Name: Trois méthodes d’analyse d’expression différentielle pour le séquençage de l’ARN : limma, EdgeR, DESeq2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Apprenez l'analyse d'expression différentielle pour le séquençage de l'ARN avec limma, EdgeR et DESeq2. Cette méthode bioinformatique permet d'identifier les gènes différentiellement exprimés dans le cholangiocarcinome.

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REMARQUE: Ouvrez le programme R-studio et chargez le fichier R « DEGs.R », le fichier peut être acquis à partir de fichiers / scripts supplémentaires.
1. Téléchargement et prétraitement des données
<ol><li>Téléchargez les données de comptage du séquençage à haut débit (HTSeq) du cholangiocarcinome (CHOL) à partir de l’Atlas du génome du cancer (TCGA). Cette étape peut être facilement réalisée par le code R suivant.<ol>
<li>Cliquez sur Exécuter pour installer les packages R.</li>
		<li>Cliquez sur Exécuter pour charger les packages R. if(!requireNamespace(« BiocManager », quietly=TRUE)) + install.packages(« BiocManager ») BiocManager::install(c(« TCGAbiolinks », « RésuméExperiment »))</li>
		<li>Définissez le répertoire de travail. bibliothèque (TCGAbiolinks) bibliothèque(RésuméExpériment) setwd(« C:/Users/LIUSHIYI/Desktop »)</li>
		<li>Choisissez le type de cancer. cancer <- « TCGA-CHOL »</li>
		<li>Exécutez le code R à partir du fichier « GDCquery.R » pour télécharger les données. Le fichier « GDCquery.R » peut être acquis à partir de fichiers/scripts supplémentaires : source(« Fichiers supplémentaires/Scripts/GDCquery.R ») tête(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 N° #ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 N° #ENSG00000000419 1254 N° #ENSG00000000457 699 N° #ENSG00000000460 239 N° #ENSG00000000938 334 REMARQUE: Après l’exécution, les données de comptage CHOLHTSeq seront téléchargées et nommées « cnt », où les lignes représentent les ID de gènes d’ensemble et les colonnes représentent les ID d’échantillon. Veuillez noter les numéros aux positions 14 à 15 dans les exemples d’identification; des nombres allant de 01 à 09 indiquent des tumeurs et allant de 10 à 19 indiquent des tissus normaux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convertissez les ID de gènes d’ensemble en symboles de gènes.<ol>
<li>Importez le fichier d’annotation dans R en fonction de son chemin de stockage. Le fichier d’annotation (gencode.v22.annotation.gtf) peut être acquis à partir de fichiers supplémentaires. gtf_v22 <- rtracklayer::import('Fichiers supplémentaires/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>Exécutez le code R à partir de la gtf_v22. R », qui peut être acquis à partir de fichiers/scripts supplémentaires : source(« Fichiers supplémentaires/Scripts/gtf_v22. R")</li>
		<li>Appliquez la fonction « ann » pour convertir les ID de gènes d’ensemble en symboles de gènes. cnt=ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrage des gènes faiblement exprimés<ol>
<li>Cliquez sur Exécuter pour installer le package R « edgeR ». BiocManager::install(« edgeR »)</li>
		<li>Cliquez sur Exécuter pour charger le package R « edgeR ». bibliothèque(edgeR)</li>
		<li>Exécutez le code R suivant pour conserver les gènes dont les valeurs de nombre par million (CPM) sont supérieures à un sur au moins deux échantillons. conserver <- rowSums(cpm(cnt)>1)>=2 cnt <- as.matrix(cnt[keep,]) REMARQUE : La valeur du nombre par million (CPM) est utilisée à la place du nombre de lectures pour éliminer l’écart causé par différentes profondeurs de séquençage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Analyse de l’expression différentielle par « limma »
<ol><li>Cliquez sur Exécuter pour installer le package R « limma ». BiocManager::install(« limma »)</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour charger les paquets R « limma », « edgeR ». bibliothèque(limma) bibliothèque(edgeR)</li>
	<li>Exécutez le code R suivant pour créer la matrice de conception. groupe <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information groupe [groupe %in% « 01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue groupe [groupe %in% « 11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue groupe <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>Créez la matrice de conception. design <- model.matrix (~groupe) rownames(design) <- colnames(cnt)</li>
		<li>Créez l’objet DGEList. dge <- DGEList(counts = cnt, group = group)</li>
		<li>Normalisez les données. dge <- calcNormFactors(dge, méthode = « TMM »)</li>
		<li>Exécutez le code R suivant pour effectuer l’analyse d’expression différentielle basée sur la méthode limma-trend. dge ##An objet de la classe « DGEList » ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 N° #TSPAN6 4262 N° #DPM1 1254 N° #SCYL3 699 N° #C1orf112 239 ##FGR 334</li>
		<li>Calculez la valeur CPM. logdge <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>Cliquez sur Exécuter pour ajuster un modèle linéaire afin de prédire les données ou de déduire la relation entre les variables. fit <- lmFit (logdge, design)</li>
		<li>Calculez la valeur T, la valeur F et les cotes logarithmées en fonction du bayésien. fit <- eBayes(fit, trend=TRUE)</li>
		<li>Extrayez la table des résultats. res_limma<- as.data.frame(topTable(fit,n=Inf)) tête(s) res_limma) ## logFC AveExpr t P.Value adj. P.Val B ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The résultat de l’analyse de l’expression différentielle est enregistré dans « res_limma », qui comprend l’id du gène, la valeur de changement de pli log2 (logFC), le niveau d’expression log2 moyen du gène dans l’expérience (AveExpr), la statistique t modifiée (t), la valeur p relavent (P.Value), la valeur p corrigée du taux de fausse découverte (FDR) (adj. P.Val) et les log-cotes des gènes exprimés différentiellement (B) REMARQUE: La fonction « calcNormFactors() » de « edgeR » a été utilisée pour normaliser les données afin d’éliminer l’influence causée par la préparation de l’échantillon ou la construction et le séquençage de la bibliothèque. Dans la construction de la matrice de conception, il est nécessaire de faire correspondre la conception expérimentale (par exemple, type de tissu: tissus normaux ou tumoraux) aux D’échantillon de la matrice. limma-trend convient aux données dont la profondeur de séquençage est la même, tandis que limma-voom convient : (i) lorsque la taille de la bibliothèque d’échantillons est différente ; ii) les données non normalisées par TMM; (iii) il y a beaucoup de « bruit » dans les données. Un logFC positif signifie que le gène est régulé à la hausse dans l’expérience, tandis que le nombre négatif signifie que le gène est régulé à la baisse.</li>
		<li>Identifiez les DEG. res_limma$sig <- as.factor( ifelse(res_limma$adj. P.Val < 0,05 & abs(res_limma$logFC) > 2, ifelse(res_limma$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) # La valeur adj.p < 0,05 et la |log2FC| >= 2 sont des seuils pour identifier les DEG résumé(res_limma$sig) ##down pas en place ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>Sortie de la table de résultats dans un fichier. write.csv(res_limma, fichier = 'result_limma.csv')</li>
		<li>Cliquez sur Exécuter pour installer le package R « ggplot2 ». install.packages(« ggplot2 »)</li>
		<li>Cliquez sur Exécuter pour charger le package R « ggplot2 ». bibliothèque(ggplot2)</li>
		<li>Exécutez le code R à partir du « volcano. R » pour créer la parcelle du volcan. Le fichier « volcan. R » peut être acquis à partir de fichiers supplémentaires. source(« Fichiers supplémentaires/Scripts/volcan. R") volcano(res_limma,"logFC »,"adj. P.Val »,2,0,05) REMARQUE: Les gènes peuvent être mappés à différentes positions en fonction de leurs valeurs log2FC et adj-p, les DEG régulés vers le haut sont colorés en rouge et les DEG régulés vers le bas sont colorés en vert.</li>
		<li>Cliquez sur Exporter pour enregistrer le tracé du volcan. REMARQUE: Les tracés de volcan peuvent être générés et téléchargés dans différents formats (par exemple, pdf, TIFF, PNG, format JPEG). Les gènes peuvent être mappés à différentes positions en fonction de leurs valeurs log2FC et adj p, les DEG régulés à la hausse (log2FC > 2, adj p < 0,05) sont colorés en rouge, et les DEG régulés à la baisse (log2FC < -2, adj p < 0,05) sont colorés en vert, les non-DEG sont colorés en gris.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse de l’expression différentielle par « edgeR »
<ol><li>Cliquez sur Exécuter pour charger le package R « edgeR ». bibliothèque(edgeR)</li>
	<li>Exécutez le code R suivant pour créer une matrice de conception. groupe <-substring(colnames(cnt),14,15) groupe [groupe %in% « 01"] <- « Cancer » groupe [groupe %in% « 11"] <- « Normal » groupe=facteur(groupe, niveaux = c(« Normal »,"Cancer »)) conception <-model.matrix(~group) rownames(design) = colnames(cnt)</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour créer l’objet DGEList. dge <- DGEList(counts=cnt)</li>
	<li>Normalisez les données. dge <- calcNormFactors(dge, méthode = « TMM »)</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour estimer la dispersion des valeurs d’expression des gènes. dge <- estimationDisp(dge, conception, robuste = T)</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour ajuster le modèle afin de compter les données. fit <- glmQLFit(dge, design)</li>
	<li>Effectuez un test statistique. fit <- glmQLFTest(fit)</li>
	<li>Extrayez la table des résultats. Le résultat est enregistré dans « res_edgeR », qui comprend la valeur de changement de pli de journal, le CPM de journal, la valeur F, p et la valeur p corrigée FDR. res_edgeR=as.data.frame(topTags(fit, n=Inf)) tête(s) res_edgeR) ## logFC logCPM F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The résultat est enregistré dans « res_edgeR », qui inclut la valeur de changement de pli de journal (logFC), le CPM de journal, la valeur F, p et la valeur p corrigée FDR</li>
	<li>Identifiez les DEG. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2, ifelse(res_edgeR$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) résumé(res_edgeR$sig) ##down pas en place ##1578 15965 3121</li>
	<li>Sortie de la table de résultats dans un fichier. write.csv(res_edgeR, fichier = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>Créez le tracé du volcan. volcan(res_edgeR,"logFC »,"FDR »,2,0.05)</li>
	<li>Cliquez sur Exporter pour enregistrer le tracé du volcan.</li>
</ol>4. Analyse de l’expression différentielle via « DESeq2 »
<ol><li>Cliquez sur Exécuter pour installer les packages R « DESeq2 ». BiocManager::install(« DESeq2 »)</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour charger les packages R « DESeq2 ». bibliothèque(DESeq2)</li>
	<li>Exécutez le code R suivant pour déterminer le facteur de regroupement. groupe <-substring(colnames(cnt),14,15) groupe [groupe %in% « 01"] <- « Cancer » groupe [groupe %in% « 11"] <- « Normal » groupe=facteur(groupe, niveaux = c(« Normal »,"Cancer »))</li>
	<li>Créez l’objet DESeqDataSet. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(group), design = ~group) Dds ##class : DESeqDataSet ##dim : 20664 45 ##metadata(1) : version ##assays(1) : comptes ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData noms(0) : ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData noms(1) : groupe</li>
	<li>Effectuez l’analyse. dds <- DESeq(dds)</li>
	<li>Générez la table des résultats. res_DESeq2 <- data.frame(résultats(dds)) tête(s) res_DESeq2) ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 REMARQUE: Le résultat est enregistré dans « res_DESeq2 », qui comprend la moyenne du nombre de lecture normalisé (baseMean), la valeur de changement de pli de journal (log2FoldChange), l’erreur type de changement de pli de journal (lfcSE), la statistique de Wald (stat), la valeur p d’origine (pvalue) et la valeur p corrigée (padj)</li>
	<li>Identifiez les DEG. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs(res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2 ,'up','down'),'not')) résumé(res_DESeq2$sig) ##down pas en place ##1616 16110 2938</li>
	<li>Sortie de la table de résultats dans un fichier. write.csv(res_DESeq2, fichier = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>Créez le tracé du volcan. volcano(res_DESeq2,"log2FoldChange »,"padj »,2,0.05)</li>
	<li>Cliquez sur Exporter pour enregistrer le tracé du volcan.</li>
</ol>5. Diagramme de Venn
<ol><li>Cliquez sur Exécuter pour installer le package R « VennDiagram ». install.packages(« VennDiagram »)</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour charger le package R « VennDiagram ». bibliothèque (VennDiagram)</li>
	<li>Faites un diagramme de Venn des DEG régulés. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="up »,]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up »,]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== « haut »,])), NULL,hauteur = 3,largeur = 3,unités = « dans », col="black »,lwd=0,3,fill=c(« #FF6666 »,"#FFFF00 », "#993366"), alpha=c(0,5, 0,5, 0,5),main = « DEG régulés à la hausse »))</li>
	<li>Cliquez sur Exporter pour enregistrer le diagramme de Venn.</li>
	<li>Faites un diagramme de Venn des DEG régulés vers le bas. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="down »,]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig== « vers le bas »,]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="down »,])), NULL,hauteur = 3,largeur = 3,unités = « dans », col="black »,lwd=0,3,fill=c(« #FF6666 »,"#FFFF00 », "#993366"), alpha=c(0,5, 0,5, 0,5),main = « DEG régulés à la baisse »))</li>
	<li>Cliquez sur Exporter pour enregistrer le diagramme de Venn.</li>
</ol>

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<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
</ol>

Le manuscrit n’a jamais été publié auparavant et n’est pas envisagé pour publication ailleurs. Tous les auteurs ont contribué à la création de ce manuscrit pour un contenu intellectuel important et ont lu et approuvé le manuscrit final. Nous déclarons qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Les transcriptions aberrate abondantes dans les cancers peuvent être facilement identifiées par l’analyse différentielle ARN-seq5. Cependant, l’application de l’analyse de l’expression différentielle ARN-seq est souvent limitée car elle nécessite certaines compétences avec le langage R et la capacité de choisir des méthodes appropriées. Pour résoudre ce problème, nous fournissons une introduction détaillée aux trois méthodes les plus connues (limma, EdgeR et DESeq2) et des tutoriels pour appliquer...

Le séquençage de l’ARN (séquençage de l’ARN) est l’une des technologies les plus largement utilisées en transcriptomique avec de nombreux avantages (par exemple, une reproductibilité élevée des données), et a considérablement augmenté notre compréhension des fonctions et de la dynamique des processus biologiques complexes1,2. L’identification des transcriptions d’aberrate dans différents contextes biologiques, également connus sous le nom de gènes exprimés différentiellement (DEG), est une étape clé de l’analyse de l’ARN.seq. RNA-seq permet d’obtenir une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et des fonctions biologiques liés à la pathogenèse. Par conséquent, l’analyse différentielle a été considérée comme précieuse pour le diagnostic, le pronostic et la thérapeutique des tumeurs3,4,5. Actuellement, d’autres progiciels R/Bioconductor open source ont été développés pour l’analyse de l’expression différentielle ARN-seq, en particulier limma, DESeq2 et EdgeR1,6,7. Cependant, l’analyse différentielle nécessite certaines compétences avec le langage R et la capacité de choisir la méthode appropriée, ce qui fait défaut dans le programme d’études médicales.
Dans ce protocole, basé sur les données de comptage de l’ARN-seq du cholangiocarcinome (CHOL) extraites de l’Atlas du génome du cancer (TCGA), trois des méthodes les plus connues (limma8,EdgeR9 et DESeq210)ont été réalisées, respectivement, par le programme R11 pour identifier les DEG entre le CHOL et les tissus normaux. Les trois protocoles limma, EdgeR et DESeq2 sont similaires mais ont des étapes différentes parmi les processus de l’analyse. Par exemple, les données normalisées de comptage ARN-seq sont nécessaires pour EdgeR et limma8,9, tandis que DESeq2 utilise ses propres divergences de bibliothèque pour corriger les données au lieu de la normalisation10. En outre, edgeR est spécifiquement adapté aux données de type ARN-seq, tandis que le limma est utilisé pour les microréseaux et les références d’ARN. Un modèle linéaire est adopté par limma pour évaluer les DEG12, tandis que les statistiques dans edgeR sont basées sur les distributions binomiales négatives, y compris l’estimation empirique de Bayes, les tests exacts, les modèles linéaires généralisés et les tests de quasi-vraisemblance9.
En résumé, nous fournissons les protocoles détaillés de l’analyse de l’expression différentielle ARN-seq en utilisant limma, DESeq2 et EdgeR, respectivement. En se référant à cet article, les utilisateurs peuvent facilement effectuer l’analyse différentielle ARN-seq et choisir les méthodes d’analyse différentielle appropriées pour leurs données.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>version 3.6.2</td><td>logiciel gratuit</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>logiciel gratuit</td></tr></tbody></table>

trois méthodes d’analyse d’expression différentielle pour le séquençage de l’arn : limma, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Le séquençage de l’ARN (RNA-seq) est l’une des technologies les plus largement utilisées en transcriptomique car il peut révéler la relation entre l’altération génétique et les processus biologiques complexes et a une grande valeur dans le diagnostic, le pronostic et la thérapeutique des tumeurs. L’analyse différentielle des données ARN-seq est cruciale pour identifier les transcriptions aberrantes, et limma, EdgeR et DESeq2 sont des outils efficaces pour l’analyse différentielle. Cependant, l’analyse différentielle ARN-seq nécessite certaines compétences avec le langage R et la capacité de choisir une méthode appropriée, ce qui fait défaut dans le programme d’enseignement médical.
Ici, nous fournissons le protocole détaillé pour identifier les gènes exprimés différentiellement (DEG) entre le cholangiocarcinome (CHOL) et les tissus normaux à travers limma, DESeq2 et EdgeR, respectivement, et les résultats sont présentés dans des diagrammes de volcan et des diagrammes de Venn. Les trois protocoles limma, DESeq2 et EdgeR sont similaires mais ont des étapes différentes parmi les processus de l’analyse. Par exemple, un modèle linéaire est utilisé pour les statistiques en limma, tandis que la distribution binomiale négative est utilisée dans edgeR et DESeq2. De plus, les données normalisées de comptage ARN-seq sont nécessaires pour EdgeR et limma, mais ne sont pas nécessaires pour DESeq2.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour trois méthodes d’analyse différentielle: limma, EdgeR et DESeq2. Les résultats des trois méthodes se chevauchent en partie. Les trois méthodes ont leurs propres avantages, et le choix de la méthode ne dépend que des données.

Il existe différentes approches pour visualiser le résultat de l’analyse de l’expression différentielle, parmi lesquelles le diagramme du volcan et le diagramme de Venn sont particulièrement utilisés. limma a identifié 3323 DEG entre le CHOL et les tissus normaux avec les |logFC|≥2 et adj. P.Val &lt;0,05 comme seuils, parmi lesquels 1880 ont été régulés à la baisse dans les tissus CHOL et 1443 ont été régulés à la hausse(Figure 1a). Pendant ce temps, edgeR a identifié les 1578 DEG à régulati...

Un protocole détaillé des méthodes d’analyse de l’expression différentielle pour le séquençage de l’ARN a été fourni : limma, EdgeR, DESeq2.

Trois méthodes d’analyse d’expression différentielle pour le séquençage de l’ARN : limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

Trois méthodes d’analyse d’expression différentielle pour le séquençage de l’ARN : limma, EdgeR et DESeq2. Ouvrez le programme RStudio, puis chargez le fichier R, DEGs. Le fichier peut être acquis à partir de fichiers supplémentaires. Un.Téléchargement et prétraitement des données.1.1. Téléchargez les données de séquençage à haut débit du cholangiocarcinome à partir de l’Atlas du génome du cancer. Cet onglet peut facilement être réalisé par le code suivant.Cliquez sur Exécuter pour installer le package R. Cliquez sur Exécuter pour charger le package R. Définissez le répertoire de travail.Choisissez le type de cancer. Exécutez le code R à partir du fichier GDCquery pour télécharger les données. Le fichier GDCquery peut être acquis à partir de fichiers/scripts supplémentaires.Après l’exécution, les données de comptage du séquençage de l’ARN du cholangiocarcinome peuvent être téléchargées et nommées CNT, où les lignes représentent les ID de gènes d’ensemble et les colonnes représentent les ID de symboles. Veuillez noter les chiffres aux positions 14 à 15 dans les ID des symboles. Les nombres vont de 01 à 09 indiquent des tumeurs et 10 à 19 indiquent des tissus normaux.1.2.Conversation entre les ID de gènes d’ensemble et les symboles de gènes. Importez le fichier d’annotation dans R, en fonction de son chemin de stockage. Le fichier d’annotation peut être acquis à partir de fichiers supplémentaires.Exécutez le code R à partir du fichier gtf v22. Qui peuvent être acquis à partir de fichiers / scripts supplémentaires. Appliquer la fonction inn et convertir les ID de gènes d’ensemble en symboles de gènes.1.3.Filtrer les gènes faiblement exprimés. Cliquez sur Exécuter pour installer le package edgeR"Cliquez sur Exécuter pour charger le package R edgeR"Exécutez le code R suivant pour conserver les gènes dont le nombre par million de valeurs est supérieur à un sur au moins deux échantillons. Deux. Analyse d’expression différentielle via limma"Cliquez sur Exécuter pour installer le package R limma"Cliquez sur Exécuter pour charger le package R limma"edgeR"Exécutez le code R suivant pour créer une matrice de conception.Extraire les informations de groupe. Réglez 01 « comme tissu tumoral. Réglez 11 « comme tissu normal.Créez une matrice de conception. Créez l’objet DGEList. Normalisez les données.Exécutez le code R suivant pour effectuer l’analyse d’expression différentielle basée sur la méthode limma-trend. Calculez la valeur CPM. Cliquez sur Exécuter pour ajuster un modèle linéaire afin de prédire les données ou de déduire la relation entre les variables.Calculez la valeur T, la valeur F et les cotes logarithmées en fonction du bayésien. Extrayez le tableau des résultats. Les résultats de l’analyse d’expression différentielle sont enregistrés dans res_limma » qui inclut la valeur de changement de pli log2.Niveau d’expression log2 moyen du gène dans l’expérience. La statistique T modifiée, la valeur P, la fausse valeur p corrigée du taux de découverte et les cotes logarithmées des gènes exprimés différentiellement. Identifier les gènes exprimés différemment.Ainsi, la valeur P ajustée inférieure à 0,05 et la valeur absolue du faux changement logarithmaire supérieur ou égal à deux sont des seuils pour filtrer les gènes exprimés différemment. Les résultats res limma montrent qu’en comparaison avec les tissus normaux, 1 443 gènes sont régulés à la hausse et 1 880 gènes sont régulés à la baisse dans les tissus du cholangiocarcinome. Sortie de la table de résultats dans un fichier.Cliquez sur Exécuter pour installer le package R ggplot2"Cliquez sur Exécuter pour charger le package R ggplot2"Exécutez le code R à partir du fichier volcano pour créer le tracé volcano et le fichier volcano peut être acquis à partir de fichiers supplémentaires. Les gènes peuvent être mappés à différentes positions en fonction de leur changement de pli log2 et des valeurs P ajustées. Ainsi, les gènes exprimés différentiellement régulés à la hausse sont colorés en rouge.et les gènes exprimés différentiellement régulés à la baisse sont colorés en vert. Cliquez sur exporter pour enregistrer le tracé du volcan. Trois. Analyse d’expression différentielle via edgeR"Cliquez sur Exécuter pour charger le package R edgeR"Exécutez le code R suivant pour créer une matrice de conception.Cliquez sur Exécuter pour créer l’objet DGEList et normaliser les données. Cliquez sur Exécuter pour estimer la dispersion de la valeur d’expression des gènes. Cliquez sur Exécuter pour ajuster le modèle afin de compter les données.Effectuer un test statistique. Extrayez la table des résultats. Le résultat est enregistré dans res edgeR"qui inclut la valeur de changement de pli de journal, logCPM, F, valeur p et la valeur p corrigée du taux de fausse découverte.Identifier les gènes exprimés différemment. Le résultat res edgeR"montre qu’en comparaison avec les tissus normaux, 3 121 gènes sont régulés à la hausse et 1 578 gènes sont régulés à la baisse dans les tissus du cholangiocarcinome. Sortie de la table de résultats dans un fichier.Créez le tracé du volcan. Cliquez sur Exporter pour enregistrer le tracé du volcan. Quatre. Analyse de l’expression différentielle via DESeq2.Cliquez sur Exécuter pour installer le package R DESeq2"Cliquez sur Exécuter pour charger le package R DESeq2"Exécutez le code R suivant pour déterminer le facteur de tâtonnement. Créez l’objet d’ensemble de données DESeq2. Effectuer une analyse.Générez la table des résultats. Le résultat est enregistré dans la res DESeq2, qui comprend la moyenne du nombre de lectures normalisées, la valeur de changement de pli de journal, la flèche standard de changement de pli de log, la statistique de soudure, la valeur P d’origine et la valeur P corrigée. Identifiez les DEG.Le résultat de DESeq2 montre qu’en comparaison avec les tissus normaux, deux mille neuf cent trente-huit gènes sont régulés à la hausse, et mille six cent seize gènes sont régulés à la baisse dans les tissus du cholangiocarcinome. Sortie de la table de résultats dans un fichier. Créez le tracé du volcan.Cliquez sur Exporter pour enregistrer le tracé du volcan. Cinq. Diagramme de Venn. Cliquez sur Exécuter pour installer le diagramme venn du package R.Cliquez sur Exécuter pour charger le diagramme venn du package R. Faites un diagramme de Venn des gènes exprimés différentiellement régulés à la hausse. Cliquez sur exporter pour enregistrer le diagramme de van, Créer un diagramme de Venn des gènes exprimés différentiellement régulés à la baisse.Cliquez sur Exporter pour enregistrer le diagramme de Venn. Six. Résultats représentatifs. La première figure montre les diagrammes volcaniques de tous les gènes acquis par limma, edgeR et DESeq2.La valeur p du log négatif est tracée par rapport au changement de pli du journal. Les points rouges représentent les gènes exprimés différentiellement régulés vers le haut, et les points verts représentent les gènes exprimés différentiellement régulés vers le bas. Limma identifie les mille huit cent quatre-vingts gènes exprimés différentiellement à la baisse, et les mille quatre cent quarante-trois gènes exprimés différentiellement régulés à la hausse dans les tissus du cholangiocarcinome.EdgeR identifie les mille cinq cent soixante-dix-huit gènes exprimés différentiellement régulés à la baisse, et trois mille cent vingt et un gènes exprimés différentiellement régulés à la hausse. DESeq2 identifie mille six cent seize gènes exprimés différentiellement régulés à la baisse, et deux mille neuf cent trente huit gènes exprimés différentiellement régulés à la hausse. Figure deux, les diagrammes de Venn montrent le chevauchement entre les résultats divisés entre limma edgeR et DESeq2.Comparez les résultats de ces trois méthodes, mille quatre cent trente et un gènes exprimés différentiellement régulés à la hausse, et mille cinq cent trente et un gènes exprimés différentiellement régulés à la baisse se chevauchent. Dans ce protocole, nous avons fourni ici un protocole détaillé de différents types d’analyse de mesure pour une séquence élevée de données de comptage en utilisant des packages R, limma, edgeR et DESeq2. Trois méthodes ont des méthodes similaires et des membres du personnel dans leur processus d’analyse.Et puis leurs trois médicaments se chevauchent en partie. Les trois médicaments ont leurs propres avantages. Et le choix dépend simplement de l’heure de vos données.S’il y a mes données actuelles, limma devrait être donné en priorité, mais les données de séquençage de génération, dans edgeR, et DESeq2 sont préférables.

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