Name: Minimiser les saignements de veines portes post-perfusion pendant la transplantation intrahépatique d’îlots chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Découvrez des techniques chirurgicales affinées pour la transplantation intraportale d'îlots chez la souris. Ces méthodes préviennent efficacement les décès liés aux saignements et améliorent la sécurité de la procédure pour la recherche sur le foie.

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Cette étude a été soutenue par le ministère des Anciens Combattants (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) et le National Institute of Health accorde les subventions # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, à HW. Nous tenons à vous remercier, M. Michael Lee et Mme Lindsay Swaby, pour l’édition linguistique

Toutes les procédures ont été menées avec l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud et du Ralph H Johnson Medical Center à Charleston.
1. Induction du diabète à l’aide de la streptozotocine (STZ)
<ol><li>Préparation des souris receveuses:<ol>
<li>Pesez toutes les souris individuellement.</li>
		<li>Vérifiez la glycémie à partir d’un échantillon de sang de la veine caudale à l’aide d’un glucomètre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détermination de la dose de STZ pour trois scénarios différents :<ol>
<li>Pour les souris atteintes de stéatose hépatique, injecter une dose de STZ [40 mg/kg/jour, injection intrapéritonéale (i.p.)] pendant 5 jours consécutifs.</li>
		<li>Pour les souris NOD-SCID, injecter 125 mg / kg de STZ, injection unique, i.p. après jeûne de nuit.</li>
		<li>Pour les souris C57BL/6, injecter 225 mg/kg de STZ, injection unique, i.p.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculs pour STZ (13,5 mg/mL) : REMARQUE: Ce calcul est pour cinq souris C57BL / 6 avec un poids corporel de 30 g:<ol>
<li>Poids corporel total : 5 souris x 30 g/souris = 150g</li>
		<li>STZ nécessaire : 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation STZ:<ol>
<li>Peser le STZ après la dose précalculée.</li>
		<li>Transférer la poudre STZ pesée dans un bécher de 10 ml sur de la glace.</li>
		<li>Ajouter 3 mL de solution de citrate de sodium dans le bécher pour dissoudre le STZ.</li>
		<li>Bien mélanger, filtrer stériliser à travers un pore de 0,22 μm et utiliser la solution STZ dans les 10 minutes suivant la préparation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injection de STZ :<ol>
<li>Chargez la quantité souhaitée de solution STZ (suffisante pour une souris) dans une seringue de 1 mL.</li>
		<li>Effectuer une injection intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen de la souris.</li>
		<li>Observez les souris pendant 5 minutes après l’injection et vérifiez tout signe d’inconfort pendant cette période avant de les remettre dans les cages.</li>
		<li>Surveiller le taux de glucose sanguin à partir d’un échantillon de sang de la veine caudale à l’aide d’un glucomètre tous les jours après l’injection de STZ. REMARQUE: Dans cette expérience, les souris sont considérées comme diabétiques lorsque la glycémie non à jeun est > 350 mg / dL pendant deux jours consécutifs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation des îlots
REMARQUE : Les îlots humains ont été cultivés dans des milieux CMRL-1066 complétés par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à une densité de 10 000 équivalents îlots (QEI) par boîte de culture cellulaire de 100 mm9. Des îlots de souris ont été cultivés en DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de P/S avec la même densité13. Des souris mâles NOD-SCID et C57BL/7 âgées de 6 à 10 semaines ont été obtenues à partir de sources commerciales.
<ol><li>Détacher les îlots cultivés de la boîte de culture cellulaire en les grattant doucement.</li>
	<li>Choisissez à la main le nombre souhaité d’îlots (p. ex., 300 à 350 îlots) à l’aide d’une seringue de 1 cc et placez-les dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL sur de la glace.</li>
	<li>Faites tourner le tube pendant 10 secondes à l’aide de la microcentrifugeuse.</li>
	<li>Retirez le surnageant, en laissant un peu de liquide pour éviter de perdre la pastille.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille dans 200 μL de HBSS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA).</li>
	<li>Aspirer les îlots remis en suspension dans une seringue à insuline de 0,5 mL.</li>
	<li>Placez la seringue en position verticale. Laissez les îlots couler pendant 1 min.</li>
	<li>Poussez la seringue pour enlever toutes les bulles, laissant environ 100-150 μL d’îlots contenant du liquide.</li>
	<li>Placez la tête de la seringue vers le bas et tapotez doucement le côté de la seringue pour laisser les îlots se répartir également dans tout le liquide. Les îlots sont maintenant prêts à être injectés.</li>
</ol>3. Transplantation d’îlots
<ol><li>Induire et maintenir la souris sous anesthésie générale avec 2% d’isoflurane. Vérifiez l’absence de réflexes de pédale pour assurer une bonne anesthésie de l’animal.</li>
	<li>Rasez et retirez la fourrure dans la région de l’abdomen de la souris.</li>
	<li>Administrer une dose préopératoire unique de buprénorphine (0,1 mg/kg d’AP).</li>
	<li>Désinfectez la zone chirurgicale avec trois lingettes alternées de 2% d’iode et 75% d’alcool.</li>
	<li>Effectuez une laparotomie avec des micro-ciseaux pour générer une incision de 1 à 1,5 cm.</li>
	<li>Ouvrez la cavité péritonéale avec un rétracteur. Suivez avec la méthode A ou la méthode B comme détaillé ci-dessous.</li>
</ol>4. Méthode A: (arrêter le saignement avec de la mousse de gel, Figure 1A)14,15,16
<ol><li>Préparation de la souris<ol>
<li>Placez une gaze stérile autour de l’incision.</li>
		<li>Retirez doucement l’intestin à l’aide d’une pince et maintenez-le sur la gaze.</li>
		<li>Identifiez la veine porte par son emplacement et exposez-la bien.</li>
		<li>Couvrez l’intestin avec une gaze chaude saline humide pendant toute la chirurgie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insérez l’aiguille de la seringue à insuline préchargée par îlot dans la veine porte près du duodénum (Figure 1B). Pour ce faire, tenez l’aiguille avec le trou (biseau) vers le bas et positionnez l’angle de la surface d’ouverture parallèlement à la paroi de la veine porte avant de pénétrer à travers le mur.<ol>
<li>Tirez sur le piston pour prélever du sang (20-50 μL) dans la seringue pour mélanger les îlots en premier.</li>
		<li>Infuser lentement les îlots dans la veine porte tout en tirant et en poussant le plongeon à plusieurs reprises.</li>
		<li>Placez un morceau de mousse de gel (environ 0,5 cm x 0,5 cm) pour couvrir le site d’injection.</li>
		<li>Appuyez sur la mousse de gel avec une pointe en coton tout en retirant l’aiguille de la veine porte.</li>
		<li>Continuez à appuyer sur le gel pendant environ 2 minutes pour confirmer qu’il n’y a pas de saignement actif.</li>
		<li>Retournez la bascule en coton sur et éloignez-vous de la mousse de gel pour vous assurer que la mousse de gel recouvre bien la veine porte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Méthode B: (arrêter le saignement avec un coussinet adipeux, Figure 1C)17
<ol><li>Exposez soigneusement la veine porte.<ol>
<li>Utilisez deux embouts en coton pour maintenir la veine porte exposée des côtés gauche et droit.</li>
		<li>Identifiez le coussinet de tissu adipeux entre le duodénum et la veine porte.</li>
		<li>Pénètrez à travers le coussinet adipeux avant d’insérer l’aiguille dans la veine porte (Figure 1D).</li>
		<li>Infuser les îlots, en suivant la procédure similaire décrite ci-dessus dans les parties 4.2.1 et 4.2.2 de la méthode A.</li>
		<li>Retirez l’aiguille tout en appuyant sur la graisse avec une pointe en coton.</li>
		<li>Continuez à appuyer sur le tampon adipeux pendant 1 min après avoir retiré l’aiguille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après avoir confirmé qu’il n’y a pas de saignement de la veine porte, ramenez doucement l’intestin dans la cavité péritonéale dans sa position d’origine.</li>
	<li>Laisser 0,5 mL de solution saline chaude (36-37 °C) dans la cavité abdominale avant la fermeture. REMARQUE: La solution saline chaude facilite le mouvement et la récupération de l’intestin après la chirurgie et prévient la nécrose intestinale.</li>
	<li>Fermez la couche musculaire avec une suture 5-0.</li>
	<li>Fermez la couche de peau avec une suture 4-0.</li>
	<li>Placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement remise de l’anesthésie.</li>
	<li>Continuer à fournir un analgésique (p. ex., buprénorphine 0,1 mg/kg p.i.) toutes les 12 h et de la chaleur supplémentaire pendant 48 h après la chirurgie. REMARQUE: La procédure de transplantation d’îlots prend environ 15-20 minutes à compléter.</li>
</ol>6. Coloration H &E et photographie de la section entière du foie
<ol><li>Perfusion hépatique<ol>
<li>Mettez la souris sous anesthésie comme décrit ci-dessus dans la partie 3.1.</li>
		<li>Exposez soigneusement la veine porte et coupez la veine cave inférieure.</li>
		<li>Perfuser manuellement le foie à l’aide de 20 mL de paraformaldéhyde à 10% via la veine porte pendant environ 5 minutes, à l’aide d’une seringue de 20 mL avec aiguille 25G18. REMARQUE: La perfusion hépatique peut éliminer le sang du tissu hépatique et améliorer la fixation du foie sans perturber les greffes d’îlots.</li>
		<li>Disséquez le foie entier perfusé d’autres organes.</li>
		<li>Fixer le tissu hépatique perfusé dans 10% de paraformaldéhyde pendant 24 h.</li>
		<li>Incorporer le tissu dans la paraffine.</li>
		<li>Coupez des sections de tissu de 5 μm d’épaisseur chacune et placez-les sur une lame de verre pour la coloration.</li>
		<li>Effectuer une coloration H&E, insuline, fibrine et neutrophile polymorphonucléaire (PMN) à l’aide de méthodes standard15,16.</li>
		<li>Scannez toute la section du foie au microscope.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
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<li>Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+islet+xenografts+in+a+concordant+rat-to-mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model.</a> Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+studying+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation.</a> Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
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<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+treatment+with+carbon+monoxide+can+yield+islet+allograft+survival+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance.</a> Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).</li>
<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Dans cette étude, deux procédures améliorées qui peuvent prévenir les saignements et réduire la mortalité des souris pendant l’IIT de la souris ont été démontrées. Cette étude permet aux chercheurs de visualiser le modèle de transplantation d’îlots qui est unique dans l’étude de la réponse inflammatoire médiée par le sang instantané après la transplantation. Le modèle IIT est un modèle distinctif pour l’étude de la survie des cellules des îlots et des lésions ischémiques hépatiques en réponse à la transplantation <sup cl...

La transplantation intraportaire d’îlots (IIT) via la veine porte est la méthode la plus couramment utilisée pour la transplantation d’îlots humains en milieu clinique. Le modèle IIT de souris offre une excellente occasion d’étudier la transplantation d’îlots et de tester des approches interventionnelles prometteuses qui peuvent améliorer l’efficacité de la transplantation d’îlots1. L’IIT a été décrit pour la première fois dans les années 1970 et utilisé par plusieurs groupes1,2,3,4,5. Il a regagné en popularité après la percée dans la transplantation d’îlots humains en 20006,7. Cependant, la plupart des études de transplantation d’îlots ont utilisé la capsule rénale comme site privilégié pour la transplantation expérimentale d’îlots en raison de son succès facile. Au contraire, l’IIT est plus difficile techniquement et moins fréquemment utilisé pour les études de transplantation d’îlots8,9. Contrairement à l’IIT, cependant, les îlots transplantés sous la capsule rénale ne souffrent pas de la réaction inflammatoire immédiate à médiation sanguine caractérisée par une thrombose, une inflammation et une ischémie du tissu hépatique, et ont donc une meilleure fonction que les îlots transplantés dans le foie. Le modèle de capsule rénale peut donc ne pas imiter complètement les contraintes rencontrées par les îlots lors de la transplantation d’îlots humains10,11,12.
L’une des principales complications de l’IIT chez la souris est le saignement du site d’injection après la transplantation, ce qui pourrait causer 10 à 30% de la mortalité chez différentes souches de souris12. Dans cet article, deux approches affinées ont été développées pour arrêter les saignements plus rapidement et en toute sécurité et pour réduire la mortalité des souris après une IIT. La démonstration visuelle de ces détails raffinés aidera les chercheurs à identifier les étapes clés de cette procédure techniquement difficile. En outre, l’emplacement des greffes d’îlots dans le foie du receveur a été déterminé par un examen histologique du tissu hépatique coloré à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) (section entière) portant des îlots transplantés.

<table><tbody><tr><td>10 % Neutral Buffered formalin v/v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringue avec aiguille</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 20 mL</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8" Aiguilles hypodermiques</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Tampons de préparation à l’alcool, stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Anesthésie animale système</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Chlorhydrate de buprénorphine, injection</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Corning</td><td></td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, absolu (200 proof), qualité biologie moléculaire</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Ciseaux de micro dissection extra fins 4" droits pointus</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp ; Glucomètre</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle Bandelettes de test de glycémie</td><td>Abbott</td><td>Lite</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (éponge de gélatine résorbable, USP)</td><td>Pharmacia & Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Pince Graefe 4" pointe extra délicate</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner Porte-aiguille 5.25"</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline avec aiguille de calibre 27</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’iode</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Suture en polypropylène 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Suture en polypropylène 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, solution intraveineuse à 0,9 %</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Streptozocine (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Champ chirurgical, stérile</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de tissus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

minimiser les saignements de veines portes post-perfusion pendant la transplantation intrahépatique d’îlots chez la souris

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Bien que le foie soit actuellement accepté comme site de transplantation primaire pour les îlots humains en milieu clinique, les îlots sont transplantés sous la capsule rénale dans la plupart des études précliniques de transplantation d’îlots de rongeurs. Ce modèle est couramment utilisé parce que la transplantation d’îlots intrahépatiques murins est techniquement difficile et qu’un pourcentage élevé de souris pourraient mourir de complications chirurgicales, en particulier de saignements du site d’injection après la transplantation. Dans cette étude, deux procédures qui peuvent minimiser l’incidence des saignements de la veine porte post-perfusion sont démontrées. La première méthode applique une éponge de gélatine hémostatique résorbable au site d’injection, et la deuxième méthode consiste à pénétrer l’aiguille d’injection d’îlots à travers le tissu adipeux d’abord, puis dans la veine porte en utilisant le tissu adipeux comme barrière physique pour arrêter le saignement. Les deux méthodes pourraient prévenir efficacement la mort de souris induite par les saignements. La section hépatique entière montrant la distribution des îlots et les signes de thrombose des îlots après la transplantation, une caractéristique typique de la transplantation intrahépatique des îlots, a été présentée. Ces protocoles améliorés affinent les procédures de transplantation intrahépatique d’îlots et peuvent aider les laboratoires à mettre en place la procédure pour étudier la survie et la fonction des îlots dans des contextes précliniques.

Nous avons effectué des transplantations d’îlots syngéniques et xénogéniques via la veine porte. La fonction de greffe d’îlot a été observée de manière dose-dépendante dans les deux modèles de transplantation d’îlots. Dans le modèle de transplantation d’îlots syngéniques utilisant des souris C57BL/6, la transplantation de 250 îlots a conduit à une normoglycémie transitoire avant que les souris ne reviennent à l’hyperglycémie. Les souris recevant 500 îlots ont atteint et maintenu la normoglycémie au-delà de 30 jours après...

Nous présentons ici des procédures chirurgicales raffinées sur la réalisation réussie d’une transplantation intraportaire d’îlots, une procédure chirurgicale cliniquement pertinente mais techniquement difficile, chez la souris.

Minimiser les saignements de veines portes post-perfusion pendant la transplantation intrahépatique d’îlots chez la souris

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Le foie est un site principal de transplantation dans le cadre clinique de l’îlot humain. La transplantation d’îlots intrahépatiques de souris est techniquement difficile, et un pourcentage élevé de souris pourraient mourir de complications chirurgicales, en particulier de saignements. Dans cette étude, les deux méthodes que nous avons montrées pouvaient prévenir efficacement la mort de souris induite par les saignements.Notre méthode peut être appliquée à la recherche sur le cancer du foie et d’autres maladies du foie en permettant l’injection de cellules cancéreuses, de cellules souches mésenchymateuses et d’hépatocytes directement dans le foie. Pour commencer, détachez une culture d’îlots humains avec un grattage doux. Utilisez une seringue de 1 centimètre cube pour ramasser 300 à 350 îlots dans des tubes stériles de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur de la glace.Lorsque tous les îlots ont été prélevés, centrifugez les tubes pendant 10 secondes pour sédimenter les cellules. Jetez tout sauf un petit volume de surnageant pour éviter la perte de granulés et remettez en suspension les îlots dans 200 microlitres HBSS contenant 5% de BSA. Chargez les îlots remis en suspension dans une seringue à insuline de 5 millilitres et tournez l’aiguille de la seringue pendant 1 minute pour laisser les îlots se déposer au niveau du piston.Appuyez sur le piston pour éliminer les bulles, en gardant environ 100 à 150 microlitres de solution dans la seringue et inversez la seringue en tapotant doucement pour répartir uniformément les îlots. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, appliquez une pommade sur les yeux pour éviter le dessèchement. Rasez l’abdomen de la souris anesthésiée pour enlever la fourrure et désinfectez la zone chirurgicale avec trois lingettes alternées de 2% d’iode et 75% d’alcool.Ensuite, faites une incision de 1 à 1,5 centimètre dans l’abdomen et ouvrez la cavité péritonéale. Placez un morceau de gaze stérile autour de l’incision et utilisez des pinces ou des pointes de coton pour transférer doucement l’intestin sur la gaze. Ils recouvrent ensuite l’intestin d’un morceau de gaze imbibée de solution saline et exposent la veine porte.Pour arrêter les saignements induits par le transfert d’îlots à l’aide de mousse de gel, tenez l’aiguille avec le biseau tourné vers le bas et positionnez la pointe de l’aiguille avec l’ouverture parallèle à la paroi de la veine porte avant d’insérer l’aiguille dans la veine porte. Rétractez le piston pour aspirer 20 à 50 microlitres de sang dans la seringue pour le mélanger avec les îlots avant d’infuser les îlots dans la veine porte tout en appuyant et en rétractant à plusieurs reprises le piston. Lorsque tous les îlots ont été livrés, placez un morceau de mousse de gel d’environ 5 x 5 centimètres sur le site d’injection.Utilisez une pointe en coton pour presser la mousse de gel vers le bas tout en retirant l’aiguille de la veine porte. Maintenez le gel en place pendant environ 2 minutes, en roulant la mousse de gel pour vous assurer qu’elle recouvre la veine porte. Une fois le saignement arrêté, ramenez doucement l’intestin dans la cavité péritonéale dans la position d’origine et injectez 500 microlitres de solution saline chaude dans la cavité abdominale.Utilisez des sutures pour fermer les couches musculaires et cutanées. Ensuite, placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à récupération complète de l’anesthésie, en administrant une analgésie toutes les 12 heures et en chauffant pendant 48 heures. Pour arrêter les saignements induits par le transfert d’îlots à l’aide d’un coussinet adipeux, après avoir exposé la veine porte comme démontré, utilisez deux pointes de coton pour maintenir la veine exposée sur les côtés gauche et droit et localiser le coussinet de tissu adipeux entre le duodénum et la veine porte.Pénètrez dans le coussinet adipeux avec la pointe de l’aiguille avant de l’insérer dans la veine porte. Infuser les îlots dans la veine porte comme démontré. Lorsque tous les îlots ont été livrés, appuyez sur le tissu adipeux avec une pointe en coton pendant environ 1 minute tout en retirant l’aiguille de la veine.Ensuite, retournez l’intestin dans la cavité abdominale et effectuez le reste des procédures de soins postchirurgicaux comme démontré. Les effets de la transplantation d’îlots dépendent de la dose, car une glycémie normale est observée 30 jours après la transplantation d’îlots syngéniques lorsque 500 îlots sont transférés, mais seule une normoglycémie transitoire est observée lorsque 250 îlots sont livrés, les souris revenant à l’hyperglycémie 10 jours après la greffe. Une augmentation du poids corporel est observée dans les deux groupes et des réponses identiques sont observées lorsque des îlots humains sont transplantés dans des souris NOD-SCID diabétiques, avec une normoglycémie observée lorsqu’un plus grand nombre d’équivalents d’îlots sont transplantés, mais pas un nombre plus petit.La majorité des souris qui ont des saignements après le transfert meurent après la chirurgie, tandis que les souris sans saignement survivent. 28 jours après la transplantation, la coloration à l’insuline révèle une distribution uniforme de l’îlot humain dans tout le foie, principalement à proximité des vaisseaux sanguins. En plus de l’insuline, la filtration cellulaire de la fibrine et des cellules polymorphonucléaires est également observée dans les îlots humains transplantés.La transplantation intrahépatique d’îlots générera un grand trou dans la veine porte qui peut provoquer des saignements. L’utilisation de nos deux procédures améliorées peut prévenir les saignements et réduire la mortalité après la transplantation d’îlots. Le modèle de transplantation d’îlots intraportail peut imiter la transplantation clinique d’îlots humains.Nos procédures affinées peuvent conduire à des taux de survie plus élevés pour les receveurs, ce qui permet une étude plus approfondie de la fonction des îlots après la transplantation.

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Transplantation soutenue d&#39;échafaudage d&#39;îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques

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