Utilisation d’un baseplatage et d’un miniscope préancré avec une lentille objective pour la recherche transitoire de calcium chez la souris

Ce miniscope peut réduire le problème de retrait avec le ciment dentaire pendant la procédure de plaque de base et augmenter le taux de réussite des enregistrements miniscopiques des signaux de fluorescence en configuration à deux longueurs. Si le transitoire de fluorescence ne peut pas être observé pendant le placage, vérifiez l’expression de l’indicateur de calcium et l’emplacement d’une lentille relais sur la tranche de cerveau. Commencez par monter l’aiguille interne d’un cathéter intraveineux de calibre 20 d’un diamètre d’un millimètre sur le bras stéréotaxique.

Abaissez le cathéter dans l’ammonis ventrale du maïs 1 dans la région cible. Ensuite, abaissez l’aiguille de micro-injection à une vitesse de 100 à 200 micromètres par minute dans le cornu ammonis ventral 1 et infusez 200 nanolitres du vecteur viral dans la région cible à une vitesse de 25 nanolitres par minute. Après avoir laissé le virus se diffuser pendant 10 minutes, retirez l’aiguille de micro-injection à une vitesse de 100 à 200 micromètres par minute.

Après avoir désinfecté la lentille relais, tremper la lentille dans une solution saline froide sans pyrogène jusqu’à l’implantation. À l’aide d’une pince micro bulldog avec tube thermorétractable, tenez la lentille relais et placez-la au-dessus de la région cible à une vitesse de 100 à 200 micromètres par minute. Ensuite, stabilisez la lentille avec du ciment dentaire.

Pour régler un miniscope, fixez l’objectif sur le fond et assemblez la plaque de base sur le miniscope. Enroulez 10 centimètres de film de paraffine autour de l’extérieur de la plaque de base. À l’aide d’argile adhésive réutilisable, tenez le miniscope avec la sonde stéréotaxique du bras.

Alignez l’objectif sur le dessus de l’objectif relais avec le moins d’espace possible entre les objectifs. Utilisez du ciment dentaire pour sécuriser le positionnement de la plaque de base, de sorte que le ciment ne touche que le film de paraffine. Lorsque le ciment dentaire a séché, retirez le film de paraffine, la plaque de base et le miniscope, en gardant la base de ciment dentaire creuse.

Scellez la lentille relais avec du caoutchouc de silicone moulant et couvrez le caoutchouc de silicone avec une fine couche de ciment dentaire. Dégagez la souris des instruments stéréotaxiques et placez-la dans une chambre de récupération. Pour le placage, coupez soigneusement la fine couche du toit en ciment dentaire avec un rongeur d’os et retirez le caoutchouc de silicone.

Nettoyez la surface de la lentille relais avec de l’alcool à 75 %. Fixez la vis de réglage à côté de la plaque de base pour la fixer au bas du miniscope. Ajustez la diapositive de mise au point pour qu’elle se trouve à environ 2,7 à 3 millimètres du boîtier principal.

Lorsque le réglage est terminé, connectez le miniscope à la carte d’acquisition de données et branchez-le sur un port USB 3.0 d’un ordinateur. Exécutez le logiciel d’acquisition de données développé par l’équipe UCLA. Ajustez l’exposition à 255, le gain à 64x et la LED d’excitation à 5%Pour connecter le miniscope au logiciel d’acquisition de données, cliquez sur le bouton de connexion et regardez la diffusion en direct du logiciel d’acquisition de données en considérant la marge de l’objectif relais comme point de repère.

Une fois la lentille du relais trouvée, alignez manuellement l’objectif du miniscope sur l’objectif du relais. En ajustant les différents angles et distances du miniscope, commencez à rechercher les signaux de fluorescence. En tenant le miniscope dans la position optimale, déplacez le bras stéréotaxique vers le mini scope et collez le miniscope au bras stéréotaxique avec de la pâte adhésive réutilisable.

Recherchez la meilleure vue en ajustant légèrement les bras X, Y et Z. Ajustez l’angle entre la surface de l’objectif et la lentille relais en tournant la barre d’oreille, la barre dentaire ou l’argile adhésive réutilisable sur l’axe Z. L’expression virale et l’implantation de lentilles réussissent lorsqu’au moins une cellule a déplacé les transitoires de fluorescence pendant le placage de base.

Fixez fermement la plaque de base avec la plus petite quantité possible de ciment dentaire tout en surveillant la région d’intérêt pour vous assurer que la position optimale ne change pas. Dans l’étude représentative, la procédure de baseplatage factice s’est avérée avantageuse car elle a entraîné un déplacement plus faible de l’emplacement de la plaque de base que la procédure initiale. Le déplacement de la plaque de base a également été influencé par la hauteur du ciment dentaire.

La plaque de base qui était ancrée à 0,5 centimètre au-dessus du crâne se déplaçait beaucoup moins que la plaque de base qui était fixée un centimètre au-dessus du crâne. Dans un exemple d’imagerie réussie au cours de la procédure de placage de base, des transitoires de fluorescence ainsi que des vaisseaux sanguins ont été observés chez l’animal anesthésié. Des transitoires de fluorescence ont été observés cinq jours après le placage de base, même lorsque la souris se comportait librement dans sa cage d’origine avec seulement un léger changement de position.

Une imagerie calcique ultérieure de souris a été réalisée. Dans quelques cas, des problèmes sont survenus pendant la procédure de baseplating, tels que l’absence de quoi que ce soit d’autre qu’un arrière-plan uniforme ou une visibilité des marges des globules blancs. sans transitoires de fluorescence.

Il est important de fixer fermement la plaque de base sur la région cible avec la plus petite quantité possible de ciment dentaire. Avec la technique de l’ardoise, les chercheurs peuvent observer longitudinalement l’activité neuronale à travers cela. Avec la licence appropriée, cette procédure peut également s’appliquer pour observer le réseau neuronal dans le champ de vision.