Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten

Notre méthode permet de surveiller l’augmentation de l’implication métastatique des ganglions lymphatiques inguinaux en mesurant l’augmentation de leur volume. Cette méthode non invasive est très bien tolérée, par conséquent, plusieurs séances d’imagerie peuvent être programmées sur le même animal expérimental au cours de deux semaines. Cette méthode est idéale pour évaluer l’impact du traitement pharmacologique sur la maladie métastatique.

Nous avons appliqué cette méthode au modèle de mélanome de Braf/Pten, mais en principe, elle peut être adaptée pour évaluer l’efficacité de divers médicaments dans une variété de modèles murins précliniques de cancer métastatique. La dre Marianna Vitiello, post-doctorante de mon laboratoire, et claudia Kusmic, chercheuse à l’IFC-CNR, feront la démonstration de la procédure. Pour l’induction du mélanome, appliquez trois microlitres de 4-hydroxytamoxifène de cinq millimolaires sur environ un centimètre carré de peau rasée du haut du dos pendant trois jours d’affilée.

Six semaines après la peinture de la peau, utilisez des étriers pour mesurer le volume de la tumeur primaire et, éventuellement, des métastases sous-cutanées. Ensuite, utilisez l’imagerie échographique pour mesurer le volume des ganglions lymphatiques inguinaux. Après avoir analysé la tumeur primaire et les ganglions lymphatiques par inspection visuelle, les exciser pour des études histologiques.

Après avoir confirmé l’anesthésie, transférez l’animal sur une planche chauffée de la station d’imagerie par ultrasons à ultra-haute fréquence, en maintenant l’animal en position couchée. Ajustez la température de la carte à l’aide d’une sonde rectale lubrifiée avec de la vaseline pour maintenir la température corporelle de la souris dans la plage physiologique. Enduisez les pattes antérieures et postérieures de pâte conductrice et collez-les aux électrodes de la plaque ECG intégrées dans la carte.

Vérifiez que les paramètres physiologiques sont correctement acquis et affichés. Enlevez les poils des deux zones inguinales en appliquant un agent dépilatoire et enduisez-les d’un fluide de couplage acoustique. Ensuite, serrez la sonde linéaire à ultrasons ultra-haute fréquence dans un moteur 3D spécialisé intégré dans la station d’imagerie, permettant un mouvement automatisé et progressif de la sonde.

Orienter et ajuster correctement la position de la sonde à ultrasons pour obtenir des images à court accès du ganglion lymphatique inguinal et placer la région d’intérêt dans la zone focale. Réglez la distance de balayage entre deux et cinq millimètres, la taille du pas à 44 micromètres avec un résultat de 46 à 114 pas de balayage par tranche de ganglion lymphatique et un temps d’acquisition d’une à trois minutes par animal. Scannez tout le volume du ganglion lymphatique inguinal sous la forme d’une séquence d’images 2D en mode B, en acquérant des images à plusieurs niveaux par mouvement linéaire du transducteur avec des tailles de pas à l’échelle micrométrique pour générer des données 3D en termes de respiration et de boucles cinétiques cardiaques.

Après l’imagerie, stockez numériquement les images acquises au format brut pour d’autres analyses hors ligne. Pour le post-traitement des images échographiques, ouvrez l’ensemble de données des images 3D des ganglions lymphatiques inguinaux, sélectionnez la méthode multi-tranches et appuyez sur le bouton Démarrer pour visualiser à la fois les images actuelles et les vignettes de toutes les images correspondant à chaque image capturée lors de l’acquisition 3D. Sélectionnez la vignette de la première image où le ganglion lymphatique est évident pour le charger dans la vue de contour.

Dans la vue de contour, cliquez avec le bouton gauche de la souris pour déposer des points le long de la bordure du ganglion lymphatique. Une fois que le nombre de points souhaité a été défini, léchez à droite pour compléter le contour. Une fois le premier contour terminé, utilisez la vue miniature pour sélectionner l’image suivante à mettre en contour.

Si nécessaire, ignorez plusieurs images entre les contours pour réduire le nombre de traces manuelles nécessaires pour chaque volume 3D. Répétez ce processus jusqu’à ce que le volume entier ait été décrit, puis cliquez sur Terminer. Dans l’espace de travail de la fenêtre du mode 3D, cliquez sur l’icône de mesure du volume sous la zone d’affichage de l’image pour visualiser la valeur numérique du volume du ganglion lymphatique et activez la vue de surface avec le rendu 3D du volume du ganglion lymphatique.

Le traitement de souris avec du 4-hydroxytamoxifène induit une activité enzymatique CreER, provoquant un passage au niveau génomique de Braf de type sauvage à Braf V600E muté, tandis que Pten est perdu. Quatre semaines après le traitement au 4-hydroxytamoxifène, les tumeurs primaires atteignent un volume de 50 à 100 millimètres cubes et leur croissance peut être mesurée par des étriers pendant deux semaines supplémentaires, montrant ainsi une augmentation progressive de la pigmentation observée dans les ganglions lymphatiques inguinaux. Les dépôts de mélanine sont invariablement dus à la présence de cellules métastasées de mélanome, comme le confirment la coloration immunohistochimique de l’antigène mélanome MelanA et Braf V600E.

À la fin de la phase de segmentation, toutes les sections montraient la superposition du contour externe du ganglion lymphatique. Les rendus 3D d’un ganglion lymphatique inguinal droit, analysés quatre, cinq et six semaines après le traitement 4-HT sont montrés ici. L’augmentation du volume des ganglions lymphatiques inguinaux gauche et droit du même animal au fil du temps a également été quantifiée.

Il est recommandé de coupler l’imagerie échographique avec une coloration immunohistochimique appropriée, afin que la présence de cellules cancéreuses soit confirmée au niveau moléculaire. Outre les ganglions lymphatiques, le volume des métastases sous-cutanées peut également être surveillé au fil du temps à l’aide de l’imagerie échographique. Si le délai de deux semaines est trop court pour apprécier les effets du médicament à l’étude, choisissez un site d’induction plus périphérique ou un génotype moins sujet aux tumeurs.