RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

La technique de profilage des ribosomes, également appelée RIBO-seq, est actuellement l’outil le plus efficace pour étudier le processus de synthèse des protéines in vivo. L’avantage de cette méthode est sa capacité à surveiller la traduction en cartographiant précisément la position et le nombre de ribosomes. Ribo-seq est basé sur le fait que le ribosome, en se liant à la molécule d’ARNm, protège le fragment enfoui de la transcription lors de la digestion de la ribonucléase.

Les fragments obtenus, appelés empreintes ribosomiques, peuvent être séquencés et cartographiés sur la transcription dont ils proviennent, ce qui entraîne la détermination de la position exacte des ribosomes. Simultanément au RIBO-seq, le séquençage de l’ARNm total à haut débit est effectué pour fournir un point de référence et permettre la comparaison des données du RIBO-seq et du RNA-seq lors de l’analyse des données. Avant la récolte des cellules, vous pouvez éventuellement ajouter du chloramphénicol à la culture bactérienne, à la concentration finale de 100 microgrammes par millilitre, pour inhiber la traduction.

Incuber la culture avec l’antibiotique pendant une minute. Cette étape est importante si la récolte prend plus de temps que d’habitude, car l’inhibition de la traduction permet de prolonger le temps de prélèvement des échantillons. Prélever les échantillons à l’aide d’un système de filtration préchauffé.

Vous pouvez introduire des secousses afin d’imiter les conditions de croissance. Arrêtez le filtrage lorsque tous les supports ont traversé la membrane, mais ne laissez pas le filtre sécher complètement. Recueillir les granulés bactériens en grattant rapidement les cellules du disque filtrant à l’aide d’une scoopula préchauffée et désinfectée.

Placez immédiatement toute la scoopula avec les cellules récoltées dans un tube de 50 millilitres rempli d’azote liquide. Le granulé récolté doit être complètement recouvert d’azote liquide. Laissez le granulé geler à fond et déloger les cellules congelées à l’aide d’une scoopula préalablement refroidie.

Fermez le couvercle et assurez-vous qu’il est perforé. Ceci est important, car l’azote liquide peut faire exploser les récipients fermés en raison du changement de pression lors de l’évaporation. Préparez le GMPP, l’écouvillon d’ADN et les tubes Eppendorf frais dédiés à la lysase.

Préparer le tampon de lyse avec l’ajout de chloramphénicol si nécessaire. Allouer 500 microlitres de tampon de lyse par échantillon dans des tubes Eppendorf séparés et les placer sur de la glace. Décontaminer le mortier et le pilon avec un désinfectant de laboratoire et de l’éthanol à 70%.

Refroidir le mortier et le pilon en versant de l’azote liquide dans le mortier. Transférer la pastille bactérienne congelée dans un mortier pré-réfrigéré et la broyer en poudre. Ajouter environ un volume d’oxyde d’aluminium et continuer le meulage.

Gardez le mortier, le pilon et les cellules au frais en versant de l’azote liquide au besoin, pour ne pas laisser le contenu du mortier décongeler. Juste avant l’utilisation, ajoutez le GMPPNP et l’écouvillon d’ADN dans la partie aliquote du tampon de lyse. Transférer la solution dans le mortier et continuer le broyage.

Laissez la lysase dégeler lentement pendant le broyage. Lorsque la lysase dégèle complètement, transférer le mélange dans le tube Eppendorf pré-refroidi et retourner à la glace. Centrifuger lysase à 20 0000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Transférer les surnageants dans des tubes Eppendorf frais et pré-réfrigérés et les placer sur de la glace. Mesurer la concentration d’ARN dans chaque échantillon dilué avec NanoDrop. Divisez chaque lysat en deux parties, 0,5 à 1 milligramme d’ARN pour RIBO-seq, et le reste pour RNA-seq.

À un milligramme de l’ARN, ajoutez 3,8 microlitres de MNase dans Tris pH 8, et rechargez-le avec un tampon de lyse au volume total de 500 microlitres. Incuber à 25 degrés Celsius, 300 tours par minute, pendant 45 minutes. Une fois l’incubation terminée, nettoyez les échantillons à l’avec une trousse de nettoyage de l’ARN disponible dans le commerce.

Préparez un gel de TBE à 15% de polyacrylamide avec huit urées molaires et placez-le dans un réservoir avec tampon TBE. Pré-exécution pendant un minimum de 10 minutes à une tension constante de 200 volts. Mélanger les échantillons avec un tampon d’échantillon de TBE-Urée.

Dénaturez à 95 degrés Celsius pendant une minute et placez-les immédiatement sur la glace. Lavez l’urée en injectant du tampon TBE dans des puits de gel à l’aide d’une seringue. Chargez les échantillons, en laissant un espace de puits entre eux pour séparer chaque échantillon et prévenir la contamination croisée.

Utilisez 29 nucléotides-long oligo, et un mélange de 26 et 32 nucléotides-long oligos comme marqueurs. Exécutez l’électrophorèse à une tension constante de 180 volts. Préparer un tampon stérile pour l’incubation pendant la nuit.

Une fois l’électrophorèse terminée, tachez le gel avec SYBR Gold. Exciser les fragments du gel entre 26 et 32 nucléotides avec une aiguille stérile ou une lame de rasoir, et placer les fragments de gel dans des tubes Eppendorf séparés. Changez l’aiguille ou la lame de rasoir entre les échantillons.

Ajoutez 200 microlitres de tampon d’incubation de nuit à chaque Eppendorf et incuber les échantillons à 10 degrés Celsius, 1000 tours par minute, pendant la nuit. Le lendemain, nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN et éluez-les dans 18 microlitres d’eau sans nucléase. Les empreintes ribosomiques obtenues sont prêtes pour la préparation de la bibliothèque.

Effectuer l’épuisement de l’ARN ribosomique pour les échantillons d’ARN-seq à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Ensuite, nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN. Effectuez l’hydrolyse alcaline comme suit;préparer le tampon d’hydrolyse alcaline, ajouter un volume du tampon à un volume de l’échantillon et incuber à 95 degrés Celsius pendant 25 minutes.

Ajouter cinq microlitres de 3 molaires d’acétate de sodium pH 5,5 à chaque échantillon afin d’arrêter la réaction. Nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN et éluez-les dans 18 microlitres d’eau sans nucléase. L’ARN fragmenté aléatoirement obtenu est prêt pour la préparation de la bibliothèque.

Ajouter 10 microlitres de tampon de réaction 10x et cinq microlitres de polynucléotide kinase T4 à chaque échantillon. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure et demie. Passé ce délai, ajouter trois microlitres d’un ATP millimolaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, nettoyez les échantillons avec un kit de nettoyage de l’ARN. Effectuez la préparation de la bibliothèque à l’aide du kit disponible dans le commerce, conformément au protocole fourni ici. Effectuez PAGE en utilisant du gel à 6% de polyacrylamide.

Tachez le gel avec SYBR Gold. Fragments de gel d’accise contenant les bibliothèques. Pour les échantillons d’ARN-seq, la bibliothèque est comprise entre 135 et 180 nucléotides, et pour ribo-seq, entre 135 et 170 nucléotides.

Utilisez des aiguilles stériles ou des lames de rasoir et placez les fragments de gel excisés dans des tubes Eppendorf séparés. N’oubliez pas de changer l’aiguille ou la lame de rasoir entre les échantillons. Ajouter 100 microlitres d’eau sans nucléase à chaque fragment de gel excisé.

Et les incuber à 10 degrés Celsius, 450 tours par minute, pendant la nuit. Le lendemain, nettoyez les échantillons avec une trousse de nettoyage de l’ADN. Les bibliothèques obtenues sont prêtes pour le contrôle de la qualité et de la quantité avec une sensibilité élevée, l’électrophorèse de l’ADN sur puce, puis pour le séquençage de nouvelle génération.

Les bibliothèques d’ADNc qui en résultent présentent une quantité et une qualité appropriées requises pour le séquençage de nouvelle génération, tel que vérifié par électrophorèse de l’ADN sur puce à haute sensibilité. Les bandes et les pics représentant les bibliothèques RIBO-seq sont plus étroits et mieux définis, par rapport à cela représentant les bibliothèques RNA-seq. Selon l’électrophorèse sur puce, les bibliothèques ont la lentille attendue.

Les pics supplémentaires plus proches de 200 paires de bases présents dans les bibliothèques RIBO-seq peuvent indiquer des ribosomes hibernants, des empreintes ribosomiques non complètement digérées ou des artefacts, par exemple, l’ARNr, et peuvent être écartés lors de l’analyse bioinformatique lorsque les données obtenues à partir du séquençage sont coupées et que l’ARNt arnr est filtré. La quantité moyenne d’ADNc générée lors de la préparation de la bibliothèque est de 32 nanogrammes, ce qui fournit une quantité suffisante de matériel nécessaire au séquençage de nouvelle génération. Après le contrôle de la qualité par électrophorèse sur puce, les bibliothèques ont été extraites pour le séquençage d’une seule paire et de 50 paires de bases sur la plate-forme NextSeq 500 d’Illumina.

Le découpage des adaptateurs et des séquences de mauvaise qualité a donné lieu à 25 à 47 millions de lectures par échantillon pour les échantillons d’ARN-seq, et à 25 à 50 millions de lectures par échantillon pour les échantillons RIBO-seq. Les données obtenues ont été vérifiées avec FastQC. Les échantillons d’ARN-seq et de RIBO-seq présentaient de très bonne qualité.

La cartographie des bibliothèques préparées selon le protocole décrit a donné 2,4 à 9,6 millions de lectures mappées de manière unique par échantillon pour les échantillons d’ARN-seq, et 2,3 à 10,4 millions de lectures mappées de manière unique pour les échantillons RIBO-seq. Les données RIBO-seq présentent une périodicité triplée et un pic grand et étroit, correspondant aux ribosomes initiateurs et caractéristiques des empreintes ribosomiques, ce qui n’est pas observé dans les données RNA-seq. De plus, le graphique montrant les profils de couverture moyenne des empreintes ribosomiques et des fragments d’ARNm sur les séquences codantes révèle la proportion plus élevée de lectures mappées aux CDS dans l’ensemble de données RIBO-seq, comme prévu.

La visualisation des empreintes ribosomiques cartographiées a montré des modèles très similaires par rapport aux résultats obtenus à partir de la même expérience réalisée en conséquence à la procédure ribo-seq standard, qui inclut la récupération monosome par ultracentrifugation de gradient de saccharose. Notre protocole a été utilisé pour étudier la régulation de la traduction dans diverses conditions de croissance, mais peut être appliqué pour étudier d’autres aspects de la traduction, comme la détection de sites d’initiation de la traduction et de nouveaux gènes codant pour les protéines. Le séquençage des bibliothèques préparées selon nos lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète.

Le protocole que nous présentons ici est rapide, facile et rentable, et peut être exécuté avec un équipement de laboratoire standard.