Visualisation et quantification de la signalisation TGFβ/BMP/SMAD dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay

Ce protocole permet aux scientifiques de comparer quantitativement le nombre de complexes de facteurs de transcription dans différentes conditions de stress de cisaillement et sera bénéfique pour la recherche en biologie vasculaire. Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de canaux d’écoulement microfluidiques qui permettent d’étudier plusieurs paires d’anticorps, y compris les contrôles respectifs simultanément. Pour commencer, enduisez la lame à six canaux en ajoutant 0,1% de gélatine pour la peau porcine préparée dans le PBS dans les canaux pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Videz les canaux de la solution de gélatine et ensemencez Huvecs dans les lames précodées à six canaux à une densité de 2,5 fois 10 à la sixième cellule par millilitre dans 30 microlitres de milieu complet M199. Laissez les cellules adhérer pendant une heure à 37 degrés Celsius dans l’incubateur humidifié. Ajouter 60 microlitres de milieu complet M199 pré-averti à chacun des réservoirs.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux jours dans un incubateur humidifié avec remplacement du milieu après 24 heures. Montez le tube de silicium sur les unités fluidiques, remplissez les réservoirs avec un minimum de 10 millilitres de milieu complet M199 pré-averti. Connectez les unités fluidiques avec des tubes au système de pompe et effectuez le pré-fonctionnement sans cellules pour équilibrer le fluide et éliminer tout l’air restant.

Connectez les canaux simples sur la glissière à six canaux à l’aide du tube de connexion série. Connectez le premier et le dernier canal de la glissière aux tubes montés sur l’unité fluidique. Pour l’exposition des cellules à des niveaux élevés de stress pur, augmentez le stress pur en fonction des phases d’adaptation, en définissant les étapes par incréments de cinq dynes par centimètre carré toutes les 30 minutes.

Utilisez les touffes sur le tube pour détacher les glissières des pompes après l’exposition aux contraintes de cisaillement du fluide, en évitant les déversements moyens dans l’incubateur et en transférant les glissières d’écoulement sur la glace. Tout en détachant le tube des réservoirs, utilisez le doigt pour fermer l’autre côté du réservoir afin d’éviter de piéger les bulles d’air dans le canal. En gardant la glissière d’écoulement sur la glace, aspirez soigneusement le milieu des réservoirs, mais pas du canal où résident les cellules.

Lavez les échantillons avec 90 microlitres de PBS stérile à froid en ajoutant du PBS à un réservoir et aspirez soigneusement de l’autre réservoir, puis répétez pour tous les canaux. Fixez les cellules en ajoutant 90 microlitres de solution tamponnée de PFA à 4% au même réservoir où le PBS a été ajouté et aspirez le liquide de l’autre réservoir comme démontré. Après avoir fixé les cellules dans les six canaux, transférez les échantillons de la glace à la température ambiante et incubez pendant 20 minutes.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS en ajoutant du PBS à un réservoir et en l’aspirant soigneusement de l’autre réservoir dans tous les canaux, en prenant soin de ne pas dessécher les canaux. Étancher l’accès PFA en ajoutant 90 microlitres de chlorure d’ammonium ambiant de 15 millimolaires préparé dans du PBS à l’un des réservoirs. Aspirer de l’autre réservoir et incuber les cellules pendant 10 minutes.

Perméabiliser les cellules en ajoutant 90 microlitres de 0,3% de Triton X 100 préparés en PBS dans le réservoir vide. Aspirer de l’autre réservoir pour chaque canal et incuber pendant 10 minutes, puis laver trois fois avec du PBS comme démontré précédemment. À 90 microlitres de solution de blocage stérile de PLA dans un réservoir.

Aspirer de l’autre côté pour chaque canal et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Ajouter des anticorps primaires dans le diluant d’anticorps PLA et le vortex. Aspirer soigneusement la solution bloquante des réservoirs et des canaux.

Ajouter 30 microlitres de la solution d’anticorps primaires immédiatement dans le canal vide en inclinant la lame tout en ajoutant la solution. Répétez pour tous les canaux et incubez à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée pendant la nuit ou à 37 degrés Celsius pendant une heure. Diluer moins lapin et plus souris PLA sonde de un à cinq dans le diluant d’anticorps PLA.

Lavez tous les canaux deux fois en ajoutant 90 microlitres de tampon de lavage A et en aspirant comme démontré. Après avoir aspiré le tampon de lavage, ajouter 30 microlitres de solution de sonde PLA et incuber dans la chambre humidifiée. Diluer le tampon de ligature un à cinq dans de l’eau ionisée D et diluer l’enzyme lygus un à 40 dans le tampon de ligature dilué.

Après avoir lavé et complètement aspiré le tampon de lavage A, ajoutez 30 microlitres de solution de ligature aux canaux vides tout en inclinant la glissière et incubez dans la chambre humidifiée. Diluer le tampon d’amplification un à cinq dans de l’eau désionisée, puis diluer l’enzyme polymérase un à 80 dans le tampon d’amplification dilué sur glace. Après avoir lavé et complètement aspiré le tampon de lavage A, ajoutez 30 microlitres de solution d’amplification aux canaux vides tout en inclinant la glissière et incubez-la dans la chambre humidifiée.

Diluer le DAPI un à 500 dans le tampon de lavage B et laver tous les canaux une fois en ajoutant 90 microlitres de DAPI contenant le tampon de lavage B, et en aspirant comme démontré pour cuire les noyaux à la vapeur. Ensuite, lavez tous les canaux une fois avec le tampon de lavage B sans DAPI. Diluer le tampon de lavage B un à 10 dans de l’eau désionisée et laver tous les canaux une fois avec 90 microlitres de tampon de lavage dilué B.Après avoir aspiré le tampon de lavage B, ajouter immédiatement deux à trois gouttes du milieu de montage liquide à un réservoir et incliner la glissière pour répartir le support de montage dans tous les canaux.

Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius dans un environnement humidifié jusqu’à l’imagerie. Les Huvecs ont été exposés à un stress élevé et faible. Le faible stress de cisaillement a augmenté les interactions de la protéine SMAD dans le cytosol et les noyaux.

Les contrôles d’anticorps uniques ont montré non à très peu de signaux, prouvant le succès de l’expérience. L’augmentation de la concentration d’anticorps a entraîné un nombre plus élevé d’événements PLA par cellule, mais la différence dans les signaux PLA entre les cellules exposées à un stress pur élevé et faible a été réduite. Les tampons auto-fabriqués pour le blocage et la dilution des anticorps peuvent être utilisés comme alternative aux tampons commerciaux.

La quantification des événements PLA pour les solutions diluantes et bloquantes commerciales et auto-fabriquées a montré le même schéma de signaux PLA dans les zones cytosolique et nucléaire. Cependant, le nombre total d’événements PLA par cellule était plus élevé avec les solutions commerciales. Une combinaison d’anticorps SMAD Two/Three, SMAD Four a été utilisée lorsque l’anticorps SMAD Four n’était pas adapté aux expériences d’immunofluorescence.

Il n’y avait aucune différence entre les événements d’APL dans la condition expérimentale par rapport à la condition témoin, ce qui indique l’importance de sélectionner la bonne combinaison d’anticorps pour détecter les événements de PLA. Le protocole décrit peut être adapté pour détecter les interactions des complexes de facteurs de transcription différents des SMAD et donc aider à comprendre la régulation des gènes dans les conditions de protection de l’athéro et de l’athéro.