Test d’activation basophile pour le diagnostic des allergies

Le test d’activation des basophiles est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE qui se sont révélées utiles pour les réactions induites par des médicaments, des aliments ou des inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique. Ce test est basé sur la détermination de la réponse basophile à un allergène ou à un médicament réticulant l’activation des IgE par la mesure des marqueurs d’activation par cytométrie de flux. Le test d’activation des basophiles peut être un outil utile et complémentaire pour éviter les tests de provocation contrôlés afin de confirmer le diagnostic d’allergie, en particulier chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger.

De plus, ce test a l’avantage de pouvoir analyser la réponse contre n’importe quel médicament ou allergène par rapport à d’autres méthodes in vitro qui ne sont disponibles que pour quelques médicaments et allergènes. Les principales limites du test sont liées à une sensibilité non optimale, en particulier dans l’allergie médicamenteuse. La nécessité d’effectuer le test au plus tard 24 heures après l’extraction de l’échantillon et le manque de normalisation entre les laboratoires et les algorithmes de diagnostic.

Commencez par recueillir le sang périphérique dans des tubes héparinisés de neuf millilitres et placez les échantillons dans un rotor pour les maintenir à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient requis pour le protocole expérimental. Étiquetez deux tubes de cytomètre de cinq millilitres chacun pour le contrôle négatif et le contrôle positif. Étiquetez également un tube chacun pour les différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments testés.

Placez ensuite les tubes dans une grille afin qu’ils s’adaptent parfaitement sans glisser. Pour le premier contrôle positif, préparer une solution à quatre micromolaires de N-Formylméthionyl-leucyl-phénylalanine ou fMLP dans 0,05% PBS-T Pour confirmer la qualité des basophiles. Pour le deuxième témoin positif, préparer une solution anti-IgE de 0,05 milligramme par millilitre en utilisant PBS-T.

Préparez le mélange de coloration en ajoutant un microlitre chacun d’anticorps CCR3-APC, CD203c-PE et CD63-FITC par 20 microlitres du tampon de stimulation. Ajoutez ensuite 23 microlitres de ce mélange de coloration à chaque tube. Ajouter 100 microlitres de PBS-T aux tubes de contrôle négatif.

Ajouter 100 microlitres de fMLP à l’un des tubes de contrôle positif et ajouter 100 microlitres d’anti-IgE E à l’autre au reste des tubes. Ajouter 100 microlitres des différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajoutez doucement 100 microlitres de sang dans chaque tube pour éviter l’hémolyse.

Ensuite, tourbillonnez doucement les tubes et incuberez-les pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius dans le bain thermostatique à agitation moyenne. Gardez les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins cinq minutes pour arrêter la dégranulation. À chaque tube, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse pour lyser les érythrocytes.

Vortex chaque tube, puis incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Centrifuger les tubes à 300 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, renversez le rack dans l’évier pour décanter le surnageant pendant que les cellules restent au fond des tubes.

Ajoutez trois millilitres de PBS-T à chaque tube pour laver les cellules et vortex les tubes. Effectuez un deuxième cycle de centrifugation en utilisant le même ensemble de paramètres et décantez le surnageant en renversant le rack dans l’évier. Ensuite, conservez les échantillons à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à la cytométrie en flux.

Connectez le cytomètre en flux au logiciel informatique et attendez que le cytomètre soit prêt. Chargez les paramètres du modèle et de l’instrument comme décrit dans le manuscrit texte. Démarrez le processus d’acquisition d’échantillons.

Pour sélectionner les basophiles activés, commencez par ouvrir les lymphocytes à partir du diagramme de diffusion latérale. Ensuite, les basophiles de la population lymphocytaire sont des cellules CCR3 + CD203c + et acquièrent au moins 500 basophiles par tube. Régler le seuil CD63 à environ 2,5 % à l’aide des tubes témoins négatifs et analyser les échantillons.

Les réactions d’hypersensibilité dépendantes des IgE ont été étudiées en effectuant un test d’activation des basophiles, ou MTD, à l’aide d’allergènes et de médicaments. La sensibilité aux basophiles a été analysée en mesurant la réactivité à plusieurs concentrations décroissantes d’allergènes qui aident à déterminer la concentration allergique qui induit la réponse de 50% de basophiles ou de CE50. Tout d’abord, les lymphocytes ont été fermés à partir du diagramme de dispersion latérale vers l’avant.

Ensuite, les basophiles ont été exclus de la population lymphocytaire sous forme de cellules CCR3 + CD203c +. Ensuite, un diagramme CCR3-CD63 a été utilisé pour analyser l’activation basophile en utilisant CD63 comme marqueur d’activation pour deux médicaments et différentes concentrations d’un allergène. Le test est effectué avec du sang total frais et doit être effectué au plus tard 24 heures après l’extraction du sang.

Le stimulus utilisé dans le test ne doit pas inclure d’excipients et les caractéristiques chimiques des médicaments doivent être prises en compte. Autres méthodes in vitro supplémentaires pour le diagnostic des réactions allergiques médiées par les IgE, ou la détermination des IgE, ou le test de libération d’histamine.