In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

Ce protocole décrit un essai d’angiogenèse in vitro qui récapitule de nombreuses caractéristiques de la formation des vaisseaux sanguins et peut être utilisé pour tester des médicaments. Cette méthode est facile à mettre en œuvre en laboratoire, robuste et évolutive. Il présente de nombreuses similitudes avec les tests utilisant des cellules endothéliales humaines et des microsphères.

Ce modèle imite de manière robuste le phénotype montrant une sélection défectueuse des cellules de l’extrémité endothéliale et une migration des cellules endothéliales orientées qui conduit à une angiogenèse pathologique. Les travaux peuvent fournir des informations sur les mécanismes régulant l’angiogenèse germinative, les gènes clés et les voies de signalisation impliquées, notamment en effectuant un criblage génétique. Le principal défi est de maintenir la qualité ou la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris en culture. Il est important de vérifier régulièrement les stades de pluripotence et la morphologie des lignées cellulaires.

Il est également important d’effectuer un caryotypage des lignées cellulaires car elles ont tendance à se cultiver pour perdre ou gagner des chromosomes. Commencez par enduire un puits de la plaque de culture cellulaire de six puits avec 500 microlitres de solution de gélatine à 0,1% et placez-le dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les plaques enduites de gélatine avec du PBS et ajoutez 500 microlitres de CM fraîchement préparé plus moins moyen.

Pour obtenir une population pure de cellules souches embryonnaires de souris ou CSEm, trypsiniser la plaque de culture cellulaire avec un tampon TVP 10x pendant 30 secondes à température ambiante. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de différenciation du mésoderme avant de les transférer dans la plaque de six puits recouverte de gélatine pendant 30 minutes pour permettre aux fibroblastes embryonnaires de souris de se fixer pendant que les CSEm restent en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres avant de compter les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer dans un colorant bleu trypan.

Ensuite, centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de milieu de différenciation du mésoderme. Préparez quatre plats en polystyrène de 94 millimètres à faible fixation en ajoutant 15 millilitres d’eau stérile au fond.

Après avoir transféré la suspension cellulaire dans un réservoir en plastique stérile, chargez quatre positions d’une pipette multicanal avec 22 microlitres de suspension cellulaire par canal. Soulevez et placez le couvercle inversé de l’antenne parabolique de 94 millimètres sur la surface propre de l’armoire d’écoulement avec le côté intérieur tourné vers le haut. Déposez 40 gouttes de la suspension cellulaire sur la surface interne de chaque couvercle et inversez soigneusement le couvercle sans perturbation pour le replacer sur le plat, de sorte que les gouttes fassent face à l’eau.

Incuber les plats dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant quatre jours, en considérant cela comme le jour zéro de différenciation. Après quatre jours d’incubation, recueillir les gouttes suspendues dans un tube conique de 15 millilitres à l’aide d’une pipette P1000. Laisser sédimenter EB dans le tube avant de retirer le surnageant.

Remettez les EB en suspension dans trois millilitres de milieu de différenciation vasculaire 2x avant de transférer et de distribuer uniformément la suspension EB dans une boîte de 60 millimètres recouverte d’agar-agar. Incuber les plats dans un incubateur de dioxyde de carbone jusqu’au neuvième jour avec un rafraîchissement moyen tous les deux jours. Préparez une boîte de culture de 35 millimètres en ajoutant un millilitre du milieu de germination à son fond.

Pour induire la gélification, incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Recueillir les EB de neuf jours d’un plat d’agar dans un tube conique de 15 millilitres et retirer le surnageant. Remettez les EB en suspension dans deux millilitres de milieu de germination à froid pour les transférer dans la capsule de culture recouverte de la première couche de milieu de germination.

Répartissez les EB sur toute la plaque, en veillant à ce qu’ils soient à égale distance les uns des autres. La première formation de germes devrait être évidente après une incubation d’environ 24 à 48 heures. Le jour 12, utilisez une spatule pour transférer soigneusement le gel de collagène contenant des EB sur une lame de verre.

Retirez l’excès de liquide avec une pipette et déshydratez le gel en plaçant une feuille de gaze de lin en nylon et des cartes filtrantes absorbantes sur le gel. Appliquez une pression pesant 250 grammes pendant deux minutes. Ensuite, retirez les papiers de nylon pour permettre aux lames de sécher à l’air pendant 30 minutes à température ambiante.

Après séchage, fixer les EB en utilisant une solution de zinc pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez le fixateur avant de laver les lames cinq fois avec du PBS. Perméabiliser les EBs et PBS contenant 0,1% de Triton X-100.

Après 15 minutes, retirez la solution de perméabilisation pour laver les lames cinq fois avec du PBS pendant cinq minutes. Incuber les EB dans le tampon de blocage pendant une heure à température ambiante et laver avec du PBS pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite l’anticorps primaire dilué dans le tampon bloquant et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Incuber ensuite les lames avec l’anticorps secondaire Goat anti-Rat Alexa 555 dans un tampon bloquant pendant deux heures à température ambiante. Après l’incubation, lavez les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes et une fois avec de l’eau avant de les monter pour la microscopie. Le test d’angiogenèse germée 3D a été réalisé sur trois EB avec deux médicaments, DC101 et DAPT.

Les deux composés ont progressivement bloqué l’angiogenèse dans le modèle EB avec des concentrations croissantes. Les diverses concentrations de médicaments dans les EB ont montré que des doses élevées de DC101 inhibent le nombre et la longueur des germes vasculaires. Le DAPT a eu des effets opposés à la dose d’une micromole par litre.

Le DAPT a fortement augmenté le nombre de cellules de l’extrémité endothéliale par germes de vaisseaux ayant un phénotype erroné, même à faibles doses, par rapport à DC101. Une germination de vaisseaux défectueux a été observée dans les EB héréditaires hélangiectasies hémorragiques du contrôle ACVRL1 et des génotypes hétérozygotes ACVRL1 avec de nombreux phénotypes erronés germant à des angles aléatoires par rapport aux vaisseaux parents. Les mélanges d’une lignée de CSEm de type sauvage à un rapport de un à un avec une lignée de type sauvage de CSEm non marquée ont conduit à une contribution égale aux principales cellules endothéliales de l’extrémité.

Une analyse microscopique de cette EB chimérique représentative a été menée pour identifier l’origine génotypique des principales cellules de l’extrémité endothéliale. Pour quantifier la couverture cellulaire murale de la germe vasculaire, les EB ont été fixés et colorés pour les marqueurs de cellules endothéliales, PECAM, et le marqueur de cellule murale, l’actine du muscle lisse alpha. Une image à fort grossissement a révélé qu’une pousse de vaisseau individuelle était entourée de cellules murales.

La transformation binaire a été réalisée après séparation du canal de couleur et le rapport des vaisseaux positifs PECAM couverts par des cellules murales positives SMA alpha a été quantifié. Le fond génétique de la lignée de cellules souches embryonnaires est également un facteur clé que les chercheurs doivent prendre en compte, car certaines lignées poussent mieux que d’autres. Cette méthode peut être utilisée pour effectuer un dépistage génétique à l’aide d’approches ARNi ou d’une banque de cellules souches embryonnaires de souris présentant des mutations génétiques.