Activation et conjugaison de polysaccharides solubles à l’aide de tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine (CDAP)

Les polysaccharides sont peu immunogènes à moins d’être liés aux protéines et doivent être activés pour la dérivatisation ou la conjugaison aux protéines. Dans cette méthode, le CDAP est utilisé comme réactif de moulage de sable. Le CDAP active les hydroxyles polysaccharidiques pour la dérivatisation ou pour être liés à des protéines pour une utilisation dans les vaccins ou les réactifs de diagnostic.

Le CDAP a largement remplacé le bromure de cyanogène en tant que réactif de moulage de sable polysaccharidique. Le CDAP est plus simple à utiliser, plus efficace et peut être utilisé à un pH inférieur à celui du bromure de cyanogène. C’est un réactif d’activation bien meilleur.

CdAP peut être utilisé avec la plupart des polysaccharides, contrairement à l’amination réductrice, qui nécessite des hydroxyles vicinaux. La chimie peut être utilisée pour conjuguer directement et indirectement aux protéines, et elle peut être utilisée pour fabriquer des réactifs de diagnostic. La réaction d’activation du CDAP, telle que décrite à l’origine, était très rapide et difficile à contrôler.

Le protocole fourni ici rend la chimie beaucoup plus facile à effectuer et beaucoup plus reproductible. Avant de commencer l’expérience, ajustez le pH de la solution de polysaccharide à 9 en ajoutant 200 microlitres de solution stock de diméthylaminopyridine de manière goutte à goutte tout en remuant. Gardez la réaction au frais dans un bain-marie pendant tout le processus d’activation.

Procéder à l’activation du cyano-diméthylaminopyridine-tétrafluoroborate ou du CDAP en transférant 100 microlitres de CDAP dans la solution de polysaccharides pendant l’agitation. Démarrez la minuterie et surveillez le changement de pH pendant toute l’activation pendant 15 minutes. Maintenez la réaction au pH cible en ajoutant rapidement 10 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire.

Lorsque le temps d’activation optimal est atteint, ajouter deux millilitres de dihydrazide adipique de 0,5 molaire en une seule fois au polysaccharide activé. Vérifiez que le pH est dans la plage requise pour la fonctionnalisation de l’hydroxyde. Après agitation continue du mélange réactionnel pendant au moins une heure, transférer le mélange réactionnel à quatre degrés Celsius.

Pour réduire la concentration d’ADH du produit, dialysez la solution de polysaccharide dérivatisée brute à l’aide du dispositif de dialyse. Récupérez le polysaccharide dérivé de la dialyse et déterminez la concentration des polysaccharides et de l’hydrazide pour calculer le rapport hydrazide/polysaccharide. Préparer un milligramme par millilitre de solution polysaccharidique non modifiée à utiliser comme étalon.

Préchauffez le bloc chauffant à 140 degrés Celsius pendant au moins une heure pour obtenir une température uniforme stable. Utilisez un coussin de protection sous et autour du bloc chauffant en cas de déversement d’acide. Ajouter des volumes variables d’un milligramme par millilitre de glucides standard aux tubes à essai 13 par 100 borosilicates étiquetés en trois exemplaires et augmenter le volume à 100 microlitres avec de l’eau pour atteindre les concentrations standard souhaitées.

De même, mettez en place des tests d’échantillon en ajoutant un volume contenant cinq microgrammes du polysaccharide dérivé à trois tubes d’échantillonnage. Ajouter 100 microlitres de six milligrammes par millilitre de résorcinol fraîchement préparés à chaque tube. À l’aide d’un pipetter répétitif, ajoutez 300 microlitres d’acide sulfurique à 75% préparé à chaque tube, vortexez vigoureusement les tubes en pointant le tube, puis placez tous les tubes dans un bloc chauffant à un rythme régulier dans l’ordre séquentiel et réglez immédiatement la minuterie pendant trois minutes.

À trois minutes, retirez les tubes dans le même ordre et placez-les directement dans une grille dans un bain-marie. Retirez les tubes glacés pour leur permettre de s’équilibrer à la température ambiante pendant cinq minutes. Lisez l’absorbance de tous les tubes sur un spectrophotomètre UV-Vis à 430 nanomètres à l’aide d’une cuvette de 10 millimètres de longueur de trajet.

Pour mettre en place des réactions de dosage, triez et disposez les tubes standard étiquetés dans le rack de tubes par ordre de concentration croissante. À l’aide d’une micropipette calibrée, ajoutez 100 microlitres des étalons à chaque tube correspondant. Pour l’étalon zéro, utilisez 100 microlitres du tampon d’échantillon.

De même, préparez et disposez les tubes d’échantillonnage. Ensuite, à l’aide d’une micropipette calibrée de 1 000 microlitres, ajoutez 875 microlitres de tampon d’essai à tous les tubes d’essai. Pour commencer la réaction d’essai, ajoutez 25 microlitres d’acide trinitrobenzène sulfonique à 1% à chaque tube d’essai dans l’ordre prédéterminé dans les cinq minutes.

Vortex les tubes d’essai pendant deux secondes à grande vitesse, en s’assurant que le liquide tourbillonne à une hauteur d’un demi-pouce de l’ouverture du tube. Enregistrez l’heure de début du test et réglez la minuterie sur deux heures. Placez ensuite le porte-tubes d’essai dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures.

Lorsque le temps est terminé, vortex les tubes et procéder à la collecte de données. L’ADH dextran a été analysé pour le dextran à l’aide du dosage de l’acide sulfurique résorcinol. Un tube standard typique utilisant le glucose comme étalon de sucre a été tracé.

La teneur en hydrazide du polysaccharide dérivé ou du dextran a été déterminée à l’aide du test TNBS. Le niveau de dérivatisation a été calculé en hydrures par 100 kilodaltons de dextran pour faciliter la comparaison entre polymères de différents poids moléculaires moyens. Le protocole décrit ici peut devoir être adapté pour un polysaccharide spécifique.

La chimie CDAP peut être utilisée pour fonctionnaliser les polysaccharides pour une utilisation avec une grande variété de réactifs de conjugaison. Il peut être utilisé, par exemple, pour biotinyler les polysaccharides pour une utilisation dans les ELISA. Les protéines peuvent être directement liées aux polysaccharides activés par le CDAP, mais cela nécessite généralement une certaine optimisation pour un polysaccharide spécifique.

Le rendement de conjugaison peut être supérieur à 75%L’utilisation de la chimie CDAP a permis des vaccins conjugués à faible coût, comme ceux fabriqués, par exemple, par le Serum Institute of India.