Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses
9 juin 2021
Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.
Le protocole étudie les neurones granulaires cérébelleux à différents stades de développement afin de visualiser la croissance morphologique clé. Les avantages de la technique comprennent le ciblage spécifique des cellules, l’expression rapide des constructions transfectées et le marquage clairsemé des cellules qui permet l’étude des effets autonomes cellulaires. Commencez par couper un segment de 11,2 millimètres à partir de l’embout d’une pipette de chargement et placez la partie coupée sur l’embout de la seringue Hamilton comme intercalaire pour limiter la profondeur d’injection à 1,5 millimètre.
Fixez l’entretoise sur l’embout de la seringue avec de l’adhésif ou du parafilm. Pour étudier la morphologie des CGN électroporés simples à partir de sections cérébrales sagittales du chiot expérimental, prenez des images Z-stack à 0,5 micromètre par pile sur un microscope confocal. Imagez une cellule par fenêtre d’image pour faciliter l’analyse de l’image et la reconstruction 3D.
Analysez la longueur des neurites et la formation de griffes dendritiques en aveugle à l’aide d’un simple traceur de neurite. Téléchargez des images Z-stack monocanal de CGN électroporés aux Fidji et cliquez sur Plugins"Segmentation » et Simple Neurite Tracer"Sélectionnez Create New 3D Viewer » dans le menu déroulant. Faites défiler jusqu’à la base d’une dendrite se connectant à la cellule soma et commencez un chemin en cliquant sur la jonction.
Tracez manuellement le chemin en cliquant sur les sections où le signal de remplissage de cellule est le plus lumineux et en appuyant sur Y pour conserver la trace. Tracez jusqu’à la fin de la dendrite et confirmez le chemin en appuyant sur F.Sinon, tracez jusqu’à la base de la griffe. Ensuite, tracez la griffe à partir de la base de la structure jusqu’à la fin du neurite le plus long.
Tracez les branches secondaires et tertiaires en maintenant la touche Ctrl sous Windows ou ALT sous macOS enfoncée et en cliquant sur le chemin. Confirmez le chemin en appuyant sur F.Observez que les mesures des traces sont visibles sur une fenêtre séparée. Additionnez toutes les tailles des branches de griffe pour obtenir la longueur totale de chaque griffe.
Dans l’analyse représentative, les images de projection des CGN électroporés de 3 à 14 jours après l’injection ont montré une diminution progressive du nombre de dendrites. Les CGN ont subi une phase de croissance dendritique suivie d’un raffinement de 3 DPI à 7 DPI qui a abouti à l’élagage de plus de 50% des dendrites en excès. Cet événement coïncide avec l’allongement progressif des tonnelles restantes dans la formation de structures en forme de griffes à la fin de chaque dendrite, ce qui indique que ces processus de développement se produisent simultanément.
À 7 DPI, des griffes ont été trouvées sur environ 75% des dendrites. Chaque CGN étiqueté a été reconstruit dans NMRS pour quantifier la surface et le volume somato-dendritiques totaux. Aucune différence significative dans la taille du CGN n’a été observée au cours du développement.
Bien qu’à 7 DPI, les CGN ont montré une diminution significative de 20% du volume par rapport à 3, 5 et 10 DPI. La chose la plus importante dans la procédure est de localiser avec précision le cervelet avant l’injection. La méthode peut être adaptée pour manipuler génétiquement des gènes in vivo afin d’étudier leur rôle dans le développement des neurones granulaires par transfection de shRNAs, de siRNA ou de Cre Recombinase.
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Aperçu
Cet article présente un protocole permettant d'étudier le développement morphologique des neurones granulaires cérébelleux (CGNs) dans le cervelet de souris en développement à l'aide de l'électroporation in vivo. Cette technique permet un marquage clairsemé et une manipulation génétique des CGNs, offrant ainsi la possibilité d'analyser en détail la croissance dendritique, la formation des griffes et la synaptogenèse au cours des étapes clés du développement. La méthode combine une injection précise, un examen en microscopie confocale et une analyse morphométrique quantitative afin de suivre la maturation des CGNs dans le temps.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les neurones subissent des changements structurels et fonctionnels importants durant le développement cérébral.
- Le cervelet des rongeurs constitue un système modèle pour l'étude de la morphogenèse au niveau cellulaire unique, en particulier des NCG.
- Les NCG forment des griffes dendritiques spécialisées qui sont essentielles pour l'entrée synaptique.
- Les méthodes traditionnelles de marquage manquent souvent de spécificité cellulaire ou de résolution temporelle.
Objectif de l'étude
- Visualiser et quantifier le développement morphologique individuel des neurones granulaires du cervelet (CGNs) in vivo.
- Suivre la croissance dendritique, l'élagage et la formation des épines au cours du développement à différents points temporels.
- Fournir une plateforme permettant la manipulation génétique cellulaire autonome des CGNs.
Méthodes utilisées
- Électroporation in vivo de progéniteurs de neurones granulaires dans le cervelet en développement de la souris.
- Marquage éparse des NGC pour une analyse morphologique claire.
- Microscopie confocale avec acquisition en Z-stack pour la reconstruction 3D.
- Tracé manuel et quantification de la longueur des neurites et des structures en griffe dendritique à l'aide de Fiji et de Simple Neurite Tracer.
Résultats principaux
- Les images de projection réalisées entre 3 et 14 jours après l'injection (JAI) ont révélé une diminution progressive du nombre de dendrites par NCG.
- Entre 3 et 7 JAI, les NCG ont subi un élagage dendritique, éliminant plus de 50 % des dendrites excédentaires.
- Des structures en forme de griffes se sont formées à l'extrémité des dendrites restantes, les griffes étant présentes sur environ 75 % des dendrites au jour 7 JAI.
- La taille des NCG est restée globalement constante, bien qu'une diminution significative de 20 % du volume ait été observée à 7 JAI par rapport aux autres points temporels.
Conclusions
- Le protocole permet une analyse détaillée et spécifique à la cellule du développement morphologique des neurones granulaires cérébelleux in vivo.
- La taille des dendrites et la formation des expansions en griffe sont des processus concomitants au cours de la maturation des neurones granulaires cérébelleux.
- La méthode est adaptable à la manipulation génétique afin d'étudier la fonction des gènes dans le développement des neurones granulaires cérébelleux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'analyse quantitative in vivo de la morphologie des neurones granulaires cérébelleux (CGN) et du développement des synapses répond à un besoin essentiel en matière de confiance prédictive dans la validation des cibles en neurodéveloppement. L'étiquetage clairsemé et les capacités de manipulation génétique permettent une détection mécanistique des risques aux stades les plus précoces de la découverte du SNC. Cette approche soutient la continuité translationnelle en reliant la morphogenèse cellulaire à l'intégration synaptique, éclairant ainsi les décisions stratégiques dans les programmes de R&D axés sur la neurobiologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation directe de la fonction des gènes dans la morphogenèse des CGN et la synaptogenèse.
- Permet la réduction des risques mécanistiques en isolant les effets cellulaires autonomes in vivo.
- Fournit des lectures quantitatives pour la validation ciblée guidée par des hypothèses.
- Facilite le tri des cibles de développement neuronal selon les phénotypes morphologiques et synaptiques.
Développement de criblages et de tests
- Établit des protocoles d'imagerie et d'analyse validés et reproductibles pour la morphologie neuronale.
- Fournit des métriques quantitatives telles que le nombre de dendrites, la formation des épines dendritiques et la longueur des neurites, destinées au criblage ultérieur.
- Permet la standardisation des tests grâce à une analyse morphométrique assistée par logiciel et réalisée en aveugle.
- Prépare des systèmes biologiques robustes pour des criblages de composés ou génétiques dans des pipelines du système nerveux central.
Recherche translationnelle et préclinique
- Associe les phénotypes morphologiques au développement synaptique pertinent pour la maladie dans les modèles rongeurs.
- Permet une continuité allant de la découverte précoce à la validation préclinique d'interventions neurodéveloppementales.
- Offre une plateforme pour évaluer des biomarqueurs translationnels de la maturation synaptique.
- Réduit les risques d'avancement en reliant les modifications cellulaires aux résultats fonctionnels synaptiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode intègre l'étape initiale de découverte jusqu'à l'identification de composés candidats dans la recherche sur le système nerveux central, permettant des tests itératifs d'hypothèses et un phénotypage quantitatif d'interventions génétiques ou pharmacologiques.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses nulles concernant la fonction des gènes dans la morphogenèse neuronale et la formation des synapses.
- Criblage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour l'analyse de la structure dendritique et synaptique.
- Analyse : Offre une mesure assistée par logiciel et réalisée en aveugle de la longueur des neurites, des épines dendritiques et du volume cellulaire.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les phénotypes cellulaires et le développement synaptique pertinent pour les maladies in vivo.
- Réutilisation en milieu professionnel : Adaptable à diverses manipulations génétiques et à différents modèles du système nerveux central dans le cadre de programmes de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles neurodéveloppementales et la réduction des risques mécanistiques.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'imagerie in vivo et l'analyse morphométrique pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon en reliant la perturbation génique à des phénotypes neuronaux quantifiables.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles du SNC fondée sur des données in vivo solides.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en neuroanatomie des rongeurs et des techniques précises d'injection stéréotaxique.
- Exige un accès à la microscopie confocale et à des logiciels avancés d'analyse d'images (par exemple, Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Implique une standardisation entre équipes pour l'analyse en aveugle et l'interprétation des données.
- Adaptable à diverses constructions génétiques (shRNA, siRNA, recombinase Cre) pour des études cellulaires autonomes.
- La précision des injections et l'efficacité du marquage cellulaire sont essentielles pour obtenir des résultats reproductibles.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
