Sectionnement optique et visualisation du disque intervertébral du développement embryonnaire à la dégénérescence

La dégénérescence du disque intervertébral entraîne un degré élevé de déficience et de douleur. Notre protocole nous permet d’étudier morphologiquement le développement du disque et ses changements dans la dégénérescence. Le réseau dense de collagène de type un rend généralement difficile l’analyse du disque intervertébral par microscopie.

Avec la section optique, nous pouvons étudier l’arrangement 3D des chondrocytes dans les différents tissus. Commencez par placer des échantillons de disque intervertébral ou de DIV obtenus par voie peropératoire dans du DMEM complété par 2% volume par volume de pénicilline-streptomycine et 1,2% volume par volume d’amphotéricine B, immédiatement après le prélèvement, stockez les échantillons de DIV à quatre degrés Celsius jusqu’à un traitement ultérieur. En cas de congélation, décongelez les échantillons de DIV humains à température ambiante et identifiez l’origine du tissu DIV humain en fonction de propriétés microscopiques telles que la densité et l’orientation du collège.

Pour recueillir le tissu du disque bovin, prenez le segment de mouvement constitué du DIV avec ses deux vertèbres adjacentes et à l’aide d’une lame chirurgicale numéro 15, disséquez tout le disque bovin de l’os sous-chondral, retournez le disque pour atteindre les zones centrées. Après avoir identifié les différentes zones du cartilage, utilisez une lame chirurgicale numéro 20 ou 22 pour découper la zone d’intérêt de l’ensemble du disque. Les DIV d’embryons de bovins d’une longueur couronne-croupe inférieure à 20 centimètres doivent être traités sans dissection.

Réalisation de la décalcification du tissu comme décrit dans le manuscrit. Confirmez la réussite de la décalcification, si une aiguille de calibre 20 pénètre dans le tissu discale ou, le cas échéant, dans les vertèbres sans résistance notable. Exactement les échantillons de tissus dans le volume décuplé de solution de formaldéhyde à 4% dans le PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, placez le tissu dans un milieu d’incorporation soluble dans l’eau sur le bouton Cryotome, de sorte qu’un plan axial ou un plan perpendiculaire coupe le collagène de type un normalement est généré. Utilisez le cryotome standard pour découper le tissu incorporé à une épaisseur de 70 micromètres dans des échantillons humains et de 40 micromètres dans des échantillons bovins. Recueillir les sections sur une lame de verre avant de rincer les sections trois fois avec du PBS, ajouter un colorant fluorescent approprié suivi du support de montage et recouvrir les sections avec un couvercle.

Placez une lame avec une section de tissu de coloration sur le porte-échantillon du microscope à floraison en démarrant le dispositif d’éclairage de la structure pour effectuer une imagerie à champ de vision unique avec des filtres fluorescents et un éclairage adéquat. À l’aide d’un logiciel d’optimisation d’image compatible avec le microscope à floraison, traitez les images en optimisant l’intensité et la luminosité. Pour visualiser la section dans son ensemble, utilisez la technique d’imagerie mosaïque en ouvrant les 60 paramètres d’acquisition à partir du panneau de la barre d’outils et en ajustant les paramètres de mosaïque dans le registre des mosaïques.

Pour ce faire, définissez le nombre de colonnes et de lignes d’images de champ de vision qui seront ensuite fusionnées en une seule image de vue d’ensemble, appuyez sur configuration et ajustez la correction de mise au point de chaque vignette. Post-traiter les images en optimisant l’intensité et la luminosité. Pour analyser l’organisation spatiale des chondrocytes, utilisez la fonction 3D intégrée dans le logiciel en ajustant les paramètres de la pile Z avec le bouton start/stop, définissez les paramètres de balayage tels que les positions de départ et d’arrêt dans l’axe Z et la distance de la tranche.

Identifiez les modèles cellulaires individuels et utilisez un plugin de comptage cellulaire pour l’analyse quantitative des modèles cellulaires, calculez la densité cellulaire en divisant les cellules comptées par la taille de la région d’intérêt choisie. L’architecture de l’IVD avec son réseau dense de fibres de collagène dans l’anneau et le noyau plus mou peut être reconnue dans les images en mosaïque prises dans le plan axial et sagittal. Dans les zones agrandies des images en mosaïque, différents modèles d’organisation spatiale des chondrocytes tels que des cellules individuelles, des paires et des chaînes ont été remarqués.

L’étude des différents stades de développement et de maturation de la fibrose annulaire bovine a montré une diminution continue de la densité cellulaire au cours du développement du disque embryonnaire. D’autre part, une augmentation de la densité cellulaire et la formation d’amas ont été observées dans le disque humain adulte au cours de la dégénérescence. La densité cellulaire dans les premiers stades du développement du DIV dans la fibrose annulaire bovine et le noyau pulpeux bovin a diminué rapidement jusqu’à la naissance.

Par l’imagerie par canal de l’IVD avec l’Epitome a permis de visualiser l’architecture 3D des modèles spatiaux tels que le cytoplasme et le noyau, dans le DIV intact unique ainsi que des paires de chondrocytes ont été repérés. Alors que dans les amas de cellules anulus dégénérées ont été trouvés. La partie la plus difficile consiste à attribuer le tissu à son origine et à corriger l’incorporé pour le sectionnement.

Ceci est essentiel pour obtenir des résultats fiables. Le fait d’avoir correctement disséqué et sélectionné des tissus DIV de différents stades et origines nous permet d’approfondir l’analyse par d’autres analyses biochimiques et biomécaniques, telles que l’ELISA ou la microscopie à force atomique.