Marquage immunofluorescent de protéines de virus végétaux et d’insectes vecteurs dans les intestins d’hémiptères

Ce protocole peut être utilisé pour étudier divers mouvements chez les insectes, les fonctions des protéines d’insectes et les interactions entre le virus et l’insecte vecteur in vivo. Cette méthode est efficace et informative. Les structures de l’intestin de l’insecte et des cellules auxiliaires sont clairement visualisées lorsqu’elles sont visualisées avec la microscopie confocale à balayage laser.

La démonstration de la procédure sera Lu Zhang, PhD de notre laboratoire. Pour commencer, transférez les insectes non virulifères des béchers en verre au virus nain strié noir du riz du sud frais, SRBSDV, des plants de riz infectés recouverts d’un filet à l’épreuve des insectes pendant une période d’accès de deux jours à l’acquisition du virus. Ensuite, collectez les insectes dans des béchers en verre contenant des plants de riz frais.

Après deux jours, collectez les insectes des béchers en verre à l’aide d’un aspirateur manuel pour la dissection et l’excision de l’intestin. Préparer 0,01 molaire PBS, 4% de paraformaldéhyde et 2% Triton X-100 comme décrit dans le manuscrit texte. Utilisez une pipette pour placer 100 microlitres de PBS sur une lame de verre et placez la lame sur la scène d’un microscope optique.

Utilisez un aspirateur manuel pour recueillir les adultes infectés par le SRBSDV dans les béchers en verre et placez-les dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace pour paralyser les insectes. Transférez un adulte paralysé dans les 100 microlitres de PBS sur la lame avec l’abdomen vers le haut. Utilisez une pince à épiler pour serrer le corps et retirez la tête avec une autre pince à épiler.

Avec une pince à épiler, serrez les côtés de l’abdomen et serrez l’ovipositeur ou l’organe copulateur de la queue avec l’autre ensemble, puis tirez délicatement la membrane intersegmentaire d’un segment abdominal pour exposer lentement l’intestin dans l’abdomen. Continuez à arracher la membrane et retirez progressivement l’intestin complet de l’abdomen. Retirez doucement la queue qui est reliée à l’extrémité de l’intestin pour enlever l’intestin complet.

Placez les boyaux excisés dans un tube à centrifuger de 200 microlitres. Ajouter 200 microlitres de PBS dans le tube et utiliser une pipette pour bien laver les tripes. Utilisez une pipette pour placer 100 microlitres de PBS sur une lame de verre et placez la lame sur la scène d’un microscope optique.

Utilisez un aspirateur manuel pour recueillir les nymphes infectées par le SRBSDV dans les béchers en verre et placez-les dans un tube de 1,5 millilitre placé sur de la glace pour paralyser les insectes. Transférer une nymphe paralysée dans les 100 microlitres de tampon sur la lame avec l’abdomen tourné vers le haut. Détachez la queue de la nymphe, puis serrez le corps de l’insecte pour le fixer doucement et utilisez l’autre paire pour serrer la tête.

Éloignez doucement la tête du corps tout en maintenant son attachement à l’intestin afin que la tête soit détachée du corps, mais que l’intestin soit toujours attaché au thorax et à l’abdomen. Avec la pince à épiler toujours en serrant le corps, utilisez l’autre paire pour déplacer la tête avec précaution et retirez progressivement l’intestin. Détachez l’intestin de la tête pour obtenir un intestin intact sans endommager le corps.

Placez les boyaux excisés dans un tube. Ajouter le PBS au tube et aspirer doucement libérer la solution avec une pipette pour bien laver les tripes. Préparer les anticorps et le support de montage comme décrit dans le manuscrit textuel.

Placez les boyaux WBPH fraîchement excisés et lavés au PBS dans 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4% dans un tube centrifuge de 200 microlitres à température ambiante. Après deux heures, remplacez la solution de paraformaldéhyde par 200 microlitres de PBS. Après 10 minutes, retirez le PBS pour éliminer tout paraformaldéhyde et répétez l’étape de lavage PBS deux fois.

Après deux lavages PBS, ajoutez 200 microlitres de détergent non ionique Triton X-100 pour perméabiliser les échantillons à température ambiante. Après 30 minutes, retirez le Triton X-100 et lavez tout détergent restant avec trois lavages de 10 minutes avec du PBS. Diluer les anticorps marqués un à 50 avec 50 microlitres d’albumine de sérum de taureau.

Ajouter les anticorps dilués dans le tube et incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin après avoir retiré l’anticorps, laver le diluant d’anticorps restant avec trois lavages de 10 minutes avec du PBS. Diluer un microlitre de DyLight 633-Phalloïdine avec 50 microlitres de PBS et ajouter 50 microlitres de phalloïdine diluée dans le tube pour une incubation de deux heures à température ambiante.

Après avoir retiré la phalloïdine, lavez soigneusement la phalloïdine restante avec trois lavages de 10 minutes avec du PBS. Placez une goutte de support de montage contenant du DAPI sur une lame de microscope. Transférer les boyaux dans le milieu et placer délicatement le verre de couverture sur l’échantillon sans créer de bulles.

La micrographie confocale représentative à balayage laser des intestins WBPH excisés d’adultes après marquage à la phalloïdine a montré trois sections: l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur. Parmi ceux-ci, l’intestin moyen est le site d’infection initial du SRBSDV. La structure cellulaire épithéliale monocouche de l’intestin facilite l’étude de la localisation cellulaire des protéines d’insectes et la colocalisation des protéines virales et des insectes.

Les intestins WBPH excisés avec DyLight 488 marqué anti-VAMP-7 et les virions SRBSDV avec anticorps anti-SRBSDV marqués DyLight 549 sont présentés ici. Il a été démontré que les virions VAMP-7 et SRBSDV co-localisent dans le cytoplasme, ce qui suggère que VAMP-7 pourrait jouer un rôle dans la transmission du virus in vivo. Les intestins perméabilisés doivent être soigneusement nettoyés après l’incubation avec des anticorps conjugués à la luciférine afin de réduire le bruit de fond et la liaison non spécifique.

Il s’agit d’une méthode fiable pour visualiser la localisation du virus, d’autres agents pathogènes et des protéines d’insectes chez les insectes. Il fournit la base pour d’autres études de la relation entre les agents pathogènes et les insectes.