Name: Absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez comment marquer les petites vésicules extracellulaires avec des colorants PKH et suivre leur absorption par les cellules de la moelle épinière in vitro et in vivo. Ce protocole permet d'évaluer le potentiel thérapeutique des sEVs dans les troubles spinaux.

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Cette étude a été soutenue par des subventions du NIH NINDS R01NS102836 et du Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) accordées à Seena K. Ajit. Nous remercions le Dr Bradley Nash pour la lecture critique du manuscrit.

REMARQUE: Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Drexel University College of Medicine. Des souris CD-1 gestantes et chronométrées ont été utilisées pour la culture astrocytaire, et toutes les mères ont été reçues 15 jours après l’imprégnation. Des souris C57BL/6 âgées de dix à douze semaines ont été utilisées pour des expériences d’absorption in vivo.
1. Isolement des sEV des cellules macrophages RAW 264.7
<ol><li>Culture de cellules RAW 264,7 dans des flacons de 75 cm2 dans un milieu appauvri en exosomes DMEM contenant 10% de sérum fœtal bovin appauvri en exosomes (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (pen-strep) pendant 24-48 h.</li>
	<li>Recueillir 300 mL de milieu conditionné et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Recueillir le surnageant et centrifuger à 2 000 × g pendant 20 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans des tubes de centrifugeuse, centrifuger pendant 35 min à 12 000 × g à 4 °C.</li>
	<li>Recueillir le surnageant et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.</li>
	<li>Transférer dans des tubes ultracentrifuges et centrifuger pendant 80 min à 110 000 × g à 4 °C.</li>
	<li>Conserver le surnageant (milieu appauvri en exosomes), resussaisir la pastille dans 2 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et centrifuger pendant 1 h à 110 000 × g à 4 °C.</li>
	<li>Resuspendez la pastille dans 100 μL de PBS pour une caractérisation plus poussée à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et de la microscopie électronique à transmission (TEM) ou dans un tampon de dosage par radioimmunoprécipitation (RIPA) pour le transfert western.</li>
</ol>2. Caractérisation des VES
<ol><li>Analyse de suivi des nanoparticules (NTA) REMARQUE: La distribution granulométrique et le nombre / concentration de particules des sEV purifiés à partir de cellules RAW 264.7 ont été mesurés par NTA.<ol>
<li>Diluer les sEV dans du PBS filtré pour obtenir 20 à 60 vésicules par champ de vision pour un suivi optimal.</li>
		<li>Introduire l’échantillon dilué dans une cellule de débit à l’aide d’une pompe à seringue à débit constant.</li>
		<li>Prenez 3-5 vidéos de 30 s chacune. Réglez la vitesse d’obturation et le gain, puis concentrez manuellement les paramètres de l’appareil photo pour que le nombre maximal de vésicules soit visible et capable d’être suivi et analysé.</li>
		<li>Avancez les échantillons entre chaque enregistrement pour effectuer des mesures répliquées. Optimisez les paramètres de post-acquisition NTA et maintenez les paramètres constants entre les échantillons.</li>
		<li>Analysez chaque vidéo à l’aide du logiciel NTA pour obtenir la taille et la concentration moyennes des vésicules.</li>
		<li>Effectuez toutes les mesures NTA avec des paramètres système identiques pour plus de cohérence.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfert western<ol>
<li>Quantifier les quantités totales de protéines dans les sEV, les lysates cellulaires et les milieux appauvris en exosomes à l’aide d’un kit de dosage des protéines en suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Pour la préparation du lysate cellulaire, culturez les cellules RAW 264,7 dans des flacons de 75 cm2 jusqu’à 80-90% de confluent. Détachez les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 10-15 min, neutralisez la trypsine avec des milieux de culture et azillez les cellules en les filant à 400 × g pendant 5 min. Ressuspendez les cellules dans un milieu de croissance frais.</li>
		<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transférez 1 × 106 cellules dans un autre tube. Lavez les cellules avec du PBS deux fois en utilisant les mêmes conditions de centrifugation que ci-dessus et ajoutez 50 μL de tampon de lyse (tampon RIPA avec cocktail d’inhibiteurs de protéase ajouté) à la pastille cellulaire à partir du spin final.</li>
		<li>Vortex les cellules et les garder sur la glace pendant 20 min. Soumettre le mélange à la centrifugation à 10 000 × g pendant 30 min à 4 °C, recueillir le surnageant (c’est-à-dire le lysate) dans des tubes de microcentrifugation frais et conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.</li>
		<li>Concentrer 2 mL de milieux appauvris en exosomes à 100 μL à l’aide de filtres centrifuges à coupure de 3 kDa avant de quantifier la quantité de protéines. Mélanger les sEV avec un tampon de lyse dans un rapport de 1:1, vortex pendant 30 s et incuber sur de la glace pendant 15 min pour quantifier la quantité de protéines.</li>
		<li>Mélanger des quantités égales de protéines (2 μg) des sEV, de lysate de cellules RAW 264,7 et de milieux appauvris en exosomes avec un tampon d’échantillon réducteur.</li>
		<li>Dénaturer les échantillons à 95 °C pendant 5 min, les garder sur glace pendant 5 min, et tourner pendant 2 min à 10 000 × g. Chargez les échantillons sur un gel de protéines Tris-glycine à 12% et faites fonctionner le gel à 125 V pendant 45 min.</li>
		<li>Transférer la protéine sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à 25 V pendant 2 h.</li>
		<li>Après le transfert, bloquez les membranes PVDF avec un tampon bloquant (voir le tableau des matériaux)pendant 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Incuber le blot avec des anticorps primaires sur un shaker pendant la nuit à 4 °C. REMARQUE : Les principaux anticorps utilisés étaient la protéine X (Alix) (1:1 000), la protéine X (Alix) (1:1 000), l’anti-alpha-1,3/1,6-mannosyltransférase (ALG-2) (1:1 000), l’anti-calnexine (1:1 000) et l’anti-glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (1:1 000).</li>
		<li>Laver les éponges 3 x 15 min avec 1x solution saline tamponnée Tris, 0,1 % Tween 20 (TBST), et incuber à température ambiante avec des anticorps secondaires conjugués IgG-raifort (HRP) anti-chèvre igG-raifort (HRP) ou âne anti-lapin IgG-HRP (1:10 000) pendant 1 h sur le shaker.</li>
		<li>Lavez les taches 3 x 15 min avec 1x TBST, et détectez les protéines à l’aide d’un substrat HRP.</li>
		<li>Analysez les blots par chimiluminescence améliorée à l’aide d’un imageur western blot.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopie électronique à transmission (TEM)<ol>
<li>Fixer les VES en les réutilisant dans du paraformaldéhyde (PFA) à 2 % dans un tampon phosphate (PB) de 0,1 M; vortex pour 2 x 15 s.</li>
		<li>Placez une goutte de 10 μL de suspension sEV sur un parafilm propre. Faites flotter la grille formvar revêtue de carbone sur la goutte avec leur côté revêtu face à la suspension. Laissez les membranes absorber pendant 20 min dans un environnement sec.</li>
		<li>Placez les grilles (côté membrane vers le bas) sur une goutte de PB pour laver pendant 3 x 2 min.</li>
		<li>Transférer les grilles à 50 μL de 1% de glutaraldéhyde pendant 5 min.</li>
		<li>Lavez les grilles avec 100 μL d’eau distillée pendant 8 x 2 min.</li>
		<li>Comparez l’échantillon en plaçant les grilles sur une goutte d’acétate d’uranyle à 1% pendant 2 min.</li>
		<li>Incorporer l’échantillon avec 50 μL d’acétate d’uranyle à 0,2 % avec une solution de méthylcellulose à 2 % pendant 10 min sur un plat de glace recouvert de parafilm.</li>
		<li>Utilisez des boucles en acier inoxydable pour maintenir les grilles et éliminer l’excès de liquide avec du papier filtre.</li>
		<li>Séchez la grille à l’air libre pendant 10 minutes tout en restant en boucle.</li>
		<li>Observez au microscope électronique à transmission à 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Étiquetage des sEV
<ol><li>Diluer 20 μg de sEV dans 1 mL de tampon diluant ou le même volume de PBS dans 1 mL de tampon diluant pour le contrôle des colorants.</li>
	<li>Diluer 3 μL de colorant PKH67 ou PKH26 dans 1 mL de tampon diluant et mélanger par pipetage.</li>
	<li>Ajouter le colorant PKH dilué aux SEV dilués et mélanger par pipetage. Incuber pendant 5 min dans l’obscurité à température ambiante. Pour un contrôle du colorant, mélanger le colorant dilué avec le PBS dilué de l’étape 3.1.</li>
	<li>Ajouter 2 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans le PBS au tube avec le colorant et le mélange sEV et au tube témoin du colorant pour absorber l’excès de colorant.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 h à 110 000 × g à 4 °C. Jeter le surnageant, ressuspendre la pastille dans 2 mL de PBS et centrifuger pendant 1 h à 110 000 × g à 4 °C. Répétez le lavage avec PBS et resuspendez les sEV étiquetés ou le contrôle de colorant dans un volume égal de PBS.</li>
	<li>Quantifier la quantité de protéines totales par la méthode de Bradford.</li>
</ol>4. Absorption des VES par les cellules Neuro-2a
<ol><li>Placer des couvercles de 18 mm dans une plaque de 12 puits et plaquer 10 × 104 cellules Neuro-2a dans chaque puits dans un total de 1 mL de milieu DMEM complet contenant 10% de FBS et 1% de streptocoque de stylo.</li>
	<li>Changer le milieu en milieu appauvri en exosomes DMEM lorsque la confluence cellulaire est de 80 à 90%. Ajouter 1, 5 ou 10 μg de SEV marqués dans chaque puits pendant 1, 4 et 24 h pour une absorption dépendante de la dose et du temps, ou ajouter un volume égal de contrôle des colorants.</li>
</ol>5. Cultures astrocytaires primaires
<ol><li>Anesthésier 4 chiots postnatals 4 jours après la naissance en induisant l’hypothermie.</li>
	<li>Recueillir les cerveaux dans une boîte de Petri de 60 mm contenant de la solution saline équilibrée de Hank glacée (HBSS) complétée par 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES).</li>
	<li>Disséquez les deux lobes corticaux et enlevez les méninges. Hachez les tissus avec une lame stérilisée.</li>
	<li>Transférer les tissus dans un tube conique de 15 mL contenant un tampon de dissociation papaïne/désoxyribonucléase I et incuber pendant 20 min à 37 °C. Tourbillonner toutes les 5 minutes. REMARQUE: Pour 4 cortex de souris, 9 mL de papaïne de 7,5 U / mL dans HBSS sont activés à 37 ° C pendant au moins 30 min, filtrés à travers un filtre à seringue de 0,22 μm et mélangés à la désoxyribonucléase I à une concentration finale de 0,1 mg / mL.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et ajouter 5 mL de DMEM complet pour inactiver l’activité enzymatique. Triturez soigneusement pour dissocier les tissus avec une pipette sérologique en verre de 5 mL et une pipette Pasteur polie à la flamme.</li>
	<li>Faire passer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 μm et centrifuger les cellules à 250 × g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le milieu et ensemencer les cellules dans 10 mL de DMEM complet dans une fiole de 75 cm2. Remplacer le milieu surnageant par 15 mL de milieu DMEM frais 4 h après le placage.</li>
	<li>Après 14 jours in vitro,transférer la fiole dans un agitateur orbital pour détacher la microglie et les oligodendrocytes à 320 tr/min pendant 6 h.</li>
	<li>Trypsiniser les astrocytes restants en utilisant 5 mL de l’enzyme de dissociation cellulaire (Table des matériaux) pendant 10 min à 37 °C. Ajouter 5 mL de DMEM complet pour inactiver l’action enzymatique et granuler les cellules à 250 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Resuspendez les cellules dans un DMEM complet. Graine 5 × 104 cellules sur des couvercles de 12 mm #1.5 dans une plaque de 24 puits.</li>
</ol>6. Absorption des sEV par les astrocytes
<ol><li>Lorsque les astrocytes atteignent 80 à 90% de confluence, changez le milieu en milieu appauvri en exosomes DMEM.</li>
	<li>Ajouter 1 μg de SEV non marqués et étiquetés, un volume égal de contrôle de colorant ou pbS aux cellules. Utilisez les cellules pour la coloration 1 h et 24 h après le traitement sEV.</li>
</ol>7. Immunofluorescence
<ol><li>Rincez les cellules avec DU PBS 3x et fixez-les avec 4% de PFA dans PB pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Lavez les cellules fixes 3 x 5 min avec PB et perméabilisez-les à l’aide de 0,1% de Triton X-100 en PB pendant 10-15 min et lavez avec PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Bloquer les cellules avec 5% de sérum de chèvre normal (NGS) dans PB pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les cellules avec des anticorps primaires : protéine 2 associée aux microtubules (MAP2A, 1:500) pour les cellules Neuro-2a ou protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, 1:500) pour les astrocytes primaires dans des NGS/PB frais à 5 % pendant la nuit à 4 °C avec des secousses douces.</li>
	<li>Laver 3 x 10 min avec du PB et ajouter des anticorps secondaires conjugués au fluorophore (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; ou Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) dans 5% de NGS et incuber pendant 2 h à température ambiante sur une bascule.</li>
	<li>Laver 3 x 10 min avec du PB et incuber avec 1 μg/mL de coloration nucléaire 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min à température ambiante. Lavez à nouveau les cellules 3x avec PB.</li>
	<li>Montez les couvercles sur les glissières #1 à l’aide d’un support de montage antifade. Laissez-les sécher toute la nuit dans l’obscurité et conservez les lames de verre préparées à 4 °C jusqu’à ce qu’elles s’imagent au microscope confocal.</li>
</ol>8. Absorption in vivo des VES
<ol><li>Effectuer une injection intrathécale de 5 μg de SEV non marqués ou étiquetés remis en service dans 10 μL de PBS, ou un volume égal (10 μL) de contrôle des colorants (tel que préparé à la rubrique 3) chez des souris C57BL/6.</li>
	<li>Après 6 et 18 h après l’injection de sEV, anesthésier en profondeur les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de poids corporel de kétamine et de 10 mg/kg de poids corporel de xylazine.</li>
	<li>Effectuer une perfusion intracardique de souris avec une solution saline à 0,9% pour éliminer le sang, suivie d’une pfa / PB glacée fraîchement préparée à 4%.</li>
	<li>Disséquer la moelle épinière et fixer à 4 % de PFA/PB à 4 °C pendant 24 h. Cryoprotéger les tissus dans 30% de saccharose dans PB à 4 °C pendant 24 h ou jusqu’à ce que les tissus coulent. Conserver les tissus à 4 °C jusqu’à l’immunohistochimie.</li>
</ol>9. Immunohistochimie
<ol><li>Incorporer la moelle épinière L4-L5 dans le composé O.C.T. Congeler sur de la glace sèche jusqu’à ce qu’elle soit complètement solidifiée.</li>
	<li>Coupez les tissus à 30 μm (en coupe transversale pour la moelle épinière) à l’aide d’un cryostat et collectez les sections dans une plaque de 24 puits contenant du PB. Lavez les sections 3 x 5 min avec 0,3% de Triton en PB.</li>
	<li>Bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 5 % de NGS dans 0,3 % de Triton/PB pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Diluer les anticorps primaires : Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1 000), Iba1 pour la microglie (1:2 000) avec 5 % de NGS dans 0,3 % de Triton/PB, et incuber les sections pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur.</li>
	<li>Lavez les sections 3 x 5 min avec 0,3% triton/PB, et ajoutez des anticorps secondaires (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500, ou Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) dans 5% NGS/PB pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 x 5 min avec du PB, et incuber les sections dans 1 μg/mL de DAPI pendant 10 min à température ambiante. Lavez les sections 3 x 5 min avec PB.</li>
	<li>Montez les sections sur une lame adhésive propre (Table des matériaux) avec un pinceau fin sous un microscope optique.</li>
	<li>Mouillez le couvercle avec un support de montage. Durcir toute la nuit dans l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Image sous un microscope confocal avec les lasers respectifs.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans ce protocole, nous avons montré l’étiquetage des sEV avec des colorants PKH et la visualisation de leur absorption dans la moelle épinière. Les colorants fluorescents lipophiles PKH sont largement utilisés pour le marquage des cellules par cytométrie en flux et microscopie fluorescente3,5,6,12,24,25. En raison de leur de...

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des vésicules nanométriques dérivées de membranes d’une taille comprise entre 50 et 150 nm. Ils proviennent de corps multivésiculaires (M MVB) et sont libérés par les cellules lors de la fusion des M MVB avec la membrane plasmique. Les sEV contiennent des miARN, des ARNm, des protéines et des lipides bioactifs, et ces molécules sont transférées entre les cellules sous forme de communication de cellule à cellule. Les sEV peuvent être internalisés par les cellules réceptrices par une variété de voies endocytaires, et cette capture des sEV par les cellules réceptrices est médiée par la reconnaissance de molécules de surface sur les VE et les cellules cibles1.
Les sEV ont gagné en intérêt en raison de leur capacité à déclencher des changements moléculaires et phénotypiques dans les cellules acceptrices, de leur utilité en tant qu’agent thérapeutique et de leur potentiel en tant que transporteurs de molécules de cargaison ou d’agents pharmacologiques. En raison de leur petite taille, l’imagerie et le suivi des VES peuvent être difficiles, en particulier pour les études in vivo et les contextes cliniques. Par conséquent, de nombreuses méthodes ont été développées pour étiqueter et imager les sEV afin d’aider leur biodistribution et leur suivi in vitro et in vivo2.
La technique la plus courante pour étudier la biodistribution sEV et les interactions cellulaires cibles consiste à les étiqueter avec des molécules de colorant fluorescent3,4,5,6,7. Les VÉHICULES électriques ont d’abord été marqués avec des colorants à membrane cellulaire couramment utilisés pour imager les cellules. Ces colorants fluorescents colorent généralement la bicouche lipidique ou les protéines d’intérêt sur les sEV. Plusieurs colorants lipophiles présentent un fort signal fluorescent lorsqu’ils sont incorporés dans le cytosol, notamment diR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-iodure de tétraméthyindotricarbocyanine), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′,3′-tétraméthyl indocarbocyanine perchlorate) et DiD (1, 1′-dioctadécyyl-3, 3, 3′-tétraméthyl indocarbocyanine 4-chlorobenzènesulfonate sel)8,9,10,11.
D’autres colorants lipophiles, tels que PKH67 et PKH26, ont un groupe de tête polaire hautement fluorescent et une longue queue d’hydrocarbure aliphatique qui s’intercale facilement dans n’importe quelle structure lipidique et conduit à une rétention de colorant à long terme et à une fluorescence stable12. Les colorants PKH peuvent également étiqueter les véhicules électriques, ce qui permet d’étudier les propriétés des véhicules électriques in vivo13. De nombreux autres colorants ont été utilisés pour observer les exosomes en utilisant la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux, y compris les colorants de marquage des lipides14 et les colorants perméables aux cellules tels que l’ester de diacétate de carboxyfluorescéine succinimidyle (CFDA-SE)15,16 et l’ester d’acétoxyméthyl (AM) de calcéine17.
Des études sur la diaphonie médiée par le SEV entre différentes cellules du SNC ont fourni des informations importantes sur la pathogenèse des maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives18. Par exemple, les sEV des neurones peuvent propager des peptides bêta-amyloïdes et des protéines tau phosphorylées et aider à la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer19. De plus, les VE dérivés des érythrocytes contiennent de grandes quantités d’alpha-synucléine et peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique et contribuer à la pathologie de Parkinson20. La capacité des sEV à franchir les barrières physiologiques21 et à transférer leurs biomolécules aux cellules cibles en fait des outils pratiques pour délivrer des médicaments thérapeutiques auSNC 22.
La visualisation de l’absorption de sEV par une myriade de cellules du SNC dans la moelle épinière permettra à la fois des études mécanistes et l’évaluation des avantages thérapeutiques des sEV administrés de manière exogène à partir de diverses sources cellulaires. Cet article décrit la méthodologie pour étiqueter les sEV dérivés de macrophages et imager leur absorption in vitro et in vivo dans la moelle épinière lombaire par les neurones, les microglies et les astrocytes afin de confirmer qualitativement l’administration de sEV par visualisation.

<table><tbody><tr><td>Filtres centrifuges Amicon Ultra 0,5 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Alix</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-calnexine</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-GAPDH (14C10)</td><td>Signalisation cellulaire Technologie</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-protéine acide fibrillaire gliale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 pour IF ; 1:1000 pour IHC</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-MAP2A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire, 40 &mu ; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12 000 x g</td></tr><tr><td>Lamelle, 12 mm, #1.5</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-lame, 18 mm, #1.5</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Âne Anti-Lapin IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td> Lames de microscope doubles givrées <td>1:500</td></tr><tr><td>, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sans calcium ni magnésium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal appauvri en exosomes</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie FluorChem M</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-souris IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-souris IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage Intercept, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Tampon d’échantillon</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 system</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire Neuro-2A</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de transfert PVDF</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold Lames</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>Lames adhésives</td></tr><tr><td>T-75 Fioles</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Microscope électronique à transmission numérique</td><td>FEI Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grilles TEM</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Gel de protéine Tris-Glycine, 12 %</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Tampon de Running</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transfert Tris-Glycine</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td> enzyme de <td>dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,25 %</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Tubes Beckman</td><td>344058</td><td>110 000 x g</td></tr></tbody></table>

absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des vésicules de 50 à 150 nm sécrétées par toutes les cellules et présentes dans les fluides corporels. Les sEV transfèrent des biomolécules telles que l’ARN, les protéines et les lipides du donneur aux cellules acceptrices, ce qui en fait des médiateurs de signalisation clés entre les cellules. Dans le système nerveux central (SNC), les sEV peuvent servir de médiateur à la signalisation intercellulaire, y compris les interactions neuro-immunes. Les fonctions sEV peuvent être étudiées en suivant l’absorption des SEV marqués dans les cellules receveuses in vitro et in vivo. Cet article décrit l’étiquetage des sEV à partir du milieu conditionné des cellules macrophages RAW 264.7 à l’aide d’un colorant membranaire PKH. Il montre l’absorption de différentes concentrations de sEV marqués à plusieurs moments par les cellules Neuro-2a et les astrocytes primaires in vitro. On a également montré l’absorption des SEV délivrés par voie intrathécale dans les neurones de la moelle épinière, les astrocytes et les microglies de souris visualisés par microscopie confocale. Les résultats représentatifs démontrent une variation dépendante du temps dans l’absorption des sEV par différentes cellules, ce qui peut aider à confirmer l’administration réussie des sEV dans la moelle épinière.

Après l’isolement des sEV des milieux conditionnés RAW 264,7 par centrifugation, le NTA a été utilisé pour déterminer la concentration et la distribution granulométrique des sEV purifiés. La taille moyenne moyenne des sEV dérivés de RAW 264,7 était de 140 nm et la taille maximale des particules était de 121,8 nm, ce qui confirme que la plupart des particules détectables dans la mesure de diffusion de la lumière se situent dans la plage de taille des exosomes ou des sEV à 50-150 nm(Figure 1A).</strong...

Nous décrivons un protocole pour étiqueter les petites vésicules extracellulaires dérivées de macrophages avec des colorants PKH et observons leur absorption in vitro et dans la moelle épinière après l’administration intrathécale.

Absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

La visualisation de l’absorption de petites vésicules extracellulaires, également connues sous le nom de sEV, par différentes cellules de la moelle épinière, peut confirmer une livraison réussie des sEV. Cela permet à la fois des études mécanistes et thérapeutiques des SEV administrés par voie intrathécale provenant de diverses sources dans des modèles roden. Ce protocole peut être utilisé pour visualiser l’absorption des sEV par les cellules d’une moelle épinière légère et peut aider à évaluer le rôle des sEV et de ses molécules de cargaison dans les troubles de la colonne vertébrale, la douleur et l’inflammation.Cette procédure sera démontrée par moi,ainsi que par Xuan Luo a n et Zhucheng Lin, les deux étudiants diplômés du laboratoire du Dr Seena Ajit. Commencez par placer des feuillets de couverture de 18 millimètres dans la plaque de 12 puits, puis plaquez des cellules neuro-2a dans chaque puits avec un total de 1 millilitre de DMEM complet contenant 10% fbS et 1% de streptocoque de stylo. Lorsque la fluidité du nombre de cellules a atteint 80 à 90%, changez le milieu en milieu appauvri en exosome DMEM dans chaque puits, ajoutez un, 5 ou 10 microgrammes de sEV marqués.Pendant 1, 4 et 24 heures. Pour l’absorption dépendante de la dose et du temps dans le reste des puits à un volume égal de contrôle des colorants. Recueillir le cerveau des chiots postnatals dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant une solution de sel équilibrée hanks glacée complétée par des hepes de 10 millimolaires, disséquer les lobes corticaux et enlever les méninges.Hachez ensuite les tissus avec une lame stérilisée. Transférer les tissus dans un tube conique de 15 millilitres contenant Pepane ou désoxyribonuucos un tampon de dissociation et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius, en faisant tourbillonner le tube toutes les 5 minutes, aspirer le surnageant et ajouter 5 millilitres de DMEM complet au tube. Pour inactiver l’activité enzymatique, essayez de noter soigneusement pour dissocier les tissus avec une pipette sérologique en verre de 5 millilitres et une pipette de pâturage polie à la flamme.Passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres, puis centrifugez les cellules à 250 fois G pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius, aspirez le milieu et voyez les cellules dans 10 millilitres de DMEM complet dans une fiole de 75 centimètres carrés. Après 4 heures de placage, remplacez le surnate et le milieu par 15 millilitres de milieu DMEM frais. Après 14 jours in vitro pour détacher la microglie et les oligodendrocytes, transférer la fiole dans un agitateur orbital à 320 tr/min pendant 6 heures.Utilisez 5 millilitres de l’enzyme de dissociation cellulaire pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Pour tripsiniser, les astrocytes restants, pour inactiver l’action enzymatique, ajoutez 5 millilitres de DMEM complet, puis azé les cellules à 250 fois G pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Ressuspendez les cellules dans un DMEM complet et voyez les cellules sur le couvercle de 12 millimètres numéro 1.5 glisser dans une plaque de 24 puits.À l’aide de PBS, rincez les cellules 3 fois, puis fixez-les avec du formaldéhyde ou du PFA à 4% de puissance dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les cellules fixes 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS et perméabilisez-les à l’aide de 0,1% de Triton X 100 dans pbS pendant 10 à 15 minutes. Répétez ensuite les lavages avec PBS.Utilisez 5% de sérum de chèvre normal ou NGS dans pbS pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer les cellules, incubez les cellules neuro-2a avec des anticorps bidirectionnels de carte et les astrocytes primaires avec des anticorps GFAP à un rapport de 1 à 500 dans 5% NGS ou PBS frais pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec des secousses douces. Après avoir lavé les cellules 3 fois dans le PBS, ajouter les anticorps secondaires conjugués au fluorophore dans 5% NGS. Incuber pendant 2 heures à température ambiante à l’abri de la lumière sur une bascule.Répétez le lavage avec du PBS et incubez la cellule avec 1 microgramme par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Encore une fois, lavez les cellules 3 fois avec PBS. À l’aide d’un support de montage anti-décoloration, montez les glissières de couverture sur les lames numéro 1, laissez-les sécher pendant la nuit dans l’obscurité et stockez les lames de verre préparées à 4 degrés Celsius jusqu’à l’imagerie sur un microscope confocal.Disséquez la moelle épinière et fixez-la dans 4% PFA dans PBS à 4 degrés Celsius pendant 24 heures. Protégez préalablement les tissus dans du saccharose à 30% dans le PBS à 4 degrés Celsius pendant 24 heures ou jusqu’à ce que les tissus coulent, puis stockez les tissus à 4 degrés Celsius jusqu’à l’immunohistochimie, insufflez la moelle épinière L4 L5 dans le composé OCT, puis congelez-la sur de la glace sèche jusqu’à ce qu’elle soit complètement solidifiée. Utilisez un cryostat pour sectionner les tissus à 30 micromètres et recueillir les sections dans une plaque de 24 puits contenant du PBS.Lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 0,3% Triton dans PBS, Bloquez les sites de liaison non spécifiques en utilisant 5% MGS dans 0,3% Triton PBS pendant 2 heures à température ambiante. Incuber les sections pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un shaker. Lavez les sections 3 fois pendant 5 minutes avec 0,3% de Triton en Pbs.Ajoutez ensuite la concentration appropriée des anticorps secondaires. Selon le manuscrit du texte, incuber à température ambiante pendant deux heures, laver les sections en utilisant uniquement du PBS et les incuber dans 1 microgramme par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez ensuite les lavages PBS sous un microscope optique, montez les sections sur une lame adhésive transparente avec un pinceau fin.Mouiller le couvercle avec le support de montage et durcir pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante, acquérir des images sous un microscope confocal avec les lasers respectifs, La taille moyenne moyenne des sEV dérivés de RA 2 6 4 0,7 était de 140 nanomètres et la taille maximale des particules était de 121,8 nanomètres. Avec les particules les plus détectables se situant dans la gamme de taille des exosomes ou sEVS. À 50 à 150 nanomètres, le transfert western des sEV, du lysate cellulaire et des milieux appauvris en exode, a démontré que les échantillons de protéines dérivées de sEV contenaient les protéines marqueurs sEV Alix CD81 et GAPDH.Le lysate cellulaire a été enrichi en réticulum endoplasmique, la protéine résidente Calnexin donc Calnexin a servi de marqueur négatif pour la contamination cellulaire car elle était absente dans les sEV. Il a été observé que l’absorption des sEV se produisait à 1 heure et pour les sEV de 1, 5 et 10 microgrammes, la fluorescence post-incubation pouvait être détectée à 4 heures, pour 4, 5 et 10 microgrammes de sEV. L’absorption des SEV marqués PKH 26 par les astrocytes primaires a été examinée et la fluorescence maximale de l’absorption de sEVS dans les astrocytes corticaux primaires s’est produite à 24 heures où les sEV marqués PKH26 ont été prélevés et une fluorescence maximale a été observée à 6 heures, après l’injection dans les neurones astrocytes et les cellules microgliales.L’inclusion de contrôles, de sEV non étiquetés et de contrôle des colorants crée du code pour un vent faux positif aux signaux récents en raison de l’étiquetage désormais spécifique Opry dance of Unbound dye patch coasts. L’absorption des seV peut être confirmée en étudiant le transfert de cargaison biomoléculaire vers la recette et les cellules et tissus et en déterminant les changements dans les niveaux d’expression des biomolécules ou des gènes cibles. Des études de comportement peuvent également être effectuées pour étudier l’impact fonctionnel de l’administration de sEV.

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