Name: Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Découvrez comment créer un tissu cardiaque humain 3D mature à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches hiPSC dans un dispositif microfluidique. Cette méthode reproduit l'anisotropie du myocarde natif pour la recherche fondamentale et le criblage pharmaceutique.

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Nous tenons à remercier le NSF CAREER Award #1653193, arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872), et le Flinn Foundation Award pour avoir fourni des sources de financement pour ce projet. La ligne hiPSC, SCVI20, a été obtenue de Joseph C. Wu, MD, PhD au Stanford Cardiovascular Institute financé par NIH R24 HL117756. La ligne hiPSC, IMR90-4, a été obtenue auprès du WiCell Research Institute55,56.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La formation d’un modèle de tissu cardiaque humain in vitro avec des interactions cellule-cellule améliorées et une structure 3D biomimétique est impérative pour la recherche cardiovasculaire fondamentale et les applications cliniques correspondantes1. Ce protocole décrit explique le développement du tissu cardiaque anisotrope humain 3D dans un dispositif microfluidique, utilisant la co-culture des MC dérivés de cellules souches avec des FC conjonctifs encapsulés dans un hydrogel de colla...

Les approches d’ingénierie tissulaire ont été largement explorées, ces dernières années, pour accompagner les résultats cliniques in vivo en médecine régénérative et en modélisation des maladies1,2. Un accent significatif a été particulièrement mis sur la modélisation in vitro des tissus cardiaques en raison des difficultés inhérentes à l’approvisionnement en tissu cardiaque primaire humain et à la production de substituts in vitro physiologiquement pertinents, limitant la compréhension fondamentale des mécanismes complexes des maladies cardiovasculaires (MCV)1,3. Les modèles traditionnels ont souvent impliqué des tests de culture monocouche 2D. Cependant, l’importance de la culture de cellules cardiaques dans un environnement 3D pour imiter à la fois le paysage natif du myocarde et les interactions cellulaires complexes a été largement caractérisée4,5. De plus, la plupart des modèles produits jusqu’à présent ont inclus une monoculture de MC différenciées des cellules souches. Cependant, le cœur est composé de plusieurs types de cellules6 au sein d’une architecture 3D complexe7,justifiant le besoin critique d’améliorer la complexité de la composition tissulaire au sein des modèles in vitro 3D pour mieux imiter les constituants cellulaires du myocarde natif.
À ce jour, de nombreuses approches différentes ont été explorées pour produire des modèles 3D biomimétiques du myocarde8. Ces approches vont des configurations expérimentales qui permettent le calcul en temps réel de la force générée, des MC mono-culture ensemencés sur des films minces (réputés films minces musculaires (MTF))9,à la co-culture de cellules cardiaques dans des matrices d’hydrogel 3D suspendues parmi des cantilevers autoportants (tissus cardiaques réputés modifiés (EHTs))10. D’autres approches se sont concentrées sur la mise en œuvre de techniques de micromoldage pour imiter l’anisotropie myocardique, des MC mono-culture dans un hydrogel 3D suspendu parmi des micropostes saillants dans une parcelle tissulaire11,aux MC mono-culture ensemencées parmi des microgrooves dentelés12,13. Il y a des avantages et des inconvénients inhérents à chacune de ces méthodes, par conséquent, il est pertinent d’utiliser la technique qui s’aligne sur l’application prévue et la question biologique correspondante.
La capacité d’améliorer la maturation des MC dérivés des cellules souches est essentielle pour l’ingénierie in vitro réussie du tissu myocardique de type adulte et la traduction des résultats suivants en interprétations cliniques. À cette fin, les méthodes de maturation des MC ont été largement explorées, tant en 2D qu’en 3D14,15,16. Par exemple, la stimulation électrique incorporée dans les EHTs, l’alignement forcé des MC avec la topographie de surface, les signaux, les facteurs de croissance de la co-culture et/ou les conditions d’hydrogel 3D, etc., conduisent tous à un changement en faveur de la maturation cm dans au moins l’un des éléments suivants: morphologie cellulaire, manipulation du calcium, structure sarcomérique, expression génique ou force contractile.
Parmi ces modèles, les approches qui utilisent des plateformes microfluidiques conservent certains avantages dans la nature, tels que le contrôle des gradients, l’entrée limitée des cellules et les réactifs minimaux nécessaires. En outre, de nombreuses répétitions biologiques peuvent être générées à la fois à l’aide de plates-formes microfluidiques, servant à mieux disséquer le mécanisme biologique d’intérêt et à augmenter la taille expérimentale de l’échantillon en faveur de la puissance statistique17,18,19. De plus, l’utilisation de la photolithographie dans le processus de fabrication de dispositifs microfluidiques permet la création de caractéristiques précises (p. ex., topographies) aux niveaux micro et nanométrique, qui servent de repères mésoscopiques pour améliorer la structure cellulaire environnante et l’architecture tissulaire au niveau macro18,20,21, 22 pour différentes applications dans la régénération tissulaire et la modélisation des maladies.
Nous avons précédemment démontré le développement d’un nouveau modèle 3D de tissu cardiaque sur puce qui intègre la topographie de surface, sous la forme de micropostes elliptiques innés, pour aligner les cellules cardiaques co-cultivées encapsulées par hydrogel dans un tissu anisotrope interconnecté20. Après 14 jours de culture, les tissus formés dans le dispositif microfluidique sont plus matures dans leur phénotype, leur profil d’expression génique, leurs caractéristiques de manipulation du calcium et leur réponse pharmaceutique par rapport aux contrôles monocouches et isotropes 3D23. Le protocole décrit ici décrit la méthode de création de ce tissu cardiaque humain co-cultivé et aligné (c.-à-d. anisotrope) 3D dans le dispositif microfluidique utilisant des MC dérivés de hiPSC. Plus précisément, nous expliquons les méthodes pour différencier et purifier les HIPSCs vers les MC, la supplémentation des hCF avec des MC pour produire une population établie de co-culture, l’insertion de la population cellulaire encapsulée dans l’hydrogel de collagène dans les dispositifs microfluidiques, et l’analyse ultérieure des tissus construits en 3D par des essais contractiles et immunofluorescentscents. Les micro-tissus 3D qui en résultent conviennent à diverses applications, y compris les études de biologie fondamentale, la modélisation CVD et les tests pharmaceutiques.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger de 0,65 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 1,5 mm</td><td>VWR</td><td>95039-088</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>18x18mm</td><td>VWR</td><td>16004-308</td><td>Les lamelles doivent être n° 1, pour permettre une imagerie</td></tr> <tr><td>à fort grossissement4 % de paraformaldéhyde</td><td>ThermoFisher</td><td>101176-014</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire plates à 6 puits</td><td>VWR</td><td>82050-844</td><td></td></tr><tr><td>B27 moins insuline</td><td>LifeTech</td><td>A1895602</td><td></td></tr><tr><td>B27 plus insuline</td><td>LifeTech</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>VWR</td><td>10188-030</td><td></td></tr><tr><td>Collagène I, queue de rat</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>E8</td><td>ThermoFisher</td><td>A1517001</td><td>peut également être fabriqué en interne</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>45001-122</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FGM3</td><td>VWR</td><td>10172-048</td><td></td></tr><tr><td>GFR-Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-718</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>VWR</td><td>10152-212</td><td></td></tr><tr><td>hESC-Matrigel</td><td>Corning</td><td>BD354277</td><td></td></tr><tr><td>IPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Sigma</td><td>I0536-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>MTCS</td><td>Sigma</td><td>440299-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>VWR</td><td>15140122 Boîte de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri (150x15mm)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (60x15mm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Rouge Phénol</td><td>Sigma</td><td>P3532-5G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>MT10040CM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moins glucose</td><td>VWR</td><td>45001-110</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes de silicium (100mm)</td><td>University Wafer</td><td>1196</td><td></td></tr><tr><td>Lactate de sodium</td><td>Sigma</td><td>L4263-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SU8 2075</td><td>Microchem</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Développeur</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9901158</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastomer</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>T75 flacons</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.5 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>EVG620 Aligneur EVG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 Microscope confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

développement de tissu cardiaque humain organisé en 3d au sein d’une plate-forme microfluidique

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

La principale cause de décès dans le monde persiste sous forme de maladies cardiovasculaires (MCV). Cependant, la modélisation de la complexité physiologique et biologique du muscle cardiaque, le myocarde, est notoirement difficile à accomplir in vitro. Principalement, les obstacles résident dans le besoin de cardiomyocytes humains (MC) qui sont adultes ou présentent des phénotypes de type adulte et peuvent reproduire avec succès la complexité cellulaire du myocarde et l’architecture 3D complexe. Malheureusement, en raison de préoccupations éthiques et du manque de tissu cardiaque humain primaire dérivé du patient disponible, combinés à la prolifération minimale des MC, l’approvisionnement en MC humaines viables a été une étape limitative pour l’ingénierie des tissus cardiaques. À cette fin, la plupart des recherches ont fait la transition vers la différenciation cardiaque des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSTH) comme source principale de MC humaines, ce qui a entraîné l’incorporation à grande échelle de HIPSC-MC dans les essais in vitro pour la modélisation des tissus cardiaques.
Ici, dans ce travail, nous démontrons un protocole pour le développement d’un tissu cardiaque humain dérivé de cellules souches matures 3D dans un dispositif microfluidique. Nous expliquons spécifiquement et démontrons visuellement la production d’un modèle 3D anisotrope de tissu cardiaque sur puce anisotrope à partir de MC dérivés de hiPSC. Nous décrivons principalement un protocole de purification pour sélectionner pour les MC, la co-culture de cellules avec un rapport défini par l’intermédiaire du mélange des MC avec des FC humains (hFC), et la suspension de cette co-culture dans l’hydrogel à base de collagène. Nous démontrons en outre l’injection de l’hydrogel chargé de cellules dans notre dispositif microfluidique bien défini, intégré avec des micropostes elliptiques décalés qui servent de topographie de surface pour induire un degré élevé d’alignement des cellules environnantes et de la matrice d’hydrogel, imitant l’architecture du myocarde natif. Nous envisageons que le modèle de tissu sur puce cardiaque anisotrope 3D proposé convient aux études de biologie fondamentale, à la modélisation des maladies et, grâce à son utilisation comme outil de dépistage, aux tests pharmaceutiques.

Pour obtenir une population hautement purifiée de MC à partir de HIPSCs, une version modifiée impliquant une combinaison du protocole de différenciation Lian33 et des étapes de purification de Tohyama34 est utilisée (voir la figure 1A pour la chronologie expérimentale). Les hiPSCs doivent être en forme de colonie, ~ 85% confluents, et répartis uniformément dans tout le puits de culture 3-4 jours après le passage, au début de la différenciation ...

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de décès dans le monde. Les modèles in vitro traditionnels reposent sur la culture monocouche. Cependant, le cœur, en particulier le muscle cardiaque ou le myocarde, est complexe dans son anisotropie 3D et sa composition cellulaire.Par conséquent, il est essentiel d’améliorer la complexité de la composition tissulaire dans les modèles in vitro pour mieux imiter à la fois les constituants cellulaires et la structure du myocarde. Ici, dans ce travail, nous démontrons un protocole pour le développement d’un tissu cardiaque humain dérivé de cellules souches matures 3D dans un nouveau dispositif microfluidique. Ce dispositif intègre un canal tissulaire principal 3D avec des micropostes elliptiques innés qui induisent des degrés élevés d’alignement des cellules cardiaques encapsulées par hydrogel environnant.Le canal principal est flanqué de canaux médiatiques avec des ports d’injection qui permettent une diffusion des nutriments dans tout le tissu. En raison du soin exigé dans la manipulation des dispositifs microfluidiques, la représentation visuelle de ce protocole est utile pour établir correctement le tissu cardiaque 3D dans

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Ce protocole décrit la bioprinture 3D du tissu cardiaque sans l'utilisation de biomatériaux. Les plaques cardiovasculaires bioprinées 3D présentent une intégration mécanique des sphéroïdes constitutifs et sont très prometteuses dans la régénération des tissus cardiaques et comme modèles 3D de maladies cardiaques.

Création d&#39;un tissu cardiaque exposant l&#39;intégration mécanique des sphéroïdes à l&#39;aide de la bioprinterie 3D

Nous fournissons un protocole généralisé basé sur une stratégie de bioprinting microfluidiques pour génie un lit vasculaire microfibreux, où un type de cellule secondaire pourrait être encore semé dans l’espace interstitiel de cette structure microfibreux pour générer des organoids et des tissus vascularisés.

Microfluidique Bioprinting génie vascularisé tissus et organoïdes

Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.

Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de...

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Ce protocole vise à fabriquer des sphéroïdes cardiaques 3D (CS) en co-culture des cellules dans des gouttes suspendues. Les CS incorporés au collagène sont traités avec de la doxorubicine (DOX, un agent cardiotoxique) à des concentrations physiologiques pour modéliser l’insuffisance cardiaque. Les tests in vitro à l’aide de CS traités par DOX peuvent être utilisés pour identifier de nouvelles thérapies pour les patients souffrant d’insuffisance cardiaque.

Sphéroïdes cardiaques comme tissus cardiaques bioingénieurs in vitro pour étudier la pathophysiologie cardiaque humaine

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des organoïdes cardiaques humains (hHO) pertinents pour le développement en utilisant efficacement des cellules souches pluripotentes humaines par auto-organisation. Le protocole repose sur l’activation séquentielle des signaux de développement et produit des tissus cardiaques humains très complexes et fonctionnellement pertinents.

Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes

Les tissus cardiaques tridimensionnels issus de la bio-ingénierie à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches sont apparus comme des modèles prometteurs pour l’étude in vitro du myocarde humain sain et malade, tout en récapitulant les aspects clés de la niche cardiaque native. Ce manuscrit décrit un protocole de fabrication et d’analyse de tissus cardiaques artificiels à haut contenu générés à partir de cardiomyocytes induits pluripotents dérivés de cellules souches humaines.

Conception d’un bioréacteur pour améliorer l’acquisition de données et modéliser le débit des tissus cardiaques modifiés

Une méthode reproductible est présentée pour générer des tissus myocardiques 3D combinant l’écriture par électrofilage fondu (MEW), des échafaudages de polycaprolactone (PCL) et des hydrogels de fibrine avec des cardiomyocytes et des fibroblastes dérivés de hiPSC. Cette technique offre un contrôle précis de l’architecture de l’échafaudage et peut être appliquée dans les tests précliniques de médicaments et la modélisation des maladies cardiaques.

Génération 3D de tissu myocardique humain à l’aide de l’écriture électrofilée à l’état fondu d’échafaudages de polycaprolactone et de cellules cardiaques dérivées de hiPSC

Découvrez comment créer un tissu cardiaque humain 3D mature à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches hiPSC dans un dispositif microfluidique. Cette méthode reproduit l'anisotropie du myocarde natif pour la recherche fondamentale et le criblage pharmaceutique.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

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