Name: Test d’activation basophile pour le diagnostic des allergies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Découvrez le test d'activation basophile pour diagnostiquer les allergies IgE-médiées par cytométrie en flux. Cette méthode in vitro permet d'évaluer les réactions aux médicaments et allergènes sans tests de provocation.

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Nous remercions Claudia Corazza pour son précieux soutien en anglais. Ce travail a été soutenu par l’Institut de Santé ''Carlos III'' (ISCIII) du MINECO (subvention cofinancée par le FEDER: « Una manera de hacer Europa »; Subventions n° PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 et RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministère régional andalou de la Santé (subventions nos PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID est chercheur clinique (B-0001-2017) et AA détient un contrat postdoctoral senior (RH-0099-2020), tous deux soutenus par le ministère régional de la Santé d’Andalousie (cofinancé par ESF: « Andalucía se mueve con Europa »).

L’exécution du protocole a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique local (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Espagne). Tous les sujets ont été informés oralement de l’étude de recherche et ils ont signé le formulaire de consentement éclairé correspondant.
NOTE: Le présent protocole détaille la procédure MTD que les auteurs utilisent quotidiennement. Cependant, il ne s’agit pas d’une méthode normalisée et il existe des différences avec les procédures publiées par d’autres auteurs. Les principales modifications du protocole sont liées à l’utilisation de l’IL-3 dans le tampon de stimulation, au temps d’incubation avec le stimulus, à la méthode d’arrêt de la dégranulation des basophiles et aux stratégies de cytométrie en flux. En outre, les différents kits disponibles dans le commerce pour les MTD comprennent des protocoles spécifiques recommandés par le fabricant.
1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Prélever le sang périphérique dans des tubes héparinisés de 9 mL et maintenir l’échantillon à température ambiante (RT) dans un rotor jusqu’à ce qu’il soit requis pour le protocole expérimental.</li>
	<li>Étiqueter les tubes cytométriques de 5 mL pour les témoins négatifs (2 tubes), les témoins positifs (2 tubes) et les différentes concentrations d’allergène/médicament (1 tube pour chaque concentration d’allergène/médicament testé). Placez les tubes dans une grille où les tubes s’adaptent parfaitement sans glisser.</li>
	<li>Préparer le tampon de stimulation dans de l’eau bidistillée contenant 2 % (v/v) HEPES, 78 mg/L de NaCl, 3,7 mg/L de KCl, 7,8 mg/L de CaCl 2, 3,3 mg/L de MgCl2, 1 g/L de HSA. Ajuster le pH à 7,4 et ajouter l’IL-3 à 2 ng/mL. Préparer habituellement 100 mL et diviser en aliquotes de 2,5 mL à congeler à -20 °C.</li>
	<li>Préparer des témoins positifs dans PBS-Tween-20 0,05 % (v/v) (PBS-T) : Témoin positif 1, N-Formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) (4 μM), pour confirmer la qualité des basophiles; Contrôle positif 2, Anti-IgE (0,05 mg / mL) en tant que témoin positif médié par les IgE.</li>
	<li>Préparer l’allergène/médicament dans le PBS-T à 2x la concentration finale désirée. NOTA : Les concentrations optimales d’allergènes/médicaments à utiliser doivent être préalablement déterminées à l’aide d’une large gamme de concentrations, de courbes dose-réponse et d’études de cytotoxicité suivant les mêmes étapes du protocole139.</li>
</ol>2. Préparation du mélange de coloration
<ol><li>Ajouter des anticorps monoclonaux marqués au fluorochrome dans le tampon de stimulation après la concentration d’anticorps recommandée par le fabricant ou par titrage antérieur des anticorps. Dans ce protocole, nous ajoutons 1 μL de chaque anticorps (CCR3-APC et CD203c-PE pour l’identification des basophiles; CD63-FITC pour l’activation des basophiles)140 par 20 μL de tampon de stimulation. REMARQUE: Protégez la préparation du mélange de coloration de la lumière.</li>
	<li>Ajouter 23 μL de mélange de coloration dans chaque tube.</li>
</ol>3. Stimulation sanguine
<ol><li>Ajouter 100 μL de PBS-T aux tubes 1 et 2 (témoin négatif), 100 μL de fMLP au tube 3, 100 μL d’anti-IgE au tube 4 et 100 μL des différentes concentrations d’allergènes/médicaments aux tubes suivants. Incuber pendant 10 min à 37 °C dans un bain thermostatique à agitation moyenne pour préchauffer les réactifs.</li>
	<li>Ajouter doucement 100 μL de sang dans chaque tube pour éviter l’hémolyse. Tubes tourbillonnants doucement et incuber pendant 25 min à 37 °C dans un bain thermostatique à agitation moyenne.</li>
	<li>Arrêter la dégranulation en maintenant les tubes à 4 °C pendant au moins 5 min. REMARQUE: Le protocole peut être interrompu ici à 4 ° C pendant 30-45 min si nécessaire141,142,143.</li>
</ol>4. Érythrocytes lysant
<ol><li>Ajouter 2 mL de 1x tampon lysant à chaque tube pour lyser les érythrocytes. Vortex chaque tube et incuber pendant 5 min à RT. REMARQUE: Dans cette étape, les cellules sont fixées en raison des agents fixateurs (formaldéhyde) contenus dans le tampon.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Décanter le surnageant, renverser la grille en évier. Les cellules restent au fond des tubes.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de PBS-T à chaque tube pour laver les cellules. Vortex chaque tube.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Décanter le surnageant, renverser la grille en évier. NOTE: Conserver les échantillons à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à l’acquisition du cytomètre en flux.</li>
</ol>5. Acquisition de la cytométrie en flux
<ol><li>Acquérir des échantillons par cytomètre en flux (p. ex., BD FACSCalibur Flow Cytometer). Connectez le cytomètre en flux au logiciel informatique et attendez que le cytomètre soit prêt. Chargez les paramètres du modèle et de l’instrument (Tableau 1).</li>
	<li>Commencez l’acquisition d’échantillons.</li>
	<li>Utilisez les stratégies cytométriques suivantes pour la sélection des basophiles activés139.<ol><li>Grille les lymphocytes à partir du tracé Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).</li>
		<li>Porte les basophiles de la population lymphocytaire sous forme de cellules CCR3 + CD203c +. Acquérir au moins 500 basophiles par tube.</li>
		<li>Affichez un tracé CCR3 - CD63 pour analyser l’activation en utilisant CD63 comme marqueur d’activation. Régler le seuil négatif CD63 à environ 2,5 % à l’aide des tubes témoins négatifs.</li>
		<li>Acquérir tous les échantillons.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La MTD est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE qui s’est avéré utile dans le diagnostic des réactions induites par différents déclencheurs tels que les médicaments, les aliments ou les inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique. En général, la performance des MTD devrait être prise en compte si i) l’allergène/médicament produit des résultats faussement positifs dans le ST; ii) l’allergène ou le médicament n’est pas di...

Le diagnostic d’allergie médiée par les IgE est basé sur les antécédents cliniques, les tests cutanés (ST), la quantification des IgE spécifiques du sérum (IgE) et, si cela est nécessaire et indiqué, les tests de provocation contrôlée (ECC)1,2,3,4,5,6. Cependant, les antécédents cliniques peuvent être peu fiables car il peut y avoir un manque d’informations précises, et les ST et les ECC ne sont pas des procédures sans risque qui peuvent être contre-indiquées chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger 1,2,3,4,5,6 . Ces problèmes, ainsi que le fait que la détermination des sIgE par des immunoessais immunozymatiques validés et commerciaux n’est disponible que pour quelques allergènes et médicaments, ont mis en évidence le rôle important d’autres tests fonctionnels in vitro tels que le test d’activation des basophiles (MTD).
Les basophiles sont des cellules effectrices clés impliquées dans les réactions allergiques médiées par les IgE qui sont activées lors de la réticulation des IgE adjacentes liées aux récepteurs de haute affinité (FcεRI) à la surface des cellules après une exposition à un allergène / médicament. L’activation des basophiles déclenche la dégranulation cellulaire et la libération de médiateurs inflammatoires préformés et nouveaux synthétisés contenus dans les granules de sécrétion intracytoplasmique 7,8,9. La MTD est une méthode in vitro qui tente d’imiter l’activation des basophiles en présence d’un stimulus (allergène ou médicament) et détermine les changements dans l’expression des marqueurs d’activation des basophiles par cytométriede flux 7,10. Il existe différentes stratégies pour identifier les basophiles (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) et pour mesurer l’activation cellulaire (principalement la régulation positive de CD63 et CD203c) à l’aide de combinaisons d’anticorps marqués au fluorochrome 7,10. CD63, le meilleur marqueur d’activationvalidé cliniquement 11,12,13,14, est une protéine membranaire ancrée aux granules sécrétoires contenant de l’histamine qui, après activation cellulaire et fusion des granules avec la membrane, est exprimée à la surface des basophiles 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c est un marqueur de surface qui est exprimé de manière constitutive sur les basophiles et régulé à la hausse après stimulation FcεRI, qui a également montré des résultats fiables dans BAT 15,22,23,24,25. En outre, il semble co-exprimer avec CD6326.
Au cours des dernières décennies, la MTD s’est révélée utile dans le diagnostic des réactions allergiques médiées par les IgE induites par différents déclencheurs tels que les médicaments, les aliments ou les inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique, comme décrit ci-dessous. Cependant, la position de cette technique dans les algorithmes de diagnostic est très variable et mal déterminée.
Hypersensibilité aux médicaments La MTD s’est révélée utile comme test complémentaire pour certains médicaments et patients, en particulier pour ceux qui présentent des réactions graves en raison du fait que la valeur diagnostique du ST n’est pas bien établie pour la plupart des médicaments, car elle est validée et normalisée pour un nombre limité de médicaments27,28,29,30. De plus, la quantification des IgE n’est disponible que pour un nombre limité de médicaments, avec une sensibilité inférieure à ST 27,28,29,30,31,32. Par conséquent, le diagnostic d’hypersensibilité aux médicaments repose généralement sur un test de provocation médicamenteuse, qui peut être contre-indiqué chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vieen danger 33.
Des résultats prometteurs ont été rapportés pour l’utilisation de la MTD chez certains patients signalant des réactions d’hypersensibilité immédiate à différents médicaments tels que les bêtalactamines (BL)20,34,35,36,37,38,39, les agents bloquants neuromusculaires (AMNM)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolones (FQs)46,47,48,49, pyrazolones 50,51,52, produits de contraste radioactif (RCM)53,54,55,56 et composés du platine57,58,59 . On a signalé que la sensibilité et la spécificité des MTD se situaient entre 51,7 et 66,9 % et entre 89,2 et 97,8 %, respectivement; et les valeurs prédictives positives et négatives sont décrites comme variant entre 93,4 % et 66,3 %, respectivement27,31. De plus, la MTD a été proposée comme biomarqueur prédictif des réactions paroxystiques lors de la désensibilisation avec les composés du platine, car l’expression de CD203c est augmentée par rapport à CD63 chez les patients présentant un risque élevé d’effets indésirables lors de la désensibilisation au médicament57.
Il est à noter que la MTD n’est utile dans l’hypersensibilité aux médicaments que lorsque la réaction implique une dégranulation des basophiles; Par conséquent, il n’est pas utile dans les réactions résultant de l’inhibition enzymatique de la cyclooxygénase 142.
Allergie alimentaire La MTD est apparue comme un outil de diagnostic potentiel pour les allergies alimentaires parce que la détermination des IgE sériques dans l’extrait d’allergène entier ou dans un allergène unique est souvent ambiguë, nécessitant une provocation alimentaire orale pour confirmer le diagnostic, ce qui, à l’instar de l’hypersensibilité aux médicaments, est une procédure coûteuse et non sans risque60. Plusieurs études ont montré des résultats pertinents avec le lait de vache 61,62, l’œuf61,63, le blé 64,65,66,67,68, l’arachide 63,69,70,71,72, la noisette 73,74,75,76 ,77, crustacés78, pêches 79,80,81, pomme21, céleri et carotte82,83.
La principale valeur ajoutée des MTD dans le diagnostic des allergies alimentaires par rapport aux ST et aux IgE dans le sérum est qu’elles présentent une spécificité plus élevée et une sensibilité similaire. Ainsi, la MTD est un outil utile pour différencier les patients cliniquement allergiques des sujets sensibilisés, mais tolérants, qui ont à la fois une spécificité élevée (75-100%) et une sensibilité (77-98%)63,69,84. Les valeurs de sensibilité et de spécificité dépendent de l’allergène et d’autres facteurs comme les phénotypes (p. ex. syndrome d’allergie orale par rapport à l’anaphylaxie), l’âge et les profils de sensibilisation liés à la géographie63,85.
Les MTD utilisant des composants allergènes uniques peuvent potentiellement améliorer la précision diagnostique de certains allergènes alimentaires61,80. Des études utilisent des protéines d’entreposage des semences (p. ex. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 et Ara h 6 de l’arachide)86; protéines de transfert lipidique (p. ex. Pru p 3 de la pêche et Ara h 9 de l’arachide)80,86; et les homologues Bet v 1 (par exemple, Ara h 8 de l’arachide)87. D’autres utilités potentielles sont liées à l’identification de l’allergène coupable dans les cas de syndrome d’allergie pollen-alimentaire 21,87,88, d’allergie à la viande rouge 89 ou d’anaphylaxie induite par l’exercice alimentaire66.
Fait intéressant, la MTD peut fournir des informations sur la gravité et le seuil des réactions allergiques puisque les patients présentant des réactions plus graves présentent une plus grande proportion de basophiles activés, comme l’ont observé des études sur des patients allergiques aux arachides et au lait de vache 84,90,91; et les patients réagissant à des traces de l’allergène montrent une plus grande sensibilité aux basophiles 84,90,92. Ces données suggèrent que la MTD pourrait être utile pour identifier les patients allergiques à haut risque qui nécessitent un suivi plus étroit et une éducation plus intensive93. En outre, il a été rapporté que les MTD peuvent prédire les réponses de provocation alimentaire 70,91,92,94 et les seuils de réactivité90,95 pour aider à déterminer quand les aliments peuvent être (ré)introduits en toute sécurité 84. Cependant, ces résultats sont controversés dans certaines études 63,96 et d’autres recherches sont nécessaires.
D’autre part, la MTD a été utilisée pour surveiller la résolution de l’allergie alimentaire, soit naturellement, soit sous traitement immunomodulateur, au fil du temps, qui jusqu’à présent n’a été évaluée que par provocation alimentaire orale, avec les risques et les coûts associés 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107 108. De plus, il a également été utilisé pour surveiller l’effet de l’omalizumab dans les allergies alimentaires, car l’activation des basophiles diminue pendant le traitement par omalizumab, mais elle augmente après l’arrêt du traitement109.
Allergie aux inhalants La MTD est rarement bénéfique dans l’allergie aux inhalants, car le diagnostic peut être systématiquement établi par quantification des IgE et ST. Cependant, dans les cas de rhinite allergique locale (taux indétectables d’IgE et de ST négatifs avec tests de provocation nasale positifs), la MTD a permis le diagnostic dans 50% des cas110. Il a également été rapporté une corrélation entre la sensibilité basophile et la réponse aux tests de provocation nasale / bronchique, ainsi qu’entre la gravité de l’asthme et l’efficacité du traitement par omalizumab111,112.
La MTD a également été utilisée pour surveiller l’immunothérapie allergénique pour les acariens et les pollens, car la sensibilité aux basophiles diminue pendant l’immunothérapie, probablement en raison de l’interférence des anticorps IgGbloquants 113,114,115,116,117.
Allergie au venin d’hyménoptère Le diagnostic de l’allergie au venin d’hyménoptère est systématiquement basé sur les ST et les IgE sériques. La MTD a montré une sensibilité élevée (85-100%) et une spécificité (83-100%) et elle a été rapportée utile dans les cas qui donnent des résultats équivoques ou chez les patients ayant des antécédents cliniques suggestifs d’allergie au venin mais des IgE indétectables et ST118,119 négatives. Cependant, les MTD ne semblent pas être prédictives de la gravité de ces réactions 120 121.
Jusqu’à 60% des patients présentent des IgE à la fois au venin de guêpe et d’abeille, et l’identification de l’allergène dominant est cruciale pour un traitement immunothérapeutique adéquat. Dans ces cas, la MTD a été jugée utile dans l’identification de l’allergène dominant119 122 123 124. Bien que les sIgE aux principaux allergènes des venins d’abeilles et de guêpes puissent réduire l’utilité de la MTD chez les patients présentant une double positivité aux deux venins, elle fournit des informations utiles principalement chez les sujets présentant des résultats négatifs dans les déterminations d’IgE123.
Certaines études suggèrent que la MTD pourrait être utile comme biomarqueur prédictif des effets secondaires pendant la phase d’accumulation de l’immunothérapie au venin, car il a été rapporté que cette option de traitement diminuait la sensibilité aux basophiles. Cependant, la réactivité ne diminue pas et cette utilité BAT est aujourd’hui controversée13 120 125 126 127 128 129 130.
Urticaire et œdème de Quincke Un sous-ensemble de patients atteints d’urticaire chronique ont une physiopathologie auto-inmanne, due aux autoanticorps IgE dirigés contre les autoallergènes et aux autoanticorps IgG qui ciblent les complexes FcεRI ou IgE-FcεRI présents à la surface des mastocytes 131 132. En pratique clinique, le diagnostic de ce type d’urticaire chronique repose sur le ST autologue positif, qui présente un risque d’infection accidentelle. La MTD a été proposée comme test in vitro pour le diagnostic et le suivi des patients suspectés d’urticaire chronique. L’expression de CD63 et CD203c à la surface des basophiles a été signalée comme étant augmentée après stimulation avec des sérums de patients atteints d’urticaire chronique, montrant la détection d’autoanticorps actifs 133,134,135,136,137. Récemment, il a été rapporté que les patients atteints de MTD positive éprouvent souvent l’état pathologique le plus actif, évalué par le score d’activité de l’urticaire, et nécessitent des doses plus élevées d’antihistaminiques associés à des traitements de troisième intention (cyclosporine A ou omalizumab), par rapport à ceux ayant une MTD138 négative.

<table><tbody><tr><td>Tube à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml, sans bouchon, non stérile</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD193 humain (CCR3)</td><td>BioLegend</td><td>310708</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humain CD63 Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>353006</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Solution 10x concentré</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-humain CD203c (E-NPP3) Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>324606</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Souris purifiée Anti-IgE humaine</td><td>BD Biosciences</td><td>555857</td><td></td></tr><tr><td>IL-3 humaine recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Gaine Fluide</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>TUBE 9 mL LH Héparine Lithium</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455084</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

test d’activation basophile pour le diagnostic des allergies

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Le test d’activation des basophiles (MTD) est un test diagnostique in vitro complémentaire qui peut être utilisé en plus des antécédents cliniques, du test cutané (ST) et de la détermination des IgE spécifiques (IgE) dans l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE aux aliments, au venin d’insecte, aux médicaments, ainsi qu’à certaines formes d’urticaire chronique. Cependant, le rôle de cette technique dans les algorithmes de diagnostic est très variable et mal déterminé.
La MTD est basée sur la détermination de la réponse basophile à l’activation des IgE de réticulation allergène/médicament par la mesure de marqueurs d’activation (tels que CD63, CD203c) par cytométrie en flux. Ce test peut être un outil utile et complémentaire pour éviter les tests de provocation contrôlés afin de confirmer le diagnostic d’allergie, en particulier chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger. En général, l’efficacité de la MTD doit être prise en compte si i) l’allergène/médicament produit des résultats faussement positifs dans le ST; ii) il n’y a pas de source d’allergène/médicament à utiliser pour la détermination des ST ou des IgE; iii) il existe une discordance entre les antécédents du patient et la détermination des ST ou des IgE; iv) les symptômes suggèrent que le ST peut entraîner une réponse systémique; v) avant d’envisager un ECC pour confirmer l’allergène ou le médicament coupable. Les principales limites du test sont liées à une sensibilité non optimale, en particulier en cas d’allergie médicamenteuse, à la nécessité d’effectuer le test au plus tard 24 heures après l’extraction de l’échantillon et au manque de normalisation entre les laboratoires en termes de procédures, de concentrations et de marqueurs cellulaires.

La MTD réalisée avec des allergènes ou des médicaments permet d’étudier les réactions d’hypersensibilité dépendantes des IgE. La réactivité basophile doit être mesurée à au moins deux concentrations optimales afin d’obtenir les meilleurs résultats34 et l’activation est visualisée par la régulation positive de CD63 à la surface de la cellule. Dans le cas des allergènes, de plus, pour confirmer la réactivité des basophiles, la sensibilité des basophiles doit être analysée en mesurant la réactivité à...

Le test d’activation des basophiles est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE basé sur la détection de l’activation des basophiles en présence d’un stimulus spécifique par la mesure des marqueurs d’activation par cytométrie en flux.

Test d’activation basophile pour le diagnostic des allergies

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Le test d’activation des basophiles est un test de diagnostic in vitro complémentaire pour l’évaluation des réactions allergiques médiées par les IgE qui se sont révélées utiles pour les réactions induites par des médicaments, des aliments ou des inhalants, ainsi que dans certaines formes d’urticaire chronique. Ce test est basé sur la détermination de la réponse basophile à un allergène ou à un médicament réticulant l’activation des IgE par la mesure des marqueurs d’activation par cytométrie de flux. Le test d’activation des basophiles peut être un outil utile et complémentaire pour éviter les tests de provocation contrôlés afin de confirmer le diagnostic d’allergie, en particulier chez les sujets présentant des réactions graves mettant la vie en danger.De plus, ce test a l’avantage de pouvoir analyser la réponse contre n’importe quel médicament ou allergène par rapport à d’autres méthodes in vitro qui ne sont disponibles que pour quelques médicaments et allergènes. Les principales limites du test sont liées à une sensibilité non optimale, en particulier dans l’allergie médicamenteuse. La nécessité d’effectuer le test au plus tard 24 heures après l’extraction de l’échantillon et le manque de normalisation entre les laboratoires et les algorithmes de diagnostic.Commencez par recueillir le sang périphérique dans des tubes héparinisés de neuf millilitres et placez les échantillons dans un rotor pour les maintenir à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient requis pour le protocole expérimental. Étiquetez deux tubes de cytomètre de cinq millilitres chacun pour le contrôle négatif et le contrôle positif. Étiquetez également un tube chacun pour les différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments testés.Placez ensuite les tubes dans une grille afin qu’ils s’adaptent parfaitement sans glisser. Pour le premier contrôle positif, préparer une solution à quatre micromolaires de N-Formylméthionyl-leucyl-phénylalanine ou fMLP dans 0,05% PBS-T Pour confirmer la qualité des basophiles. Pour le deuxième témoin positif, préparer une solution anti-IgE de 0,05 milligramme par millilitre en utilisant PBS-T.Préparez le mélange de coloration en ajoutant un microlitre chacun d’anticorps CCR3-APC, CD203c-PE et CD63-FITC par 20 microlitres du tampon de stimulation. Ajoutez ensuite 23 microlitres de ce mélange de coloration à chaque tube. Ajouter 100 microlitres de PBS-T aux tubes de contrôle négatif.Ajouter 100 microlitres de fMLP à l’un des tubes de contrôle positif et ajouter 100 microlitres d’anti-IgE E à l’autre au reste des tubes. Ajouter 100 microlitres des différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajoutez doucement 100 microlitres de sang dans chaque tube pour éviter l’hémolyse.Ensuite, tourbillonnez doucement les tubes et incuberez-les pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius dans le bain thermostatique à agitation moyenne. Gardez les tubes à quatre degrés Celsius pendant au moins cinq minutes pour arrêter la dégranulation. À chaque tube, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse pour lyser les érythrocytes.Vortex chaque tube, puis incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Centrifuger les tubes à 300 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, renversez le rack dans l’évier pour décanter le surnageant pendant que les cellules restent au fond des tubes.Ajoutez trois millilitres de PBS-T à chaque tube pour laver les cellules et vortex les tubes. Effectuez un deuxième cycle de centrifugation en utilisant le même ensemble de paramètres et décantez le surnageant en renversant le rack dans l’évier. Ensuite, conservez les échantillons à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à la cytométrie en flux.Connectez le cytomètre en flux au logiciel informatique et attendez que le cytomètre soit prêt. Chargez les paramètres du modèle et de l’instrument comme décrit dans le manuscrit texte. Démarrez le processus d’acquisition d’échantillons.Pour sélectionner les basophiles activés, commencez par ouvrir les lymphocytes à partir du diagramme de diffusion latérale. Ensuite, les basophiles de la population lymphocytaire sont des cellules CCR3 + CD203c + et acquièrent au moins 500 basophiles par tube. Régler le seuil CD63 à environ 2,5 % à l’aide des tubes témoins négatifs et analyser les échantillons.Les réactions d’hypersensibilité dépendantes des IgE ont été étudiées en effectuant un test d’activation des basophiles, ou MTD, à l’aide d’allergènes et de médicaments. La sensibilité aux basophiles a été analysée en mesurant la réactivité à plusieurs concentrations décroissantes d’allergènes qui aident à déterminer la concentration allergique qui induit la réponse de 50% de basophiles ou de CE50. Tout d’abord, les lymphocytes ont été fermés à partir du diagramme de dispersion latérale vers l’avant.Ensuite, les basophiles ont été exclus de la population lymphocytaire sous forme de cellules CCR3 + CD203c +. Ensuite, un diagramme CCR3-CD63 a été utilisé pour analyser l’activation basophile en utilisant CD63 comme marqueur d’activation pour deux médicaments et différentes concentrations d’un allergène. Le test est effectué avec du sang total frais et doit être effectué au plus tard 24 heures après l’extraction du sang.Le stimulus utilisé dans le test ne doit pas inclure d’excipients et les caractéristiques chimiques des médicaments doivent être prises en compte. Autres méthodes in vitro supplémentaires pour le diagnostic des réactions allergiques médiées par les IgE, ou la détermination des IgE, ou le test de libération d’histamine.

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De test d'activation des basophiles est un outil puissant pour la détection des allergies...

Test d&#39;activation des basophiles pour l&#39;enquête des IgE dans les mécanismes d&#39;hypersensibilité médicamenteuse

Des modèles de souris expérimentales de l'asthme allergique offrent de nouvelles possibilités pour l'étude de la pathogenèse des maladies et le développement de nouvelles thérapies. Ces modèles sont bien adaptés à des facteurs de mesure relatives à la réponse immunitaire allergique, inflammation des voies respiratoires, et de la physiopathologie pulmonaire.

Modèle murin de l&#39;asthme induit par les allergènes

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode in vitro pour évaluer le potentiel allergique d’un antigène à induire la dégranulation du basophile. La β-hexosaminidase est utilisée comme indice de libération de médiateurs chimiques, et l’activité enzymatique de la β-hexosaminidase est mesurée à l’aide d’un substrat fluorogène.

Essai de libération d’enzymes médiateurs humanisés : une méthode immunochimique pour dépister le potentiel allergique de l’antigène testé en surveillant la réponse de dégranulation des basophiles in vitro

Dans cette vidéo, nous montrons le test permettant d’évaluer l’activation des basophiles en présence d’un allergène test à l’aide de la cytométrie en flux.

Analyse de l’activation des basophiles en présence d’un allergène de test à l’aide de la cytométrie en flux

Cette vidéo présente un protocole de détection de l’immunoglobuline E spécifique du sérum à l’aide d’un système de chimiluminescence à base de cartouche microfluidique. Les IgE sériques interagissent avec des allergènes distincts immobilisés dans la zone réactionnelle de la cartouche, qui sont ensuite détectés avec des anticorps anti-IgE conjugués à la peroxydase et un substrat chimiluminescent, permettant la détection simultanée de plusieurs IgE spécifiques aux allergènes.

Système de détection à cartouche microfluidique pour l’immunoglobuline E spécifique d’un allergène

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier les particules allergènes chargé par cytométrie de flux. particules de matières particulaires ambiantes peuvent agir en tant que porteurs d'allergènes adsorbées. Nous montrons ici que la cytométrie en flux, une méthode largement utilisée pour caractériser les solides en suspension&gt; 0,5 um de diamètre, peut être utilisé pour mesurer ces particules d'allergène chargé.

Cytométrie en flux Analyse de la particule liée Bet v 1 Allergène en PM10

Ce travail décrit un protocole qui utilise une approche résolue par les composants pour étudier la sensibilisation aux allergènes de pollen de gazon dans une cohorte de patients du sud de la Chine avec une rhinite allergique et / ou de l'asthme.

Une approche de diagnostic résolue par un composant pour une étude sur les allergènes au pollen dans les ressortissants chinois avec la rhinite allergique et / ou l&#39;asthme

Cet article présente un protocole pour la détection des immunoglobulines sériques spécifiques E avec un système de chimiluminescence axée sur la cartouche microfluidique et l’évaluation de son utilité dans le diagnostic de l’allergie.

Application des biopuces microfluidiques technologie pour détecter sérum allergène spécifique immunoglobuline E (sIgE)

Nous présentons ici le test de libération du médiateur, utilisant une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat transfectée avec le récepteur IgE humain, pour simuler la dégranulation des cellules effectrices généralement observées dans les réactions allergiques de type 1. Cette méthode étudie l’activité biologique des allergènes d’une manière très sensible, reproductible et personnalisable.

Test humanisé de libération du médiateur comme lecture de la puissance des allergènes

Un protocole de provocation dans une installation de chambre d’exposition aux allergènes (CEA) est présenté. Les AEC se sont avérés être des outils sûrs et efficaces pour l’induction de symptômes allergiques ou comme critère d’évaluation dans les tests d’efficacité de l’immunothérapie allergénique en raison de leur capacité à maintenir des concentrations de particules et des conditions environnementales stables.

Évaluation des symptômes des patients atteints de rhinite allergique à l’aide d’une chambre d’exposition aux allergènes

Découvrez le test d'activation basophile pour diagnostiquer les allergies IgE-médiées par cytométrie en flux. Cette méthode in vitro permet d'évaluer les réactions aux médicaments et allergènes sans tests de provocation.

Test d’activation basophile pour le diagnostic des allergies

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