Name: Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Découvrez la spectroscopie de corrélation de fluorescence pour détecter l'agrégation protéique dans les lysats cellulaires et les cellules vivantes. Cette méthode analyse les propriétés de diffusion des protéines TDP25 et SOD1 associées à la SLA.

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A.K. a été soutenu par une subvention de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), par une subvention de la Fondation Nakatani pour la lutte contre les nouvelles infections coronavirus, par une subvention du Bureau de l’Université d’Hokkaido pour le développement des futurs leaders de la recherche (L-Station), et une subvention d’aide de la Fondation Hoansha. M. K. a été partiellement soutenu par une subvention du JSPS pour la recherche scientifique sur les domaines novateurs « Chimie pour biosystèmes d’entassement multimoléculaire » (#20H04686) et une subvention de la JSPS pour la recherche scientifique sur les domaines novateurs « Physique de l’information des questions vivantes » (#20H05522).

1. Matériaux et reagents
<ol><li>Utilisez des solutions pyrogéniques gratuites et moyennes pour la culture cellulaire( tableau 1).</li>
	<li>Préparez des solutions pour l’expérience biochimique en utilisant de l’eau ultrapure et utilisez-la sans DNase/RNase.</li>
	<li>Sélectionnez un FBS approprié pour la culture cellulaire avec un processus de vérification de lot. Étant donné que le lot FBS sélectionné change régulièrement, le catalogue et le numéro de lot de FBS ne peuvent pas être représentés ici.</li>
	<li>ADN plasmide<ol>
<li>Préparer pmeGFP-N15 pour l’expression monomère eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 pour l’expression GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 pour l’expression SOD1-G85R-GFP; et pCAGGS8 en tant que transporteur. REMARQUE : le meGFP est une variante monomère portant la mutation A206K du GFP amélioré (eGFP). TDP25 est un fragment de terminal C associé à la SLA de TDP-43. SOD1-G85R est un mutant associé à la SLA de SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Souche cellulaire<ol>
<li>Utilisez des cellules neuroblastome neuro2a murines. REMARQUE : Les cellules Neuro2a ont une efficacité élevée en transfection et des protéines exogènes hautement expresses. Pour l’expression TDP25, des souches cellulaires ayant une efficacité d’expression élevée comme les cellules Neuro2a ou HEK293 sont nécessaires. Dans les cellules HeLa, TDP25 n’a pas pu être efficacement exprimé.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Culture cellulaire et transfection
<ol><li>Préparer un plat en plastique de 100 mm qui pousse les cellules Neuro2a de façon semi-confluente dans un milieu de croissance normal. REMARQUE : Il est nécessaire d’incuber à 37 °C pendant environ 48 à 72 heures après l’ensemencement précédent jusqu’à ce que la semi-confluence soit atteinte.</li>
	<li>Retirer le milieu.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de solution trypsine-EDTA dans le plat de culture cellulaire et les incuber à 37 °C pendant 1 min.</li>
	<li>Ajouter 9,5 mL de milieu de croissance normal dans le plat et suspendre les cellules détachées.</li>
	<li>En utilisant trypan bleu pour tacher les cellules mortes, compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou manuellement. Puis diluer les cellules dans le milieu de la culture (1,0 × 105/mL).</li>
	<li>Ajouter 2 mL de suspension cellulaire dans un plat en plastique de 35 mm pour la lyse cellulaire ou un plat de base en verre pour la mesure des cellules vivantes.</li>
	<li>Incuber le plat à 37 °C pendant 1 jour.</li>
	<li>Commencez les préparatifs suivants 15 minutes avant le jour de la transfection.</li>
	<li>Préparer deux tubes de 1,5 mL et ajouter 100 μL d’Opti-MEM I à chaque tube.</li>
	<li>Dans le premier tube, mélanger 1,0 μg d’ADN plasmide (solution A). Dans le deuxième tube, mélanger 2,5 μL de Lipofectamine 2000 (Solution B). REMARQUE : Pour maintenir l’efficacité de la transfection, maintenez la quantité totale d’ADN la même. Pour réduire le niveau d’expression de la mesure du SFC dans les cellules vivantes, la fraction de l’ADN plasmide pour l’expression des protéines devrait diminuer (p. ex., 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R et 0,8 μg de mélange pCAGGS). En outre, gardez le même rapport entre le volume de Lipofectamine 2000 et la quantité d’ADN plasmide.</li>
	<li>Mélanger délicatement la solution A et B en ajoutant un dans l’un ou l’autre tube, puis l’incuber pendant 1 min à température ambiante (solution C).</li>
	<li>Ajouter la solution C au milieu culturel; et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C.</li>
</ol>3. Lyse cellulaire et échange moyen
<ol><li>Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope de routine.</li>
	<li>Retirer le milieu dans le plat.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de PBS à 25 °C pour laver le milieu. Retirez le PBS.</li>
	<li>Déposer le plat sur une plaque d’aluminium sur la glace concassée. REMARQUE : Nous utilisons une plaque d’aluminium de 1 mm d’épaisseur coupée dans un magasin d’outils du dimanche ou disponible dans le commerce comme équipement de laboratoire.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de lyse à 4 °C. Secouez légèrement le plat afin que le tampon soit réparti uniformément au fond du plat.</li>
	<li>Racler le plat à l’aide d’un grattoir cellulaire et récupérer le lysate avec des débris cellulaires non résolus dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugeuse de la solution à 20 400 x g pendant 5 minutes à 4 °C.</li>
	<li>Récupérez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL et gardez-le à 4 °C ou sur la glace. REMARQUE : Ne pas congeler le lysate.</li>
	<li>Pour les mesures des cellules vivantes, remplacez le milieu avant la mesure. Vérifiez l’attachement cellulaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Confirmer l’expression à l’aide d’un microscope à fluorescence.</li>
</ol>4. Étalonnage de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
<ol><li>Démarrez le système et exécutez le logiciel d’opération. Allumez l’Argon+ laser (458/477/488/514 nm). Stabiliser le système au moins pendant 30 min.</li>
	<li>Configurer le chemin optique: Splitter faisceau principal: HFT488; Miroir dichroïque: NFT600; Filtre barrière de fluorescence : filtre à bande 505-540 (BP505-540); Détecteur : photodiode d’avalanche (APD)).</li>
	<li>Réglez la taille du sténopé en entrant la valeur directement (66 μm; 1 unité aéroy).</li>
	<li>Ajouter la solution Rhodamine 6G (Rh6G) dans un puits de la chambre de verre de couverture sur la scène.</li>
	<li>Ajouter l’eau ultrapure d’immersion sur l’objectif. N’utilisez pas l’huile d’immersion.</li>
	<li>Placez la chambre au microscope. Déplacez l’étape à la position appropriée.</li>
	<li>Concentrez-vous sur la surface supérieure du verre en mesurant la lumière éparse de la surface vitrée. Après avoir abaissé l’objectif vers le bas, tournez le bouton de mise au point dans le sens des aiguilles d’une montre pour régler. REMARQUE: Vérifiez la direction de rotation du bouton de mise au point car il est opposé entre ceux fabriqués au Japon et en Allemagne.</li>
	<li>Soulevez le point focal à 200 μm au-dessus de la surface supérieure du verre pour observer l’intérieur de la solution.</li>
	<li>Cliquez sur le taux de comptage et surveillez le taux de dénombrement des photons.</li>
	<li>Augmenter graduellement la valeur des filtres à thon acousto-optique (AOTF) (p. ex., transmission au laser excitation) de sorte que la valeur du taux de comptage est supérieure à 10 kHz.</li>
	<li>Cliquez sur l’ajustement du sténopé et ouvrez l’assistant d’ajustement du sténopé. Trouvez la position du sténopé avec le plus grand nombre (un pic) de photons dans l’axe x et y.</li>
	<li>Tournez l’anneau de correction de la lentille objective de sorte que les comptes par molécule (CPM) valeur est la plus élevée. REMARQUE : Puisque l’épaisseur du verre de couverture de la chambre spécifiée ici est de 0,12-0,17 mm, l’anneau de correction est à peu près à son minimum ou à quelques tours de celui-ci, où le CPM est à son maximum.</li>
	<li>Diminuez progressivement la valeur AOTF de sorte que la valeur CPM devient 2-3 kHz.</li>
	<li>Acquérir la fonction d’autocorréation (ACF) de Rh6G pour 90 s.</li>
	<li>Une fois la mesure terminée, cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de l’ajustement de la courbe.</li>
	<li>Sélectionnez un modèle pour une diffusion tridimensionnelle (3D) à un composant avec un état triplet. REMARQUE : Le Rh6G est monodisperse et diffus en un seul composant avec un état triplet.</li>
	<li>Réglez l’heure de départ appropriée en déplaçant la ligne rouge. Cliquez sur Fit All et vérifiez l’écart d’ajustement. Après avoir effectué le raccord de courbe, assurez-vous que le temps de diffusion (DT) et le paramètre de structure (SP) sont à peu près dans la gamme de 20-30 μs et 4-8, respectivement.</li>
	<li>Rappelez-vous la valeur des paramètres structurels. Utilisez la valeur SP pour l’analyse du raccord de courbe de tous les APF mesurés le même jour, dans les mêmes conditions optiques, et en utilisant le même type de plat de base en verre ou de verre de couverture chambé placé sur la scène du microscope.</li>
</ol>5. Mesure fcs dans le lysate cellulaire
<ol><li>Préparer les lysates cellulaires (voir ci-dessus).</li>
	<li>Déposer le lysate sur la chambre en verre de couverture. Placez un couvercle pour éviter le séchage et le couvercle de scène pour l’ombrage léger.</li>
	<li>Définissez l’état d’acquisition, la puissance laser, le temps de mesure et les répétitions.</li>
	<li>Cliquez sur le taux de comptage et ajustez la valeur AOTF du laser de sorte que la valeur CPM devient supérieure à 1 kHz.</li>
	<li>Effectuez une mesure d’essai pendant 1 min. Vérifiez si l’ACF calculé montre une amplitude positive et une désintégration lisse.</li>
	<li>Effectuez la mesure principale pendant 5 min. REMARQUE : Le temps total de mesure est progressivement augmenté jusqu’à ce que la forme de l’ACF ne change pas même si le temps de mesure est augmenté.</li>
	<li>Cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de montage de courbe.</li>
	<li>Sélectionnez un modèle de diffusion 3D à deux composants avec un état triplet. N’oubliez pas d’entrer la valeur SP et de modifier son paramètre en « Fixe » et non « Gratuit » avant de cliquer sur Fit all.</li>
	<li>Exportez la table équipée comme un fichier texte délimité par onglet.</li>
	<li>Si nécessaire, exportez l’enregistrement des taux ACF et Count sous forme de fichier texte délimité par onglets.</li>
</ol>6. Mesure fcs dans les cellules vivantes
<ol><li>Remplacer le milieu par un milieu frais avant la mesure.</li>
	<li>Utilisez un incubateur de stades thermiques. Placez le plat de culture cellulaire sur la scène du microscope.</li>
	<li>Confirmez la mise au point et la position à l’aide du micrope confocal. Sélectionnez la cellule de mesure. Zoomez et ajustez la position de la cellule. Obtenez des images de fluorescence d’une cellule exprimant le GFP en utilisant le mode vitesse de balayage lent.</li>
	<li>Sélectionnez une position de mesure FCS à l’aide de la position dans la section « FCS ».</li>
	<li>Sélectionnez au moins un point de mesure FCS à l’aide d’un réticule(figure 1).</li>
	<li>Mesurer l’ACF pendant 1 min. REMARQUE : Étant donné que les protéines fluorescentes ont tendance à être photobleached dans les cellules vivantes en raison du mouvement lent comparé à la solution, le temps de mesure devrait être minimum. Il est généralement difficile d’obtenir de l’ACF dans la cellule aussi facilement que les mesures de solution parce que la mesure prolongée conduira à la photobleaching des protéines fluorescentes.</li>
	<li>Cliquez sur Fit pour effectuer l’analyse de montage de courbe à l’aide d’un modèle de diffusion 3D à deux composants avec un état triplet. REMARQUE : Pour les mesures des cellules vivantes, un modèle de diffusion 3D à deux composants à l’état triplet serait préférable parce qu’il est empiriquement difficile de diminuer la valeur chi-carrée avec un modèle de diffusion 3D à un composant en raison de l’existence de divers composants mobiles dans la cellule vivante. Mais même en utilisant un modèle pour la diffusion 3D à trois composants, les composants de diffusion ne sont généralement pas séparés par rapport à l’utilisation du modèle pour deux composants.</li>
</ol>

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<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Ces auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

En ce qui concerne l’étalonnage du système avant les mesures, les mêmes verreries que celle utilisée pour mesurer l’échantillon devraient être utilisées (p. ex., les 8 puits couvrent la chambre de verre pour le lysate cellulaire et le plat de base en verre de 35 mm pour les cellules vivantes). En raison de l’adsorption de Rh6G sur le verre, sa concentration effective peut parfois diminuer. Si c’est le cas, une solution Rh6G hautement concentrée comme 1 μM doit être utilisée juste pour le réglage du sténopé. Des taux extr...

Les agrégations protéiques impliquant des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, etainsi de suite, sont connues pour être toxiques et perturberaient l’homéostasie protéique (protéostasie) dans les cellules et les organes, qui pourrait alors conduire au vieillissement2. Le dégagement de l’agrégation protéique est attendu comme stratégie thérapeutique; toutefois, les produits chimiques qui empêchent la formation d’agrégations protéiques et dégradent les agrégats protéiques (p. ex., petites molécules ou médicaments) n’ont pas encore été établis. De plus, la façon dont l’agrégation protéique exerce une toxicité reste insaisissable. Par conséquent, pour promouvoir des projets de recherche liés à l’agrégation des protéines, il est important d’introduire des procédures à haut débit pour détecter simplement l’agrégation des protéines. La détection de l’agrégation protéique à l’aide d’anticorps reconnaissant la conformation de l’agrégation protéique et du colorant fluorescent spécifique à l’agrégation a étélargement utilisée 3. Cependant, il est difficile de détecter l’agrégation, en particulier dans les cellules vivantes en utilisant de telles procédures classiques. 
Le transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) est une procédure de détection de l’agrégation des protéines et des changements structurels. Toutefois, fret est incapable d’analyser la dynamique protéique (p. ex., diffusion et oligomérisation des protéines dans les cellules vivantes)3. Par conséquent, nous introduisons ici un protocole simple pour détecter l’agrégation des protéines dans la solution (par exemple, le lysate cellulaire) et les cellules vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui mesure la propriété de diffusion et la luminosité des molécules fluorescentes avec une seule sensibilité molécule4. FCS est une méthode de comptage des photons à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSM). À l’aide d’un détecteur de photons hautement sensible et du calcul de la fonction d’autocorrépendance (ACF) de l’heure d’arrivée des photons, le passage à travers le temps et la luminosité des molécules fluorescentes dans le volume de détection est mesuré. La diffusion ralentit avec une augmentation du poids moléculaire; ainsi, l’interaction intermoléculaire peut être estimée à l’aide de FCS. Plus puissamment encore, une augmentation de la luminosité de la molécule fluorescente indique l’homo-oligomérisation des molécules. Par conséquent, FCS est un outil puissant pour détecter une telle agrégation de protéines.

<table><tbody><tr><td>0,25 % (p/v) Trypsine-1 mmol/L EDTA&middot ; Solution de 4Na avec rouge de phénol (trypsine-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Plats en plastique de 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Plat à base en verre de 35 mm</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Pour la mesure de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Plats en plastique de 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Plaque en aluminium</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Grattoir à cellule d’objectif</td></tr><tr><td></td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Membrane filtrante en acétate de cellulose (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de couverture en verre 8 puits</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Pour</td></tr><tr><td>la mesure de la solution Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Milieu basal</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>biosera</td><td></td><td>Vérification du lot requise</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Système FCS</td></tr><tr><td>Neuroblastome murin Cellules Neuro2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Lignée cellulaire</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>ADN plasmidique pour le transporteur de transfection</td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine (& fois ; 100 )</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>ADN plasmidique pour TDP25 marqué avec un eGFP monomère</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>ADN plasmidique pour l’expression de monomères eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td> ADN <td>plasmidique pour le mutant G85R lié à la SLA de SOD1 marqué avec un cocktail monomère d’inhibiteur de</td></tr><tr><td>protéase</td> eGFP <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (MH), et ainsi de suite. Pour détecter et analyser les oligomers ou agrégats protéiques solubles ou diffus, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui peut détecter la vitesse de diffusion et la luminosité d’une seule particule avec une seule sensibilité molécule, a été utilisée. Cependant, la procédure et le savoir-faire appropriés pour la détection de l’agrégation des protéines n’ont pas été largement partagés. Ici, nous montrons une procédure standard de mesure fcs pour les propriétés de diffusion des protéines sujettes à l’agrégation dans le lysate cellulaire et les cellules vivantes : fragment carboxyl-terminal associé à la SLA de l’ADN TAR/protéine liant l’ARN 43 kDa (TDP25) et de la dismutase de superoxyde 1 (SOD1). Les résultats représentatifs montrent qu’une partie des agrégats de protéine fluorescente verte (GFP) marqué TDP25 a été légèrement inclus dans la fraction soluble du lysate cellulaire neuroblastome murin Neuro2a. En outre, le SOD1 marqué GFP portant la mutation ALS-associée montre une diffusion plus lente dans les cellules vivantes. En conséquence, nous introduisons ici la procédure de détection de l’agrégation protéique via sa propriété de diffusion à l’aide de FCS.

Nous avons effectué la mesure fcs de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire et SOD1-G85R-GFP dans les cellules vivantes. Dans les deux cas, une amplitude positive et des APF lisses ont pu être acquis. Nous avons montré qu’une partie du GFP-TDP25 exprimée dans les cellules Neuro2a a été récupérée dans la fraction soluble dans l’état indiqué6. Dans la fraction soluble du lysate cellulaire, des molécules de fluorescence extrêmement brillantes ont été détectées dans l’enregistrement du taux de nombre de ...

Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Le meilleur principe de la spectroscopie de corrélation de fluorescence, FCS, a été inventé initialement dans les années 70. Dans les années 1990, des améliorations importantes et nombreuses pour FCS ont été établies en combinant avec une microscopie d’appareil confoccal. Depuis lors, FCS a été utilisé pour de nombreuses applications chimiques et de guérison du virus, telles que les interactions moléculaires et l’analyse de l’agrégation des protéines.L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs. La luminosité de fluorescence sont des particules simples en action des tailles moléculaires expliquées par des propriétés de diffusion. Il est très important dans la mesure des agrégations de protéines, car il peut déterminer les cycles de vie projetés des molécules, mais aussi distinguer l’homo ou l’hétéro polymérisation.Ici, nous introduisons une procédure pour mesurer la diffusion de la sclérose latérale amyotrophique associée à la protéine de forme agrégée utilisant FCS dans les lysates cellulaires et les cellules vivantes. Préparer un plat en plastique de 100 millimètres de plus en plus neuro2a cellule assis confortablement dans le milieu de croissance normal. Confirmez la confluence cellulaire.Retirer le milieu. Ajouter 3,5 millilitres de solution Trypsin-EDTA dans le troisième plat de cartouche et les incuber à 37 degrés Celsius pendant une minute. Ajouter un milieu de croissance normal de 9,5 millilitres dans le plat et les suspendre.La suspension cellulaire est mélangée avec du bleu trypan pour tacher les cellules mortes. Ajouter la suspension à la diapositive de comptage cellulaire. Comptez le nombre de cellules utilisant le compteur cellulaire, ou manuellement.Vérifiez le numéro de cellule en direct et leur viabilité. Diluer la cellule dans le milieu compté à 1,0 fois 10 à la puissance de 5 par millilitre. Ajouter deux millilitres de suspension cellulaire dans le plat en plastique de 35 millimètres pour la lyse cellulaire ou le plat d’espace de croissance pour la mesure des cellules vivantes.Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant une journée. Le lendemain, préparez le mélange d’ADN plasmide et de réhésifs transfection. Ajouter le mélange de transfection au milieu compté par cellules et incuber les cellules pendant 24 heures.Un jour plus tard. Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope de routine. Vous pouvez voir les corps très lumineux ingrédient TDP25 dans les cellules.La lyse cellulaire doit être effectuée sur le banc biochimique. Retirer le milieu dans le plat. Ajouter deux millilitres de PBS à 25 degrés Celsius pour les laver à feu moyen.Retirez le PBS. Déposer le plat sur une plaque d’aluminium sur le dessus de la glace concassée. Ajouter immédiatement le tampon de lyse de 200 microlitres dans le plat.Racler le plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. Récupérer le lysate avec des débris cellulaires non résolus dans un nouveau tube de 1,5 millimètre. Centrifugeuse le lysate à quatre degrés Celsius.Pour les mesures des cellules vivantes, remplacez le milieu par un milieu frais avant la mesure. Vérifiez l’attachement cellulaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Vérifiez également l’expression GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence.Utilisez un système FCS combiné au microscope confocal. Allumez le laser à 488 nanomètres. Stabiliser le système, au moins, pendant 30 minutes.Configurer le chemin optique. Utilisez un laser de 488 nanomètres pour la lumière instantanée. Utilisez un séparant de faisceau approprié et des mètres dichroïques.Et aussi, les fusibles de fluorescence. Habituellement, nous utilisons des chambres en verre de couverture pour l’étalonnage et les mesures de solution. Prenez soigneusement la chambre en verre.Placez la surface vitrée sur le papier de criblage de la lentille. Verser l’étalonnage fcs. Ajoutez également la solution Rhodamine 6G.Ajouter l’eau ultrapure sur l’objectif. N’utilisez pas l’huile. Placez la chambre sur la scène du microscope.Déplacez l’étape à la position appropriée. Créez l’ajustement du sténopé et ouvrez l’assistant d’ajustement du sténopé. Surveillez le taux de nombre de photons comme mouvement grossier du sténopé pour la direction x.La position la plus brillante a été déterminée à juste titre. Ensuite, surveillez le taux de nombre de photons comme un mouvement fin. La position la plus brillante a été déterminée avec succès C’est la position du sténopé pour la direction x.De la même façon, recherchez la position la plus brillante du sténopé pour y-direction. La position la plus brillante pour y-direction a également été déterminée avec succès. Aggraver la position x et y du sténopé.Il est préférable d’ajuster la position du sténopé avant la mesure de chaque jour. Lorsque le chemin d’accès est modifié, la position du sténopé doit être ajustée à nouveau. Créez un taux de compt compte et surveillez le taux de comptement du téléphone.Passer au mode de surveillance CPM. Comptez l’anneau de correction de l’objet que vous avez couru de sorte que la valeur CPM soit la plus élevée. Fermez la fenêtre de taux de compt compte.Commencez par la mesure de la solution Rhodamine 6G. Une fois la mesure terminée, cliquez sur l’ajustement pour effectuer l’analyse de montage de courbe. Sélectionnez un modèle pour l’ajustement de l’ancienne fonction de corrélation.Pour Rhodamine 6G, sélectionnez le modèle pour une diffusion tridimensionnelle à composantes 1 avec un état triplet. Réglez l’heure de départ appropriée en déplaçant la ligne rouge. Cliquez sur Fit All, pour commencer le calcul de montage.Vérifiez l’écart d’ajustement. Assurez-vous que les côtés sont affichés et négatifs, autour de zéro. Vérifiez les valeurs ajustées.Assurez-vous que le temps de diffusion est à peu près de l’âge de 20 à 30 microsecondes. En outre, le paramètre structurel est de quatre à huit. Ouvrez le panneau d’ajustement et sélectionnez un modèle pour la mesure.Entrez la même valeur de paramètre structurel dans le modèle pour l’échantillon dans le panneau d’ajustement. Assurez-vous que le type doit être défini comme fixe. Mesure GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire.Placer le lysate dans la chambre en verre de couverture. Placez le couvercle pour éviter le séchage du lysate. Placez le couvercle de la scène pour un ombrage léger.Dans le panneau d’acquisition, réglez la puissance laser, le temps de mesure et ses répétitions. Commencez l’acquisition. Un pic a été observé.Un pic a été observé à nouveau. Le pic indique que des molécules brillantes sont passées à travers le corps de détection. Les pointes indiquent des oligomers solubles ou des agrégats.Créez un ajustement pour effectuer l’analyse de montage de courbe. Sélectionnez le modèle pour la diffusion tridimensionnelle à 2 composants avec l’état triplet. Définissez l’heure de début appropriée.Cliquez sur le Fit All. Vérifiez les valeurs ajustées. SOD1-G85R marqué avec la mesure GFP dans une cellule vivante.Contrairement à la mesure de solution, je recommande d’utiliser l’incubateur de phase de chaleur. Réglez le plat de culture cellulaire sur la scène du microscope. Confirmez la mise au point et la position à l’aide de l’oculaire.Sélectionnez une cellule de mesure. Zoomez et ajustez la position de la cellule à l’aide d’un mode de balayage rapide. Obtenez l’instantané des cellules en utilisant le mode vitesse de balayage lent.Sélectionnez une position de mesure FCS à l’aide de l’outil Position. Le réticule indique la position de mesure. Démarrez la mesure.La légère diminution de l’enregistrement du taux de nombre de photons suggère le photobleaching de GFP. Effectuez le raccord de courbe. Les résultats représentatifs de GFP-TDP25 dans le lysate cellulaire sont montrés.Le graphique supérieur indique un taux de nombre de photons. Là où il y a des flèches, il y a un pic, suggérant des oligomers solubles et des agrégats. Le graphique du milieu représente l’ancienne fonction de corrélation.La ligne grise montre la fonction de corrélation basse et ancienne. La ligne magenta montre la fonction ajustée. Les lignes pointillées indiquent les heures de début et de fin pour l’ajustement.Le tableau inférieur indique la valeur ajustée. Ensuite, les résultats représentatifs de SOD1-G85R-GFP dans une cellule vivante sont affichés. Le graphique supérieur représente un enregistrement de notre taux de nombre de photons.La diminution graduelle du taux enregistré de nombre de photons a été observée, suggérant le photobleaching de la croissance de GFP pour différentes mesures. C’est en raison de la vitesse de diffusion lente dans les cellules vivantes. Le graphique du milieu représente l’ancienne fonction de corrélation de SOD1.La ligne grise montre la fonction de corrélation basse et ancienne. La ligne magenta montre la fonction ajustée. Les lignes pointillées indiquent les heures de début et de fin avec raccord.Le tableau inférieur affiche les valeurs ajustées. Ici, nous vous montrons cette procédure pour mesurer la diffusion de chaque cellule associée TDP-25 dans le lysate cellulaire et tout mutant de SOD1 dans les cellules vivantes en utilisant FCS. Les oligomères solubles et l’agrégation dans le lysate cellulaire peuvent souvent être observés comme des pointes ou des éclats.D’autre part, dans les cellules vivantes, de tels pics sont rarement observés, à l’exception de structures vivantes potentiellement évidentes. Une espèce lentement diffusatrice de SOD1 mutante ajouter une luminosité moyenne pour les particules simples telles que l’homopolymérisation SOD1 à l’intérieur pour nous. La procédure présentée ici est simple et valable.FCS ne contient aucun rayonnement;état directement dormant. C’est juste ton, et notre.empathie imaginaire.

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