.</li>
		<li>Répétez ce processus jusqu’à ce que le volume entier ait été décrit. Une fois terminé, cliquez sur Terminer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Génération du wireframe 3D et de la mesure de volume :<ol>
<li>Dans l’espace de travail de la fenêtre en mode 3D , cliquez sur l’icône Mesure du volume sous la zone d’affichage de l’image pour activer la vue de surface. Remarque : La vue de surface crée une vue de compilation qui mappe le volume généré par l’utilisateur à l’image acquise. La vue de surface peut être pivotée dans n’importe quelle position souhaitée.</li>
		<li>Prenez note de la mesure du volume indiquée dans le coin inférieur gauche de la vue cubique. REMARQUE: La segmentation et la génération de volume 3D peuvent également être obtenues à l’aide d’un logiciel développé sur mesure et / ou d’un logiciel librement disponible / commercial pour le traitement général de l’image. À partir de la segmentation manuelle, le logiciel doit fournir une description mathématique et/ou au niveau des pixels des contours des ganglions lymphatiques. Ces contours seraient combinés dans un espace 3D pour rendre la surface externe des ganglions lymphatiques. Toutes les étapes décrites dans la procédure d’imagerie et le post-traitement des images échographiques sont résumées à la figure 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma%3A+updates+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).</li>
<li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li>
<li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma%3A+a+cost-effectiveness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Actas+Dermo-Sifiliograficas%22%5BJournal%5D)">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li>
<li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li>
<li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy%3A+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li>
<li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).</li>
<li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braf%28V600E%29+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li>
<li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li>
<li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li>
<li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li>
<li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF%28V600E%29+inhibition+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li>
<li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li>
<li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li>
<li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li>
<li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li>
<li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les données obtenues dans cette étude attestent de la capacité de l’imagerie échographique à surveiller l’implication métastatique des ganglions lymphatiques inguinaux du modèle murin Braf/Pten du mélanome métastatique. Comme indiqué précédemment16, cette technique est particulièrement utile pour évaluer l’efficacité du traitement médicamenteux. En effet, il permet de surveiller l’évolution du volume des ganglions lymphatiques chez le même animal au fil du temps, en comparant les mesures recueilli...

Le mélanome est une forme agressive de cancer de la peau qui se propage souvent à d’autres sites cutanés (métastases sous-cutanées), ainsi qu’aux ganglions lymphatiques, aux poumons, au foie, au cerveau et aux os1. Au cours de la dernière décennie, de nouveaux médicaments ont été introduits dans la pratique clinique et ont contribué à améliorer l’espérance de vie des patients atteints de mélanome métastatique. Cependant, des limites subsistent, notamment un temps et un degré de réponse variables, des effets secondaires graves et l’insurrection de la résistance acquise1. Par conséquent, il est crucial de détecter la propagation métastatique à ses premiers stades, c’est-à-dire lorsqu’elle atteint les ganglions lymphatiques locaux.
Une biopsie des ganglions lymphatiques locaux (ganglions sentinelles) est habituellement effectuée pour vérifier la présence de cellules de mélanome. Cependant, l’imagerie échographique s’impose comme une méthode non invasive de détection de l’atteinte métastatique, car elle surpasse l’évaluation clinique et peut aider à éviter une biopsie inutile2,3,4. De plus, l’échographie semble appropriée pour la surveillance des ganglions lymphatiques, en particulier dans le cas d’un âge avancé et/ou de comorbidités5,6. Les caractéristiques détectées par échographie et permettant la différenciation entre les ganglions lymphatiques normaux et métastatiques comprennent une augmentation de la taille (volume), un changement de forme de l’ovale au rond, une marge irrégulière, un schéma échogénique altéré et une vascularisation altérée (accrue)7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox des souris génétiquement modifiées (souris Braf/Pten) ont récemment été mises à la disposition de la communauté scientifique en tant que modèle tissulaire spécifique et inductible pour le mélanome métastatique8. Dans ce modèle animal, les tumeurs primaires se développent très rapidement: elles deviennent visibles dans les 2-3 semaines suivant l’induction du passage de la braf de type sauvage (wt) à BrafV600E et de la perte de Pten, alors qu’elles atteignent un volume de 50-100 mm3 en 4 semaines. Dans les 2 semaines suivantes, la croissance de la tumeur primaire s’accompagne d’une augmentation progressive de la charge métastatique dans d’autres sites cutanés, ganglions lymphatiques et poumons.
Les souris Braf/Pten ont été largement utilisées à de multiples fins, notamment la dissection des voies de signalisation impliquées dans la mélanome9,10, l’identification des cellules de mélanome d’origine11,12,13 et le test de nouvelles options thérapeutiques en termes de traitement ciblé et d’immunothérapie8,14,15,16 . Plus précisément, nous avons utilisé des souris Braf/Pten pour démontrer que Listeria monocytogenes atténuée (Lmat) fonctionne comme un vaccin anti-mélanome. Lorsqu’il est administré par voie systémique dans le cadre thérapeutique, Lmat n’est pas associé à une toxicité globale car il s’accumule sélectivement sur les sites tumoraux. En outre, il provoque une diminution remarquable de la masse du mélanome primaire et une réduction de la charge métastatique dans les ganglions lymphatiques et les poumons. Au niveau moléculaire, Lmat provoque la destruction apoptotique des cellules de mélanome, qui est due, au moins en partie, à des activités non autonomes cellulaires (recrutement sur place de lymphocytes T CD4+ et CD8+)16.
Lorsque des souris Braf /Pten sont utilisées pour la modélisation du mélanome, la croissance des tumeurs primaires et des métastases sous-cutanées peut être surveillée par des mesures d’étrier. Cependant, l’implication des ganglions lymphatiques et des poumons doit être étudiée à l’aide d’une technique alternative, peut-être non invasive qui permet aux chercheurs de suivre le même animal au fil du temps. Cet article décrit l’utilisation de l’imagerie échographique (Figure 1), associée à une analyse volumétrique 3D ultérieure des données obtenues, pour la surveillance longitudinale de l’augmentation de la taille (volume) des ganglions lymphatiques inguinaux.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifène</td><td>Merck</td><td>H6278</td><td>médicament utilisé pour l’induction tumorale</td></tr><tr><td>B6. souris Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)</td><td>Souris The Jackson Laboratory</td><td>013590</td><td></td></tr><tr><td>Blu gel</td><td>Sooft Ialia</td><td></td><td>solution ophtalmique gel</td></tr><tr><td>BRAFV600E anticorps</td><td>Spring Bioscience Corporation</td><td>E19290</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (isoflorane)</td><td>Zoetis</td><td></td><td>liquide pour anesthésie gazeuse</td></tr><tr><td>Anticorps MLANA Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>M2-7C10</td><td></td></tr><tr><td>Sigma gel</td><td>Parker</td><td></td> gel <td>d’électrode</td></tr><tr><td>Gel transonique transparent</td><td>Telic SAU</td><td></td><td>gel à ultrasons</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Reckitt Benckiser IT</td><td></td><td>crème dépilatoire</td></tr><tr><td>Compact Dual Anesthesia System</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Système d’anesthésie à base d’isoflurane équipé d’un cône nasal et d’une chambre d’induction</td></tr><tr><td>MX550S</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Sonde linéaire UHFUS</td></tr><tr><td>Vevo 3100</td><td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Système UHFUS</td></tr><tr><td>Station d’imagerie Vevo Fujifilm</td><td>, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Station d’imagerie UHFUS et unité de surveillance physiologique avancée dotée d’une planche chauffante</td></tr><tr><td>Vevo Lab Fujifilm</td><td>, Visualsonics Inc.</td><td></td><td>Plate-forme logicielle pour le post-traitement des images échographiques</td></tr></tbody></table>

analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié braf/pten

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox les souris génétiquement modifiées (souris Braf/Pten) sont largement utilisées comme modèle in vivo de mélanome métastatique. Une fois qu’une tumeur primaire a été induite par un traitement au tamoxifène, une augmentation de la charge métastatique est observée dans les 4 à 6 semaines suivant l’induction. Cet article montre comment l’imagerie ultra-haute fréquence ultra-haute fréquence (UHFUS) peut être exploitée pour surveiller l’augmentation de l’implication métastatique des ganglions lymphatiques inguinaux en mesurant l’augmentation de leur volume.
Le système UHFUS est utilisé pour scanner des souris anesthésiées avec une sonde linéaire UHFUS (22-55 MHz, résolution axiale 40 μm). Les images en mode B des ganglions lymphatiques inguinaux (côtés gauche et droit) sont acquises dans une vue à axe court, positionnant les animaux en position couchée dorsale. Les enregistrements d’échographie sont acquis en utilisant une taille de pas de 44 μm sur un bras mécanique motorisé. Ensuite, les acquisitions bidimensionnelles (2D) en mode B sont importées dans la plate-forme logicielle pour le post-traitement de l’image échographique, et les ganglions lymphatiques inguinaux sont identifiés et segmentés semi-automatiquement dans les images 2D transversales acquises. Enfin, une reconstruction totale du volume tridimensionnel (3D) est automatiquement obtenue avec le rendu du volume des ganglions lymphatiques, qui est également exprimé sous forme de mesure absolue.
Cette technique in vivo non invasive est très bien tolérée et permet de programmer plusieurs séances d’imagerie sur un même animal expérimental sur 2 semaines. Il est donc idéal d’évaluer l’impact du traitement pharmacologique sur la maladie métastatique.

Après la peinture de la peau de Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox souris avec 4-HT, l’activité Cre est induite, en raison de laquelle il y a un passage au niveau génomique de wt Braf à BrafV600E, tandis que Pten est perdu (Figure 3A). En 2-3 semaines, les souris développent des tumeurs primaires sur place avec une pénétrance à 100%. Après quatre semaines de traitement 4-HT (t0), les tumeurs primaires atteignent un volume de 50-100 mm3</s...

Le mélanome est une maladie très agressive qui se propage rapidement à d’autres organes. Ce protocole décrit l’application de l’imagerie échographique à ultra-haute fréquence, associée à un rendu 3D, pour surveiller le volume des ganglions lymphatiques inguinaux dans le modèle murin Braf/Pten du mélanome métastatique.

Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Notre méthode permet de surveiller l’augmentation de l’implication métastatique des ganglions lymphatiques inguinaux en mesurant l’augmentation de leur volume. Cette méthode non invasive est très bien tolérée, par conséquent, plusieurs séances d’imagerie peuvent être programmées sur le même animal expérimental au cours de deux semaines. Cette méthode est idéale pour évaluer l’impact du traitement pharmacologique sur la maladie métastatique.Nous avons appliqué cette méthode au modèle de mélanome de Braf/Pten, mais en principe, elle peut être adaptée pour évaluer l’efficacité de divers médicaments dans une variété de modèles murins précliniques de cancer métastatique. La dre Marianna Vitiello, post-doctorante de mon laboratoire, et claudia Kusmic, chercheuse à l’IFC-CNR, feront la démonstration de la procédure. Pour l’induction du mélanome, appliquez trois microlitres de 4-hydroxytamoxifène de cinq millimolaires sur environ un centimètre carré de peau rasée du haut du dos pendant trois jours d’affilée.Six semaines après la peinture de la peau, utilisez des étriers pour mesurer le volume de la tumeur primaire et, éventuellement, des métastases sous-cutanées. Ensuite, utilisez l’imagerie échographique pour mesurer le volume des ganglions lymphatiques inguinaux. Après avoir analysé la tumeur primaire et les ganglions lymphatiques par inspection visuelle, les exciser pour des études histologiques.Après avoir confirmé l’anesthésie, transférez l’animal sur une planche chauffée de la station d’imagerie par ultrasons à ultra-haute fréquence, en maintenant l’animal en position couchée. Ajustez la température de la carte à l’aide d’une sonde rectale lubrifiée avec de la vaseline pour maintenir la température corporelle de la souris dans la plage physiologique. Enduisez les pattes antérieures et postérieures de pâte conductrice et collez-les aux électrodes de la plaque ECG intégrées dans la carte.Vérifiez que les paramètres physiologiques sont correctement acquis et affichés. Enlevez les poils des deux zones inguinales en appliquant un agent dépilatoire et enduisez-les d’un fluide de couplage acoustique. Ensuite, serrez la sonde linéaire à ultrasons ultra-haute fréquence dans un moteur 3D spécialisé intégré dans la station d’imagerie, permettant un mouvement automatisé et progressif de la sonde.Orienter et ajuster correctement la position de la sonde à ultrasons pour obtenir des images à court accès du ganglion lymphatique inguinal et placer la région d’intérêt dans la zone focale. Réglez la distance de balayage entre deux et cinq millimètres, la taille du pas à 44 micromètres avec un résultat de 46 à 114 pas de balayage par tranche de ganglion lymphatique et un temps d’acquisition d’une à trois minutes par animal. Scannez tout le volume du ganglion lymphatique inguinal sous la forme d’une séquence d’images 2D en mode B, en acquérant des images à plusieurs niveaux par mouvement linéaire du transducteur avec des tailles de pas à l’échelle micrométrique pour générer des données 3D en termes de respiration et de boucles cinétiques cardiaques.Après l’imagerie, stockez numériquement les images acquises au format brut pour d’autres analyses hors ligne. Pour le post-traitement des images échographiques, ouvrez l’ensemble de données des images 3D des ganglions lymphatiques inguinaux, sélectionnez la méthode multi-tranches et appuyez sur le bouton Démarrer pour visualiser à la fois les images actuelles et les vignettes de toutes les images correspondant à chaque image capturée lors de l’acquisition 3D. Sélectionnez la vignette de la première image où le ganglion lymphatique est évident pour le charger dans la vue de contour.Dans la vue de contour, cliquez avec le bouton gauche de la souris pour déposer des points le long de la bordure du ganglion lymphatique. Une fois que le nombre de points souhaité a été défini, léchez à droite pour compléter le contour. Une fois le premier contour terminé, utilisez la vue miniature pour sélectionner l’image suivante à mettre en contour.Si nécessaire, ignorez plusieurs images entre les contours pour réduire le nombre de traces manuelles nécessaires pour chaque volume 3D. Répétez ce processus jusqu’à ce que le volume entier ait été décrit, puis cliquez sur Terminer. Dans l’espace de travail de la fenêtre du mode 3D, cliquez sur l’icône de mesure du volume sous la zone d’affichage de l’image pour visualiser la valeur numérique du volume du ganglion lymphatique et activez la vue de surface avec le rendu 3D du volume du ganglion lymphatique.Le traitement de souris avec du 4-hydroxytamoxifène induit une activité enzymatique CreER, provoquant un passage au niveau génomique de Braf de type sauvage à Braf V600E muté, tandis que Pten est perdu. Quatre semaines après le traitement au 4-hydroxytamoxifène, les tumeurs primaires atteignent un volume de 50 à 100 millimètres cubes et leur croissance peut être mesurée par des étriers pendant deux semaines supplémentaires, montrant ainsi une augmentation progressive de la pigmentation observée dans les ganglions lymphatiques inguinaux. Les dépôts de mélanine sont invariablement dus à la présence de cellules métastasées de mélanome, comme le confirment la coloration immunohistochimique de l’antigène mélanome MelanA et Braf V600E.À la fin de la phase de segmentation, toutes les sections montraient la superposition du contour externe du ganglion lymphatique. Les rendus 3D d’un ganglion lymphatique inguinal droit, analysés quatre, cinq et six semaines après le traitement 4-HT sont montrés ici. L’augmentation du volume des ganglions lymphatiques inguinaux gauche et droit du même animal au fil du temps a également été quantifiée.Il est recommandé de coupler l’imagerie échographique avec une coloration immunohistochimique appropriée, afin que la présence de cellules cancéreuses soit confirmée au niveau moléculaire. Outre les ganglions lymphatiques, le volume des métastases sous-cutanées peut également être surveillé au fil du temps à l’aide de l’imagerie échographique. Si le délai de deux semaines est trop court pour apprécier les effets du médicament à l’étude, choisissez un site d’induction plus périphérique ou un génotype moins sujet aux tumeurs.

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Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten

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