Utilisation du séquençage de nouvelle génération pour identifier les mutations associées à la réparation d’une rupture double brin induite par CAS9 près du promoteur CD4

Ce protocole vous aide à identifier les mutations qui se produisent lors de la réparation d’une rupture double brin induite par l’ARN monoguide et CAS9. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un moyen rentable et robuste de détecter des mutations à un locus génomique spécifique. Nous utilisons le kératinocyte humain comme exemple, mais ce protocole peut être adapté à toutes les lignées cellulaires transfectibles.

Taylor Bugbee, un assistant de premier cycle de notre laboratoire, fera la démonstration de ce protocole. Pour commencer, cultivez des cellules HFK LXSN et HFK 8E6 dans des plaques de 10 centimètres à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur à enveloppe contenant des milieux de culture de kératinocytes avec un supplément de croissance des kératinocytes humains et une streptomycine à 1% de pénicilline. Remplacer le milieu de culture par trois millilitres de trypsine-EDTA et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieux supplémentés par FBS. Maintenant, transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifugez à 300 fois G pendant cinq minutes. Remettez en suspension les cellules avec 10 millilitres de milieux de culture de kératinocytes avec un supplément de croissance des kératinocytes humains et déterminez la concentration des cellules avec un hémocytomètre.

Ensuite, ensemencez deux plaques chacune pour les cellules HFK LXSN et HFK 8E6 dans quatre millilitres de milieux de culture de kératinocytes avec un supplément de croissance des kératinocytes humains et 1% de streptomycine de pénicilline. Après l’ensemencement, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur à veste. Le jour de la transfection, remplacez le média par trois millilitres de milieux supplémentés sans antibiotiques et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à veste.

Pour transfecter les cellules, réchauffez les réactifs de transfection à température ambiante et pipetez-les doucement avant de les utiliser. Placez une quantité appropriée de tampon de transfection dans deux tubes centrifuges stériles de 1,5 millilitre pour chaque lignée cellulaire et étiquetez-les comme tube un et transfection simulée, ou tube deux. Ensuite, ajoutez deux microgrammes de CD4 humain exprimant l’ADN plasmidique, CAS9, à guide unique, ciblant l’ARN, au tube un et pipettez doucement pour mélanger complètement.

Ajouter un volume égal d’eau stérile au tube deux. Ajouter une quantité appropriée du réactif de transfection au tube un avec un mélange d’ADN et à la transfection simulée ou au tube deux. À l’aide d’une pipette, mélangez-les complètement délicatement et incubez à température ambiante pendant 15 à 30 minutes pour former les complexes.

Ajouter le mélange de transfection à la plaque et agiter doucement la plaque de culture pendant une minute pour répartir uniformément le mélange de transfection. Pour récolter les cellules par trypsinisation, remplacez le milieu de culture par un millilitre de trypsine EDTA et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieux supplémentés par FBS.

Pour chaque plaque de cellules, transférer la suspension cellulaire dans deux tubes de microcentrifugation avec des aliquotes égales et centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Après la centrifugation, remettez en suspension la pastille cellulaire d’un tube dans un millilitre de PBS pour le séquençage, et dans un autre tube, avec du PBS glacé pour l’immunoblot. Le test Immunoblot a été effectué pour comparer l’expression de CAS9 dans les cellules HFK non transfectées et transectées.

Les résultats montrent que les cellules HFK non transfectées et transectées ont exprimé une quantité similaire de CAS9, ce qui indique que l’efficacité de la transfection est similaire entre deux lignées cellulaires. Des images microscopiques par immunofluorescence de l’histone phosphorylée H2AX S139 dans des cellules transfectées sgRNA/CAS9 et un contrôle non transfecté ont été obtenues. Les résultats ont indiqué que deux cassures double brin ont été induites par CAS9 SgRNA.

Les variations génomiques ont été regroupées par types d’événements mutationnels dans HFK LXSN et HFK 8E6, où chaque groupe de variations génomiques et le nombre total de variations ont été comparés entre HFK LXSN et HFK 8E6. Les résultats ont montré que le 8E6 augmente les variations génomiques dans les 200 kilobases autour des cassures double brin induites par CAS9, ce qui indique que le VPH 8E6 déréglemente la réparation de la rupture double brin et augmente l’instabilité génomique. Le but de l’immunoblot est de mesurer l’efficacité de la transfection, ce qui doit être pris en compte lors de l’analyse des données.

En plus de l’efficacité de la transfection, la microscopie à immunofluorescence pourrait être utilisée pour confirmer l’induction de rupture double brin en utilisant le phospho-H2AX comme marqueur. Nous utilisons le HPV 8E6 bêta comme exemple. Cette technique peut être utilisée pour détecter les changements dans la fréquence ou le type de mutation causés par d’autres réactifs tels que les inhibiteurs de petites molécules.