Préparation d’échantillons à l’analyse bioinformatique de la méthylation de l’ADN: stratégie d’association pour l’obésité et les études sur les traits connexes

Les technologies omiques à grande échelle sont de plus en plus utilisées dans les études axées sur l’obésité. L’épigénétique peut être un lien entre l’exposition et les résultats pour la santé. Ce type d’étude génère une énorme quantité de données.

Compte tenu de cela, il est important de normaliser les protocoles afin de rendre les données techniquement comparables. Dans cette étude, nous allons proposer un pipeline afin d’obtenir et d’analyser des données de méthylation de l’ADN. Le même protocole peut être appliqué pour les versions 400K et epic.

Premier jour: Traitement au bisulfite. Commencez par dénaturer l’ADN génomique, puis ajoutez les réactifs de conversion. Il est nécessaire de suivre les recommandations du kit.

Et traiter l’ADN dénaturant avec du bisphosphate. Ensuite, incubez les échantillons dans un cycleur thermique. Effectuez les étapes de lavage à l’aide du tampon de lavage.

Deuxième jour: Amplification après le test de méthylation, protocole manuel. Préchauffer le four d’hybridation à 37 degrés Celsius et laisser la température s’équilibrer. Disperser 20 microlitres de MA1 dans les puits de la plaque.

Transférer quatre microlitres de l’ADN vers les puits correspondants sur la plaque. Disperser quatre microlitres de solution d’hydroxyde de sodium dans les puits à plaques. Scellez la plaque avec un joint en plastique.

Vortex la plaque pour mélanger les réactifs avec des échantillons. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Dispersez 68 microlitres de RPM dans chaque puits, puis 75 microlitres de MSM sans retirer la solution précédente.

Utilisez un nouveau joint pour couvrir la plaque. Vortex la plaque pendant une minute. Incuber dans le four d’hybridation pendant 20 à 24 heures à 37 degrés Celsius.

Troisième jour: Hybridation suivant le test de méthylation, protocole manuel. Préchauffez le bloc en insérant la plaque à 37 degrés Celsius. Retirez soigneusement la plaque du four d’hybridation.

Centrifugez par impulsions la plaque. Retirez le joint de la plaque. Ajoutez 50 microlitres de FMS à chaque récipient d’échantillon.

Vortex la plaque pendant une minute. Centrifugez la plaque a besoin. Placez ensuite la plaque scellée sur le bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ajouter 100 microlitres de PM1 à chaque puits contenant des échantillons. Scellez à nouveau la plaque. Vortex la plaque pendant une minute.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, pulsez dans la centrifugeuse pendant une minute, puis ajoutez 300 microlitres de 100%2-propanol à chaque puits avec l’échantillon. Scellez à nouveau la plaque.

Mélanger tout le contenu en inversant la plaque au moins 10 fois. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, puis centrifuger à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirez le joint de la plaque.

Inverser rapidement la plaque à un endroit approprié, en jetant le surnageant. Appuyez fermement plusieurs fois jusqu’à ce que vous remarquiez que tous les puits sont exempts de liquide. À température ambiante, laissez l’assiette à l’envers et à découvert pendant une heure.

Après avoir séché tout le liquide, il est nécessaire de voir des palettes bleues au fond des puits. Ajoutez ensuite 46 microlitres de RA1 à chaque puits. Appliquez le joint thermique sur la plaque.

Tenez-vous bien pour effectuer l’étanchéité uniformément. Mettez la plaque dans le four d’hybridation à 48 degrés Celsius pendant une heure, puis vortex pendant une minute. Pulsez dans la centrifugeuse et chauffez la plaque à 95 degrés Celsius pendant une heure.

Préparez les chambres BeadChip Hyb ensemble. Dans cette étape suivante, dispersez 400 microlitres de PB2 dans les réservoirs des chambres Hyb. Après avoir rempli les réservoirs de la chambre Hyb avec du PB2, mettez le couvercle immédiatement.

Chargez soigneusement chaque échantillon de la plaque dans l’entrée de l’échantillon du microréseau. Chargez les inserts de la chambre Hyb contenant les microréseaux dans la chambre Hyb. Fermez la chambre Hyb transversalement pour éviter un éventuel déplacement de la chambre Hyb.

Quatrième jour: Coloration après le test de méthylation, protocole manuel. Après l’incubation nocturne, retirez tous les microréseaux des inserts. Et lavez les microréseaux lentement et légèrement, un total de 10 fois, de haut en bas.

Déplacez les microréseaux vers le conteneur PB1 numéro deux et répétez 10 fois, de haut en bas. Placez les cadres de la chambre d’écoulement dans la bonne position, puis chaque microréseau. Utilisez une entretoise transparente en haut de chacune.

La barre d’alignement doit être positionnée sur l’accessoire d’alignement. Une plaque arrière en verre doit être placée sur le dessus de l’entretoise. Fixez ensuite des pinces métalliques aux chambres d’écoulement.

Utilisez des ciseaux pour couper les extrémités des entretoises de la chambre d’écoulement. Placez la chambre d’écoulement avec le microréseau dans le rack de la chambre. Pipette 150 microlitres de RA1.

Incuber pendant 30 minutes et répéter cinq fois. Pipette 450 microlitres de XC1, et incuber pendant 10 minutes. Pipette 450 microlitres de XC2 et incubation pendant 10 minutes.

Pipette 200 microlitres de TEM. Incuber pendant 15 minutes. Pipette 450 microlitres de formamide à 95%.

Incuber pendant une minute, en répétant deux fois. Incuber pendant cinq minutes. Pipette 450 microlitres de XC3.

Incuber pendant une minute et répéter. Dans cette étape, les réactifs suivants seront distribués, 250 microlitres de STM, 450 microlitres de XC3 et 250 microlitres de ATM. Effectuez le schéma de répétition suivant.

Après toutes les répétitions et les incubations, placez les microréseaux sur une grille debout et trempez-les dans le récipient de lavage. Se déplacer lentement et légèrement avec des mouvements de haut en bas, 10 fois. Séchez les microréseaux à l’aide du dessiccateur à vide pendant 50 à 55 minutes.

Une fois les microréseaux séchés, procédez à l’image du microréseau avec le scan. Dans cette image, nous pouvons voir tous les protocoles utilisés, du choix des participants au traitement des fichiers IDAT obtenus le dernier jour de l’expérience de méthylation. Les fichiers ont été transférés sur l’ordinateur où l’analyse bioinformatique a été effectuée.

L’analyse a été traitée à l’aide de R Studio et du boîtier ChAMP bioconducteur. Assurez-vous d’avoir au moins huit gigaoctets de RAM sur votre ordinateur. D’autres analyses bioinformatiques, telles que l’enrichissement des gènes, ont été effectuées pour mieux présenter les données au lecteur.

Dans ce tableau, nous pouvons observer les deux groupes utilisés dans cette étude, obèses et non obèses. Il y avait une différence entre les groupes pour les variables, l’indice de masse corporelle, la circonférence abdominale, la masse grasse en kilogrammes et la masse grasse en pourcentage. En observant le schéma présenté dans cette figure, nous avons pu comprendre que le protocole proposé était adéquat pour nos données.

Et après l’analyse bioinformatique, un total de 409 887 sondes ont été présentées après la réalisation du filtre. Le diagramme de densité a révélé que tous les échantillons avaient des densités similaires de distribution bêta. Aucun échantillon n’a été exclu sur la base de ces analyses.

L’analyse de décomposition de la valeur singulière des données normalisées a révélé que l’IMC, le double C et le FM influençaient de manière significative la variabilité des données de méthylation de l’ADN. L’estimation du type cellulaire a révélé que les cellules tueuses naturelles, les cellules NK et B étaient plus élevées chez les femmes obèses. Les niveaux de méthylation de l’ADN entre les femmes obèses et non obèses étaient différents avant et après la correction du type cellulaire.

Avant la correction, 43 463 positions de méthylation différentes ont été observées. Et après cela, 3 329 CPG sont restés significativement. Au total, 162 CPG étaient hypométhylés et 576 étaient hyperméthylés chez les obèses par rapport aux non-obèses.

Les données sont disponibles dans la base de données GEO sous le code d’enregistrement GSE166611. Nous présentons les sites de CPG qui ont été associés aux caractéristiques spécifiques des participants qui ont été observées dans SVD. Pour la masse grasse, 13 222 sites de CPG ont été trouvés.

Il y avait 6 159 CPG liés à la masse grasse dans la région promotrice. 470 hypométhylés et 94 hyperméthylés. Les gènes respectifs des sites associés ont été enrichis et sont maintenant montrés.

Nous avons observé que le protocole proposé est capable d’identifier vos modèles de méthylations, et il est juste de se rapporter à vos méthylations. Notre résultat confirme qu’un mode de vie obésogène peut favoriser des changements épigénétiques dans l’ADN humain.