Absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière

La visualisation de l’absorption de petites vésicules extracellulaires, également connues sous le nom de sEV, par différentes cellules de la moelle épinière, peut confirmer une livraison réussie des sEV. Cela permet à la fois des études mécanistes et thérapeutiques des SEV administrés par voie intrathécale provenant de diverses sources dans des modèles roden. Ce protocole peut être utilisé pour visualiser l’absorption des sEV par les cellules d’une moelle épinière légère et peut aider à évaluer le rôle des sEV et de ses molécules de cargaison dans les troubles de la colonne vertébrale, la douleur et l’inflammation.

Cette procédure sera démontrée par moi,ainsi que par Xuan Luo a n et Zhucheng Lin, les deux étudiants diplômés du laboratoire du Dr Seena Ajit. Commencez par placer des feuillets de couverture de 18 millimètres dans la plaque de 12 puits, puis plaquez des cellules neuro-2a dans chaque puits avec un total de 1 millilitre de DMEM complet contenant 10% fbS et 1% de streptocoque de stylo. Lorsque la fluidité du nombre de cellules a atteint 80 à 90%, changez le milieu en milieu appauvri en exosome DMEM dans chaque puits, ajoutez un, 5 ou 10 microgrammes de sEV marqués.

Pendant 1, 4 et 24 heures. Pour l’absorption dépendante de la dose et du temps dans le reste des puits à un volume égal de contrôle des colorants. Recueillir le cerveau des chiots postnatals dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant une solution de sel équilibrée hanks glacée complétée par des hepes de 10 millimolaires, disséquer les lobes corticaux et enlever les méninges.

Hachez ensuite les tissus avec une lame stérilisée. Transférer les tissus dans un tube conique de 15 millilitres contenant Pepane ou désoxyribonuucos un tampon de dissociation et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, en faisant tourbillonner le tube toutes les 5 minutes, aspirer le surnageant et ajouter 5 millilitres de DMEM complet au tube. Pour inactiver l’activité enzymatique, essayez de noter soigneusement pour dissocier les tissus avec une pipette sérologique en verre de 5 millilitres et une pipette de pâturage polie à la flamme.

Passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres, puis centrifugez les cellules à 250 fois G pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius, aspirez le milieu et voyez les cellules dans 10 millilitres de DMEM complet dans une fiole de 75 centimètres carrés. Après 4 heures de placage, remplacez le surnate et le milieu par 15 millilitres de milieu DMEM frais. Après 14 jours in vitro pour détacher la microglie et les oligodendrocytes, transférer la fiole dans un agitateur orbital à 320 tr/min pendant 6 heures.

Utilisez 5 millilitres de l’enzyme de dissociation cellulaire pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Pour tripsiniser, les astrocytes restants, pour inactiver l’action enzymatique, ajoutez 5 millilitres de DMEM complet, puis azé les cellules à 250 fois G pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Ressuspendez les cellules dans un DMEM complet et voyez les cellules sur le couvercle de 12 millimètres numéro 1.5 glisser dans une plaque de 24 puits.

À l’aide de PBS, rincez les cellules 3 fois, puis fixez-les avec du formaldéhyde ou du PFA à 4% de puissance dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les cellules fixes 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS et perméabilisez-les à l’aide de 0,1% de Triton X 100 dans pbS pendant 10 à 15 minutes. Répétez ensuite les lavages avec PBS.

Utilisez 5% de sérum de chèvre normal ou NGS dans pbS pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer les cellules, incubez les cellules neuro-2a avec des anticorps bidirectionnels de carte et les astrocytes primaires avec des anticorps GFAP à un rapport de 1 à 500 dans 5% NGS ou PBS frais pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec des secousses douces. Après avoir lavé les cellules 3 fois dans le PBS, ajouter les anticorps secondaires conjugués au fluorophore dans 5% NGS. Incuber pendant 2 heures à température ambiante à l’abri de la lumière sur une bascule.

Répétez le lavage avec du PBS et incubez la cellule avec 1 microgramme par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Encore une fois, lavez les cellules 3 fois avec PBS. À l’aide d’un support de montage anti-décoloration, montez les glissières de couverture sur les lames numéro 1, laissez-les sécher pendant la nuit dans l’obscurité et stockez les lames de verre préparées à 4 degrés Celsius jusqu’à l’imagerie sur un microscope confocal.

Disséquez la moelle épinière et fixez-la dans 4% PFA dans PBS à 4 degrés Celsius pendant 24 heures. Protégez préalablement les tissus dans du saccharose à 30% dans le PBS à 4 degrés Celsius pendant 24 heures ou jusqu’à ce que les tissus coulent, puis stockez les tissus à 4 degrés Celsius jusqu’à l’immunohistochimie, insufflez la moelle épinière L4 L5 dans le composé OCT, puis congelez-la sur de la glace sèche jusqu’à ce qu’elle soit complètement solidifiée. Utilisez un cryostat pour sectionner les tissus à 30 micromètres et recueillir les sections dans une plaque de 24 puits contenant du PBS.

Lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 0,3% Triton dans PBS, Bloquez les sites de liaison non spécifiques en utilisant 5% MGS dans 0,3% Triton PBS pendant 2 heures à température ambiante. Incuber les sections pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un shaker. Lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes avec 0,3% de Triton en Pbs.

Ajoutez ensuite la concentration appropriée des anticorps secondaires. Selon le manuscrit du texte, incuber à température ambiante pendant deux heures, laver les sections en utilisant uniquement du PBS et les incuber dans 1 microgramme par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez ensuite les lavages PBS sous un microscope optique, montez les sections sur une lame adhésive transparente avec un pinceau fin.

Mouiller le couvercle avec le support de montage et durcir pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante, acquérir des images sous un microscope confocal avec les lasers respectifs, La taille moyenne moyenne des sEV dérivés de RA 2 6 4 0,7 était de 140 nanomètres et la taille maximale des particules était de 121,8 nanomètres. Avec les particules les plus détectables se situant dans la gamme de taille des exosomes ou sEVS. À 50 à 150 nanomètres, le transfert western des sEV, du lysate cellulaire et des milieux appauvris en exode, a démontré que les échantillons de protéines dérivées de sEV contenaient les protéines marqueurs sEV Alix CD81 et GAPDH.

Le lysate cellulaire a été enrichi en réticulum endoplasmique, la protéine résidente Calnexin donc Calnexin a servi de marqueur négatif pour la contamination cellulaire car elle était absente dans les sEV. Il a été observé que l’absorption des sEV se produisait à 1 heure et pour les sEV de 1, 5 et 10 microgrammes, la fluorescence post-incubation pouvait être détectée à 4 heures, pour 4, 5 et 10 microgrammes de sEV. L’absorption des SEV marqués PKH 26 par les astrocytes primaires a été examinée et la fluorescence maximale de l’absorption de sEVS dans les astrocytes corticaux primaires s’est produite à 24 heures où les sEV marqués PKH26 ont été prélevés et une fluorescence maximale a été observée à 6 heures, après l’injection dans les neurones astrocytes et les cellules microgliales.

L’inclusion de contrôles, de sEV non étiquetés et de contrôle des colorants crée du code pour un vent faux positif aux signaux récents en raison de l’étiquetage désormais spécifique Opry dance of Unbound dye patch coasts. L’absorption des seV peut être confirmée en étudiant le transfert de cargaison biomoléculaire vers la recette et les cellules et tissus et en déterminant les changements dans les niveaux d’expression des biomolécules ou des gènes cibles. Des études de comportement peuvent également être effectuées pour étudier l’impact fonctionnel de l’administration de sEV.