Name: Visualisation et quantification de la signalisation TGFβ/BMP/SMAD dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez la visualisation des complexes SMAD dans les cellules endothéliales sous contrainte de cisaillement fluide à l'aide du test de proximité-ligature. Cette méthode microfluidique permet une analyse quantitative des interactions protéiques en biologie vasculaire.

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Nous remercions le Dr Maria Reichenbach et le Dr Christian Hiepen pour leur soutien sur le système de mise en place du flux et Eleanor Fox et Yunyun Xiao pour la lecture critique du manuscrit. P-L.M. a été financé par l’école internationale de recherche Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK a reçu un financement de la DFG-SFB1444. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.

1. Exposition à la culture cellulaire et au stress de cisaillement des fluides
REMARQUE: Les CE de la veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été utilisés comme exemple pour étudier l’interaction induite par la SS des SMAD. Le protocole décrit ci-dessous peut être appliqué à chaque type de cellule réactive SS.
<ol><li>Enduire la lame à 6 canaux avec 0,1% de gélatine pour la peau porcine dans du PBS pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Ensemencez des HUVEC dans des lames pré-enduites à 6 canaux à une densité de 2,5 x 106 cellules par mL dans 30 μL de milieu complet M199. REMARQUE : Pour plus d’informations sur la façon d’ensemencer des cellules dans la diapositive de flux, reportez-vous à la référence24.</li>
	<li>Laisser les cellules adhérer pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Ajouter 60 μL de milieu plein M199 préchauffé à chacun des réservoirs.</li>
	<li>Culture pendant 2 jours, avec un échange moyen doux une fois par jour, à 37 °C dans un incubateur humidifié.<ol>
<li>Aspirer complètement les réservoirs, ajouter 120 μL de milieu complet M199 préchauffé dans l’un des réservoirs et aspirer de l’autre côté.</li>
		<li>Ajouter 60 μL de milieu complet M199 préchauffé aux deux réservoirs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assemblez et démarrez la configuration du flux comme indiqué dans la référence25.<ol>
<li>Monter des tubes sur des unités fluidiques. Ici, des tubes en silicone d’un diamètre de 0,8 mm et 1,6 mm sont utilisés pour appliquer une contrainte de cisaillement de 1 dyn/cm2 et 30 dyn/cm2, respectivement. REMARQUE: Le matériau et la longueur du tube doivent rester constants, car les changements pourraient influencer la contrainte de cisaillement qui en résulte. En général, d’autres combinaisons de systèmes de pompe et de tubes peuvent être utilisées, à condition que la contrainte de cisaillement résultante soit connue et que la pompe crée un flux laminaire régulier.</li>
		<li>Remplir les réservoirs avec une quantité appropriée de milieu plein M199 préchauffé (minimum 10 mL).</li>
		<li>Connectez les unités fluidiques avec le tube au système de pompe et effectuez un pré-fonctionnement sans cellules pour équilibrer le fluide et éliminer tout air restant25.</li>
		<li>Connectez en série les canaux uniques de la glissière à 6 canaux les uns aux autres à l’aide d’un tube de connexion série. Le premier et le dernier canal de la glissière seront connectés au tube assemblé au point 1.6.1 (voir la figure 1A pour un schéma). Veillez à ne pas introduire d’air dans le système, car cela pourrait nuire gravement aux cellules. Vous trouverez de plus amples informations sur la connexion série dans la référence26.</li>
		<li>Pour l’exposition des cellules à des niveaux élevés de contrainte de cisaillement (>20 dyn/cm2), utilisez une phase de rampe, c’est-à-dire augmentez la contrainte de cisaillement par étapes avec des phases d’adaptation. Les étapes peuvent être définies par incréments de 5 dyn/cm2 par 30 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixation
<ol><li>Détachez les glissières des pompes après l’exposition au fluide SS. Utilisez des pinces sur le tube lors du détachement, pour éviter le déversement de milieu dans l’incubateur.</li>
	<li>Le flux de transfert immédiat glisse sur la glace, tandis que le tube restant est détaché séquentiellement. Lors du retrait du tube des réservoirs, le réservoir de l’autre côté doit être maintenu fermé avec un doigt pour éviter de piéger les bulles d’air dans le canal. Cela peut interférer avec les étapes de fixation.</li>
	<li>En gardant les cellules sur la glace, aspirez soigneusement le milieu des réservoirs, mais pas du canal où résident les cellules. Par la suite, laver les échantillons avec du PBS stérile à froid (4 °C) avec trois fois le volume du canal (90 μL). Ajouter PBS dans un réservoir et aspirer soigneusement de l’autre réservoir. Répétez cette étape dans chacun des 6 canaux par diapositive. REMARQUE: Pour toutes les étapes de lavage et d’incubation, la solution respective est ajoutée dans l’un des réservoirs, ce qui conduit à un échange de solutions dans le canal. Pour permettre la substitution complète des solutions dans le canal, la solution excédentaire est ensuite aspirée à partir de l’autre réservoir. La solution sur le dessus des cellules dans le canal n’est pas enlevée. Les cellules ne doivent pas sécher à tout moment. Par conséquent, il est important de laver soigneusement sans aucune insertion de bulle d’air dans les glissières.</li>
	<li>Fixez les cellules en ajoutant 90 μL de solution tamponnée de PFA à 4% dans le même réservoir où le PBS a été ajouté au préalable et aspirez de la même manière le liquide de l’autre réservoir. Répétez cette étape dans chaque couche de chaque diapositive. Après l’ajout de la solution de PFA, transférer les échantillons de la glace à température ambiante (RT) et incuber pendant 20 min. ATTENTION : Le PFA est toxique et doit être manipulé avec précaution. Utilisez des gants et travaillez sous une hotte aspirante.</li>
	<li>Lavez les cellules 3x avec PBS (RT) en l’ajoutant dans un réservoir et en aspirant soigneusement de l’autre réservoir. Videz uniquement les réservoirs, en veillant à ne pas assécher le canal. Répétez cette étape pour chacune des 6 couches par diapositive.</li>
	<li>Éteindre la fixation du PFA en ajoutant 90 μL de chlorure d’ammonium ambiant de 50 mM dans le PBS dans l’un des réservoirs. Aspirer l’excès de solution de l’autre réservoir. Répétez l’opération pour chaque couche de la diapositive. Incuber les échantillons pendant 10 min à TA.</li>
	<li>Laver comme décrit à l’étape 2.5. REMARQUE: À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant la nuit, ou le protocole peut être immédiatement poursuivi avec le blocage et l’incubation d’anticorps primaires (voir l’étape 3).</li>
</ol>3. Blocage et incubation d’anticorps primaires
<ol><li>Pour perméabiliser les cellules, ajouter 90 μL de Triton-X-100 à 0,3 % dans le PBS dans un réservoir vidé et aspirer de l’autre réservoir pour chaque canal. Incuber pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Laver comme décrit à l’étape 2.5.</li>
	<li>Ajouter 90 μL de solution stérile bloquant le PLA dans un réservoir d’un canal et aspirer de l’autre côté. Répétez cette étape pour chaque canal. Bloquer pendant 1 h à 37 °C dans une chambre humidifiée.<ol>
<li>Pour faire une chambre humidifiée, utilisez un plat de 10 cm avec du tissu humide scellé avec un film de cire et placez le plat dans l’incubateur. Alternativement, d’autres formats de chambre d’humidité peuvent être utilisés qui fournissent une atmosphère humide. REMARQUE: Alternativement, une solution de blocage auto-fabriquée peut être utilisée (par exemple, 3% (w / v) BSA dans PBS, filtré stérile).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer des anticorps primaires (1:100) dans un diluant d’anticorps PLA. Préparer 30 μL de la solution par canal. Ajouter les deux anticorps primaires simultanément et vortex. REMARQUE: Alternativement, un diluant d’anticorps auto-fabriqué peut être utilisé (par exemple, 1% (p / v) BSA dans PBS). Les anticorps utilisés ici sont des combinaisons de SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 et phospho-SMAD1/5-SMAD4. Des informations détaillées peuvent être trouvées dans la Table des matériaux.</li>
	<li>Avant l’application d’anticorps primaires, aspirez la solution bloquante des réservoirs et, également, soigneusement du canal. Pipette 30 μL de la solution d’anticorps primaire immédiatement dans le canal vide en inclinant le canal tout en ajoutant la solution. REMARQUE: Effectuez le retrait de la solution bloquante et l’ajout de la solution d’anticorps canal par canal pour vous assurer que les cellules ne sèchent pas entre les deux.</li>
	<li>Incuber des échantillons avec les anticorps primaires pendant la nuit dans des chambres humidifiées à 4 °C. REMARQUE: L’incubation peut également être effectuée pendant 1 h à température ambiante, si vous souhaitez poursuivre les étapes suivantes le même jour.</li>
</ol>4. Incubation de sonde PLA
REMARQUE: Pour toutes les étapes de la section 4.1-7.3, les tampons de lavage A et B sont stockés à 4 °C et doivent être chauffés à RT avant l’utilisation.
<ol><li>Diluer les sondes PLA (+)-souris et (-)-lapin à 1:5 dans une solution de diluant diluant d’anticorps PLA (ou 1% BSA). Préparer 30 μL par canal.</li>
	<li>Laver les échantillons 2x pendant 5 min en utilisant 90 μL du tampon de lavage A à RT en l’ajoutant dans l’un des réservoirs et en aspirant soigneusement de l’autre réservoir. Répétez cette étape pour chacune des 6 couches par diapositive.</li>
	<li>Aspirer soigneusement le tampon de lavage A et ajouter 30 μL de solution de sonde pla (préparée à l’étape 4.1), de la même manière que l’ajout d’anticorps primaires à l’étape 3.5.</li>
	<li>Incuber les échantillons pendant 1 h à 37 °C dans une chambre humidifiée.</li>
</ol>5. Ligature
<ol><li>Laver les échantillons 2x pendant 5 min en utilisant 90 μL du tampon de lavage A à RT, comme décrit au point 4.2.</li>
	<li>Préparer une dilution 1:5 du tampon de ligature dans de l’eau désionisée. Utilisez ce tampon pour diluer l’enzyme ligase à 1:40 (sur glace). Utilisez 30 μL par canal.</li>
	<li>Aspirer complètement le tampon de lavage A et ajouter la solution de ligature comme décrit au point 3.5.</li>
	<li>Incuber les échantillons pendant 30 min à 37 °C dans une chambre humidifiée.</li>
</ol>6. Amplification
<ol><li>Laver les échantillons 2x pendant 2 min en utilisant 90 μL de tampon de lavage A à RT, comme décrit au point 4.2.</li>
	<li>Préparez le tampon d’amplification en le diluant à 1:5 dans de l’eau désionisée et utilisez-le pour diluer l’enzyme polymérase à 1:80 (sur glace). Protéger de la lumière. Préparer 30 μL par canal.</li>
	<li>Aspirer le tampon de lavage A complètement et immédiatement ajouter la solution d’amplification préparée dans le canal vide, comme décrit au point 3.5. Incuber les échantillons pendant 100 min à 37 °C dans une chambre humidifiée.</li>
</ol>7. Montage
<ol><li>Laver les échantillons 2x pendant 10 min en utilisant 90 μL de tampon de lavage B à RT comme décrit au point 4.2. Ajouter le DAPI (1:500) à partir d’une solution mère de 1 mg/mL (dans de l’eau désionisée) dans le premier lavage pour tacher les noyaux. Ne séchez pas le canal.</li>
	<li>Diluer le tampon de lavage B dans de l’eau désionisée (1:10) et laver 1x avec 90 μL de solution tampon B 0,1x comme décrit au point 4.2.</li>
	<li>Aspirer complètement le tampon de lavage B et ajouter immédiatement 2-3 gouttes du milieu de montage liquide dans un réservoir. Distribuez-le dans le canal en inclinant la diapositive. Conserver les échantillons à 4 °C dans un environnement humidifié jusqu’à l’imagerie.</li>
</ol>8. Acquisition d’images
<ol><li>Acquérir des images à l’aide d’un microscope à fluorescence. Assurez-vous que les filtres respectifs équipant les sondes PLA fluorescentes sont disponibles. REMARQUE: Il est avantageux d’utiliser un microscope confocal, si possible, car les taches de PLA obtenues sont plus définies. Cela prend également en charge le traitement d’images et l’analyse de données.</li>
</ol>9. Analyse et quantification d’images à l’aide d’ImageJ/FIJI
<ol><li>Traitez les images exportées (.tiff) avec un programme de traitement d’image, tel que ImageJ27. REMARQUE: Tous les scripts utilisés dans cette étude et qui sont nécessaires pour le comptage automatique des événements cellulaires, nucléaires et de tous les événements PLA (par cellule) peuvent être trouvés dans un référentiel GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Effectuer une analyse statistique à l’aide de tout programme ou outil approprié.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole basé sur le PLA décrit ici offre un moyen efficace de déterminer la proximité de deux protéines (par exemple, leur interaction directe) dans les CE exposés à une contrainte de cisaillement avec une résolution quantitative et spatiale. En utilisant des lames d’écoulement avec plusieurs canaux parallèles, plusieurs interactions protéiques différentes peuvent être examinées en même temps dans des cellules dans des conditions mécaniques identiques. En revanche, les systèmes de chambre d’écoulement sur mesure uti...

Les protéines de la superfamille des facteurs de croissance transformants bêta (TGFβ) sont des cytokines pléiotropes avec une variété de membres, y compris TGFβs, protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et Activins1,2. La liaison au ligand induit la formation d’oligomères récepteurs conduisant à la phosphorylation et, par conséquent, à l’activation du SMAD régulateur cytosolique (R-SMAD). Selon la sous-famille de ligands, différents R-SMAD sont activés1,2. Alors que les TGFβs et les Activines induisent principalement la phosphorylation de SMAD2/3, les BMP induisent une phosphorylation SMAD1/5/8. Cependant, il y a de plus en plus de preuves que les BMP et les TGFβs/Activins activent également les R-SMAD de l’autre sous-famille respective, dans un processus appelé « signalisation latérale»3,4,5,6,7,8 et qu’il existe des complexes SMAD mixtes composés à la fois de membres SMAD1/5 et SMAD2/333,9 . Deux R-SMAD activés forment par la suite des complexes trimériques avec le médiateur commun SMAD4. Ces complexes de facteurs de transcription sont alors capables de se transloquer dans le noyau et de réguler la transcription des gènes cibles. Les SMAD peuvent interagir avec une variété de co-activateurs et de co-répresseurs transcriptionnels différents, ce qui conduit à la diversification des possibilités de régulation des gènes cibles10. La déréglementation de la signalisation SMAD a de graves implications dans une variété de maladies. Dans cette optique, une signalisation TGFβ/BMP déséquilibrée peut entraîner des pathologies vasculaires graves, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, la télangiectasie hémorragique héréditaire ou l’athérosclérose3,11,12,13,14.
Les cellules endothéliales (CE) forment la couche la plus interne des vaisseaux sanguins et sont donc exposées au stress de cisaillement (SS), une force de friction exercée par le flux visqueux du sang. Fait intéressant, les CE résidant dans les parties du système vasculaire, qui sont exposées à des niveaux élevés de SS laminaires uniformes, sont maintenus dans un état homéostatique et au repos. En revanche, les CE qui présentent des SS faibles et non uniformes, par exemple aux bifurcations ou à la courbure moindre de l’arc aortique, sont prolifératives et activent les voies inflammatoires15. À leur tour, les sites d’EC dysfonctionnels sont enclins à développer l’athérosclérose. Fait intéressant, les CE dans ces zones d’athéroprone affichent des niveaux aberrants élevés de SMAD2/3 et SMAD1/516,17,18 activés. Dans ce contexte, l’amélioration de la signalisation TGFβ/BMP s’est avérée être un événement précoce dans le développement de lésions athérosclérotiques19 et l’interférence avec la signalisation BMP s’est avérée réduire considérablement l’inflammation vasculaire, la formation d’athérome et la calcification associée20.
Le test de ligature de proximité (PLA) est une technique biochimique permettant d’étudier les interactions protéine-protéine in situ21,22. Il repose sur la spécificité des anticorps de différentes espèces qui peuvent se lier aux protéines cibles d’intérêt, permettant une détection très spécifique des interactions protéiques endogènes au niveau d’une seule cellule. Ici, les anticorps primaires doivent se lier à leur épitope cible à une distance inférieure à 40 nm pour permettre la détection23. Par conséquent, le PLA est très bénéfique par rapport aux approches traditionnelles de co-immunoprécipitation, où plusieurs millions de cellules sont nécessaires pour détecter les interactions protéiques endogènes. Dans le PLA, les anticorps secondaires spécifiques à l’espèce, liés de manière covalente à des fragments d’ADN (appelés sondes Plus et Moins), se lient aux anticorps primaires et si les protéines d’intérêt interagissent, les sondes Plus et Moins sont proches. L’ADN est ligaturé à l’étape suivante et l’amplification en cercle roulant de l’ADN circulaire est rendue possible. Lors de l’amplification, des oligonucléotides complémentaires marqués par fluorescence se lient à l’ADN synthétisé, ce qui permet de visualiser ces interactions protéiques par microscopie à fluorescence conventionnelle.
Le protocole décrit ici permet aux scientifiques de comparer quantitativement le nombre de complexes de transcription SMAD actifs dans des conditions athéroprotectrices et athéroprones SS in vitro à l’aide de PLA. SS est généré via un système de pompe pneumatique programmable capable de générer un débit unidirectionnel laminaire de niveaux définis et permettant d’augmenter progressivement les débits. Cette méthode permet de détecter les interactions entre SMAD1/5 ou SMAD2/3 avec SMAD4, ainsi que les complexes mixtes R-SMAD. Il peut facilement être étendu pour analyser les interactions des SMAD avec les co-régulateurs transcriptionnels ou aux complexes de facteurs de transcription autres que les SMAD. La figure 1 montre les principales étapes du protocole présenté ci-dessous.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du protocole décrit. (A) Les cellules ensemencées dans des lames à 6 canaux sont exposées à une contrainte de cisaillement à l’aide d’un système de pompe pneumatique. (B) Les cellules fixes sont utilisées pour l’expérience du PLA ou pour les conditions de contrôle. (C) Les images des expériences PLA sont acquises avec un microscope à fluorescence et sont analysées à l’aide du logiciel d’analyse ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro ;-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>Lame 6 canaux</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Extinction de l’albumine</td></tr><tr><td>sérique bovine</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Blocage</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>Coloration ADN/Nuclei</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Kit</td> PLA Green <td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>contenant de la ligase, un tampon de ligature, une polymérase et un tampon d’amplification (avec oligonucléotides marqués en vert)</td></tr><tr><td>Sonde PLA in situ Duolink Anti-souris MINUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck DUO92004</td><td></td><td>Sonde MINUS</td></tr><tr><td>Sonde PLA In Situ Duolink Sonde PLA Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92002</td><td>Sonde PLUS</td></tr><tr><td>Tampons de lavage in situ Duolink, Fluorescence</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO82049</td><td>Tampons de lavage PLA A et B</td></tr><tr><td>Supplément de croissance des cellules endothéliales Supplément</td><td>Corning</td><td></td><td>pour milieu (ECGS)</td></tr><tr><td>Veau fœtal Supplément sérum</td><td></td><td></td><td>pour moyen</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde tamponnée à 4 %</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> complet <td>M199 milieu basal +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp ; 25 &nbsp ; g/mL d’hépatite +&nbsp ; &nbsp ; 50 et micro ; g/mL ECGS</td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc, type A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Utiliser 0,1 % dans le PBS pour l’enrobage des canaux d’écoulement</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>Programme statistique utilisé pour les tracés et les calculs statistiques Sel d’héparine</td></tr><tr><td>sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td> supplément pour les HUVECs <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>moyens (Hep)</td></tr><tr><td>ibidi Montage Medium ibidi</td><td></td><td>50001</td><td>Medium de montage liquide</td></tr><tr><td>ibidi Pump System</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Pompe pneumatique</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>microscope confocal</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>supplément pour medium (L-Glu)</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Base medium</td></tr><tr><td>souris anti-SMAD1</td><td>Anticorps Abcam</td><td>ab53745</td><td>Convient pour PLA</td></tr><tr><td>souris anti-SMAD2/3 Anticorps</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>Ne convient pas pour le PLA en combinaison avec CST 9515</td></tr><tr><td>souris anti-SMAD4 Anticorps</td><td>Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>Convient pour PLA</td></tr><tr><td>Pénicilline 10.000U/ml /Streptomycine 10mg/ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>supplément pour milieu (P/ S)</td></tr><tr><td>Kit de perfusion BLANC</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>Tubes utilisés pour 1 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Kit de perfusion JAUNE et VERT</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Tubes utilisés pour 30 dyn/cm2</td></tr><tr><td>rabbit anti-phospho SMAD1/5</td><td>Anticorps Cell Signaling Technologies</td><td>9516</td><td>Adapté pour PLA</td></tr><tr><td>lapin anti-SMAD2/3 XP</td><td>Anticorps Cell Signaling Technologies</td><td>8685</td><td>Adapté pour PLA</td></tr><tr><td>lapin anti-SMAD4</td><td>Anticorps Cell Signaling Technologies</td><td>9515</td><td>Ne convient pas pour le PLA en combinaison avec BD 610843</td></tr><tr><td>Connecteur série pour &micro ;-Slides</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>tubes de connexion série</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>Perméabilisation</td></tr></tbody></table>

visualisation et quantification de la signalisation tgfβ/bmp/smad dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

La signalisation du facteur de croissance transformant β (TGFβ) / protéine morphogénétique osseuse (BMP) est étroitement régulée et équilibrée pendant le développement et l’homéostasie du système vasculaire Par conséquent, la dérégulation de cette voie de signalisation entraîne des pathologies vasculaires graves, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, la télangiectasie hémorragique héréditaire et l’athérosclérose. Les cellules endothéliales (CE), en tant que couche la plus interne des vaisseaux sanguins, sont constamment exposées au stress de cisaillement des fluides (SS). Il a été démontré que des schémas anormaux de SS fluide améliorent la signalisation TGFβ / BMP, qui, avec d’autres stimuli, induisent l’athérogenèse. En relation avec cela, l’athéroprorone, faible SS laminaire, a amélioré la signalisation TGFβ / BMP tandis que l’athéroprotecteur, SS laminaire élevé, diminue cette signalisation. Pour analyser efficacement l’activation de ces voies, nous avons conçu un flux de travail pour étudier la formation de complexes de facteurs de transcription dans des conditions SS à faible laminaire et à SS laminaire élevé à l’aide d’un système de pompe pneumatique disponible dans le commerce et d’un test de ligature de proximité (PLA).
La signalisation TGFβ/BMP active nécessite la formation de complexes SMAD trimériques constitués de deux SMAD régulateurs (R-SMAD); SMAD2/3 et SMAD1/5/8 pour la signalisation TGFβ et BMP, respectivement) avec un médiateur commun SMAD (co-SMAD; SMAD4). En utilisant le PLA ciblant différentes sous-unités du complexe SMAD trimérique, c’est-à-dire R-SMAD/co-SMAD ou R-SMAD/R-SMAD, la formation de complexes de facteurs de transcription SMAD actifs peut être mesurée quantitativement et spatialement à l’aide de la microscopie à fluorescence.
L’utilisation de glissières d’écoulement avec 6 petits canaux parallèles, qui peuvent être connectés en série, permet d’étudier la formation complexe du facteur de transcription et d’inclure les contrôles nécessaires. 
Le flux de travail expliqué ici peut être facilement adapté pour des études ciblant la proximité des SMAD à d’autres facteurs de transcription ou à des complexes de facteurs de transcription autres que les SMAD, dans différentes conditions de SS fluides. Le flux de travail présenté ici montre un moyen rapide et efficace d’étudier la signalisation TGFβ/BMP induite par les fluides SS dans les CE, à la fois quantitativement et spatialement.

Nous avons déjà utilisé le PLA pour détecter les interactions de différentes protéines SMAD3 et analysé les changements induits par le stress de cisaillement dans la phosphorylation SMAD28.
Ici, les deux méthodes ont été combinées avec le protocole décrit ci-dessus. Les HUVEC ont été soumis à une contrainte de cisaillement de 1 dyn/cm2 et 30 dyn/cm2 et analysés pour les interactions des facteurs de transcription SMAD. Nous m...

Ici, nous établissons un protocole pour visualiser et analyser simultanément plusieurs complexes SMAD en utilisant le test de ligature de proximité (PLA) dans les cellules endothéliales exposées à des conditions pathologiques et physiologiques de stress de cisaillement des fluides.

Visualisation et quantification de la signalisation TGFβ/BMP/SMAD dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Ce protocole permet aux scientifiques de comparer quantitativement le nombre de complexes de facteurs de transcription dans différentes conditions de stress de cisaillement et sera bénéfique pour la recherche en biologie vasculaire. Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de canaux d’écoulement microfluidiques qui permettent d’étudier plusieurs paires d’anticorps, y compris les contrôles respectifs simultanément. Pour commencer, enduisez la lame à six canaux en ajoutant 0,1% de gélatine pour la peau porcine préparée dans le PBS dans les canaux pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Videz les canaux de la solution de gélatine et ensemencez Huvecs dans les lames précodées à six canaux à une densité de 2,5 fois 10 à la sixième cellule par millilitre dans 30 microlitres de milieu complet M199. Laissez les cellules adhérer pendant une heure à 37 degrés Celsius dans l’incubateur humidifié. Ajouter 60 microlitres de milieu complet M199 pré-averti à chacun des réservoirs.Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux jours dans un incubateur humidifié avec remplacement du milieu après 24 heures. Montez le tube de silicium sur les unités fluidiques, remplissez les réservoirs avec un minimum de 10 millilitres de milieu complet M199 pré-averti. Connectez les unités fluidiques avec des tubes au système de pompe et effectuez le pré-fonctionnement sans cellules pour équilibrer le fluide et éliminer tout l’air restant.Connectez les canaux simples sur la glissière à six canaux à l’aide du tube de connexion série. Connectez le premier et le dernier canal de la glissière aux tubes montés sur l’unité fluidique. Pour l’exposition des cellules à des niveaux élevés de stress pur, augmentez le stress pur en fonction des phases d’adaptation, en définissant les étapes par incréments de cinq dynes par centimètre carré toutes les 30 minutes.Utilisez les touffes sur le tube pour détacher les glissières des pompes après l’exposition aux contraintes de cisaillement du fluide, en évitant les déversements moyens dans l’incubateur et en transférant les glissières d’écoulement sur la glace. Tout en détachant le tube des réservoirs, utilisez le doigt pour fermer l’autre côté du réservoir afin d’éviter de piéger les bulles d’air dans le canal. En gardant la glissière d’écoulement sur la glace, aspirez soigneusement le milieu des réservoirs, mais pas du canal où résident les cellules.Lavez les échantillons avec 90 microlitres de PBS stérile à froid en ajoutant du PBS à un réservoir et aspirez soigneusement de l’autre réservoir, puis répétez pour tous les canaux. Fixez les cellules en ajoutant 90 microlitres de solution tamponnée de PFA à 4% au même réservoir où le PBS a été ajouté et aspirez le liquide de l’autre réservoir comme démontré. Après avoir fixé les cellules dans les six canaux, transférez les échantillons de la glace à la température ambiante et incubez pendant 20 minutes.Lavez les cellules trois fois avec du PBS en ajoutant du PBS à un réservoir et en l’aspirant soigneusement de l’autre réservoir dans tous les canaux, en prenant soin de ne pas dessécher les canaux. Étancher l’accès PFA en ajoutant 90 microlitres de chlorure d’ammonium ambiant de 15 millimolaires préparé dans du PBS à l’un des réservoirs. Aspirer de l’autre réservoir et incuber les cellules pendant 10 minutes.Perméabiliser les cellules en ajoutant 90 microlitres de 0,3% de Triton X 100 préparés en PBS dans le réservoir vide. Aspirer de l’autre réservoir pour chaque canal et incuber pendant 10 minutes, puis laver trois fois avec du PBS comme démontré précédemment. À 90 microlitres de solution de blocage stérile de PLA dans un réservoir.Aspirer de l’autre côté pour chaque canal et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Ajouter des anticorps primaires dans le diluant d’anticorps PLA et le vortex. Aspirer soigneusement la solution bloquante des réservoirs et des canaux.Ajouter 30 microlitres de la solution d’anticorps primaires immédiatement dans le canal vide en inclinant la lame tout en ajoutant la solution. Répétez pour tous les canaux et incubez à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée pendant la nuit ou à 37 degrés Celsius pendant une heure. Diluer moins lapin et plus souris PLA sonde de un à cinq dans le diluant d’anticorps PLA.Lavez tous les canaux deux fois en ajoutant 90 microlitres de tampon de lavage A et en aspirant comme démontré. Après avoir aspiré le tampon de lavage, ajouter 30 microlitres de solution de sonde PLA et incuber dans la chambre humidifiée. Diluer le tampon de ligature un à cinq dans de l’eau ionisée D et diluer l’enzyme lygus un à 40 dans le tampon de ligature dilué.Après avoir lavé et complètement aspiré le tampon de lavage A, ajoutez 30 microlitres de solution de ligature aux canaux vides tout en inclinant la glissière et incubez dans la chambre humidifiée. Diluer le tampon d’amplification un à cinq dans de l’eau désionisée, puis diluer l’enzyme polymérase un à 80 dans le tampon d’amplification dilué sur glace. Après avoir lavé et complètement aspiré le tampon de lavage A, ajoutez 30 microlitres de solution d’amplification aux canaux vides tout en inclinant la glissière et incubez-la dans la chambre humidifiée.Diluer le DAPI un à 500 dans le tampon de lavage B et laver tous les canaux une fois en ajoutant 90 microlitres de DAPI contenant le tampon de lavage B, et en aspirant comme démontré pour cuire les noyaux à la vapeur. Ensuite, lavez tous les canaux une fois avec le tampon de lavage B sans DAPI. Diluer le tampon de lavage B un à 10 dans de l’eau désionisée et laver tous les canaux une fois avec 90 microlitres de tampon de lavage dilué B.Après avoir aspiré le tampon de lavage B, ajouter immédiatement deux à trois gouttes du milieu de montage liquide à un réservoir et incliner la glissière pour répartir le support de montage dans tous les canaux.Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius dans un environnement humidifié jusqu’à l’imagerie. Les Huvecs ont été exposés à un stress élevé et faible. Le faible stress de cisaillement a augmenté les interactions de la protéine SMAD dans le cytosol et les noyaux.Les contrôles d’anticorps uniques ont montré non à très peu de signaux, prouvant le succès de l’expérience. L’augmentation de la concentration d’anticorps a entraîné un nombre plus élevé d’événements PLA par cellule, mais la différence dans les signaux PLA entre les cellules exposées à un stress pur élevé et faible a été réduite. Les tampons auto-fabriqués pour le blocage et la dilution des anticorps peuvent être utilisés comme alternative aux tampons commerciaux.La quantification des événements PLA pour les solutions diluantes et bloquantes commerciales et auto-fabriquées a montré le même schéma de signaux PLA dans les zones cytosolique et nucléaire. Cependant, le nombre total d’événements PLA par cellule était plus élevé avec les solutions commerciales. Une combinaison d’anticorps SMAD Two/Three, SMAD Four a été utilisée lorsque l’anticorps SMAD Four n’était pas adapté aux expériences d’immunofluorescence.Il n’y avait aucune différence entre les événements d’APL dans la condition expérimentale par rapport à la condition témoin, ce qui indique l’importance de sélectionner la bonne combinaison d’anticorps pour détecter les événements de PLA. Le protocole décrit peut être adapté pour détecter les interactions des complexes de facteurs de transcription différents des SMAD et donc aider à comprendre la régulation des gènes dans les conditions de protection de l’athéro et de l’athéro.

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Visualisation et quantification de la signalisation TGFβ/BMP/SMAD dans différentes conditions de contrainte de cisaillement du fluide à l’aide du test de proximité-ligature-assay

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