Name: Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Découvrez le protocole d'expansion des lymphocytes T gamma-delta à partir d'un produit aphéré humain pour la thérapie cellulaire anticancéreuse. Cette méthode permet une expansion supérieure à 200 000 fois.

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Nous remercions le Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity du Moffitt Cancer Center pour avoir fourni le financement nécessaire au développement de ce protocole. Nous remercions également le Dr Claudio Anasetti pour son aide et ses conseils inestimables dans le cadre de ce projet. Enfin, nous remercions le Dr Justin Boucher pour ses idées et son examen du manuscrit.

REMARQUE : L’approbation de la CISR a été obtenue et le consentement éclairé des donateurs a été obtenu.
1. Isolement lymphocytaire
<ol><li>Transférez le produit d’aphérèse dans une salle blanche. REMARQUE: La validation du processus a été effectuée à l’aide de l’aphérèse normale d’un donneur d’un fournisseur commercial externe conforme aux réglementations de collecte des matières premières cellulaires.</li>
	<li>Prélever des échantillons pour les tests de stérilité, le nombre de cellules et le phénotypage cellulaire.</li>
	<li>Elutrier sur le dispositif de centrifugation à contre-courant à l’aide d’un milieu primaire de la solution saline équilibrée de Hanks avec de l’albumine sérique humaine (HSA) à 1 % et un milieu secondaire de solution saline (injection de chlorure de sodium USP à 0,9 %) ou de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Réglez la vitesse de centrifugation d’élutriation à 900 × g et collectez les fractions en fonction du débit et du temps.</li>
	<li>Prélever des échantillons de la fraction 2 et effectuer les essais suivants: 2 mL pour les tests de stérilité; 0,5 mL pour le nombre de cellules et la viabilité à l’aide d’acridine orange/iodure de propidium (AO/PI); 5 × 106 cellules pour le phénotypage cellulaire par cytométrie en flux.</li>
	<li>Développer une fraction lymphocytaire pure (fraction 2) de cellules en culture à 10 × 106 cellules/cm2 dans un bioréacteur à système fermé de 1 L avec 5 μmol/L d’acide zolédronique et 300 UI/mL d’IL-2.</li>
	<li>Incuber pendant sept jours dans un incubateur fixé à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
</ol>2. Épuisement des lymphocytes T alpha-bêta (αβ)
<ol><li>Récoltez des cellules dans la fiole de bioréacteur à système fermé de 1 L. Soudez stérilement un pack de transfert de 1 L sur la ligne rouge du bioréacteur à système fermé et utilisez la pompe pharmaceutique appropriée pour transférer les cellules dans le pack de transfert.</li>
	<li>Prélever les échantillons suivants : 10 mL pour la stérilité moyenne usée; 0,5 mL de cellules pour le nombre de cellules et la viabilité à l’aide de l’AO/PI; 5 × 106 cellules pour la cytométrie en flux</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules à ~5 × 108 cellules/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un tampon (PBS/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)) + 0,5 % HSA et anticorps spécifique tCR αβ biotinylé.</li>
	<li>Placez le shaker au réfrigérateur et incubez les cellules à 2-8 °C pendant environ 15 min en agitant.</li>
	<li>Lavez les cellules avec un total de 600 mL de tampon PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrifuger pour éliminer l’anticorps non lié à 200-500 × g pendant 15 min à 2-8 °C. Remettre en suspension ~5 × 108 cellules/mL dans un tampon PBS/EDTA + 0,5 % HSA avec des microbilles spécifiques à l’antibiotine (flacon de 7,5 mL/1).</li>
	<li>Placez le shaker au réfrigérateur et incubez les cellules à 2-8 °C pendant environ 15 min en agitant. Après incubation, centrifuger les cellules à 200-500 × g pendant 15 min à 2-8 °C pour éliminer les microbilles non liées. Remettez en suspension ~ 6 × 107 cellules / mL dans un tampon PBS / EDTA + 0,5% HSA et transférez-les dans un sac de transfert.</li>
	<li>Installez l’ensemble de tubes dans le dispositif de séparation des cellules magnétiques de qualité clinique en suivant les instructions du fabricant, placez les emballages avec le tampon PBS/EDTA et le pack de transfert avec le produit cellulaire dans l’instrument et piquez-le lorsque l’instrument l’indique.</li>
	<li>Sélectionnez le protocole Depletion 1.2 pour l’épuisement des lymphocytes T αβ marqués.</li>
	<li>Centrifuger la fraction cible (lymphocytes T γδ enrichis) et remettre en suspension les cellules dans un milieu complété par 10% de sérum AB humain.</li>
	<li>Prélever un échantillon de 0,5 mL et effectuer un comptage cellulaire et une viabilité avec une coloration AO/PI. Amener les cellules à une concentration finale d’environ 1 × 106 cellules/mL. Prélever un échantillon de 5 × 106 cellules du produit pour le phénotypage de cytométrie en flux après épuisement.</li>
</ol>3. Co-culture avec les APC
<ol><li>Irradier 5 × 107 aPAC/flacon à 100 Gy sur l’instrument générateur de rayons X.</li>
	<li>Utilisez les aPAC en co-culture dans un rapport de 10:1 avec les lymphocytes T γδ. Placer les APAC irradiés (5 × 107 cellules/fiole) et les lymphocytes T γδ (5 × 106 cellules/fiole) dans des flacons de bioréacteur à système fermé de 1 L avec 1 L de milieu de culture complété par 10 % de sérum AB humain. Ensemencez jusqu’à 10 flacons.</li>
	<li>Dilatez les cellules en culture pendant 10 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Surveillez les niveaux de glucose et de lactate tous les 3-4 jours à l’aide de bandelettes, de glucose et d’un compteur de lactate.</li>
	<li>Si le glucose tombe à 250 mg/dL, réduire le volume dans la fiole à 200 mL à l’aide d’une pompe pharmaceutique en soudant stérilement un pack de transfert de 1 L sur la ligne rouge du bioréacteur à système fermé.</li>
	<li>Mélanger les cellules dans les 200 mL restants et prélever un échantillon de 0,5 mL pour le comptage cellulaire et la mesure de la viabilité par coloration AO-PI. Si le nombre de cellules est ≥109, divisez une fiole en deux fioles et remplissez chaque fiole jusqu’à 1 L avec AIM-V complété par 10% de sérum AB humain. Si le nombre de cellules est <109, nourrissez les cellules avec un litre frais de milieu de culture complété par 10% de sérum AB humain.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.6 pour toutes les fioles et retournez-les à l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Répétez les étapes 3.4 à 3.7 tous les 3 à 4 jours.</li>
</ol>4. Récolte cellulaire
<ol><li>Au bout de 10 jours en co-culture, récoltez toutes les fioles du bioréacteur. Récoltez 1 flacon de bioréacteur à la fois et regroupez toutes les cellules dans un paquet de transfert de taille appropriée. Soudez stérilement le pack de transfert sur la ligne rouge du bioréacteur à système fermé et utilisez la pompe pharmaceutique pour transférer les cellules dans le pack de transfert.</li>
	<li>Prélever les échantillons de contrôle de la qualité suivants : 1 % du produit pharmaceutique (DP) pour la stérilité par hémoculture et coloration au gramme; 0,5 mL pour le comptage cellulaire et la viabilité à l’aide de l’AO/PI; 5 à 10 × 106 cellules pour la cytométrie en flux (voir la figure 1 pour la stratégie de contrôle); 0,5 mL pour l’endotoxine; 0,5 mL pour la coloration au gramme; 106 cellules ont atteint 10 mL de milieu usé pour le test des mycoplasmes.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 200-500 × g pendant 15 min à température ambiante et jeter le surnageant.</li>
	<li>Laver les cellules dans une solution de solution cristalloïde équilibrée + 0,5% HSA à 200-500 × g pendant 15 min à température ambiante. Remettez-les en suspension dans un volume cible de 100-300 mL de solution cristalloïde équilibrée + 0,5% de HSA.</li>
</ol>5. Tests de libération
<ol><li>Effectuer des tests de contrôle de la qualité de la cellule T γδ DP pour les éléments suivants: pureté et identité par cytométrie en flux (vivants / morts, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); viabilité par coloration AO/PI; endotoxine; Test des mycoplasmes par réaction en chaîne par polymérase (PCR); stérilité par coloration de Gramme et hémocultures aérobies et anaérobies; test K562 résiduel par cytométrie en flux (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%3A+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li>
<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li>
<li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment%2C+risk+factors%2C+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li>
<li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph%2B+leukemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700(2011).</li>
<li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3%CE%B4+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-%CE%B1%CE%B2%2B%2FCD19%2B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li>
<li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+T+cell+receptor%3A+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li>
<li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+V%CE%B39V%CE%B42+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le laboratoire de thérapie cellulaire Moffit a développé un protocole avec une expansion biphasique de cellules T γδ très pures pour une utilisation en tant que DP dans les essais cliniques. Ce protocole fournit une méthode de fabrication selon les directives cGMP dans un système fermé qui donne un DP de cellule T γδ très pur qui est activé et étendu avec succès par l’acide zolédronique et les aPAC WCB. Ce protocole a été approuvé par la FDA pour la fabrication d’un DP allogénique à cellules T γδ pour les patients atteints de LAM. En utilisant des donneurs sains, nous avons réussi à augmenter la petite population de lymphocytes T γδ donneurs en seulement 7 jours de 2,06 ± 0,45% à 54,45 ± 28,34%. Après l’expansion de 7 jours avec l’acide zolédronique, il a été observé que le donneur 2 avait une augmentation de la population de NK.
L’acide zolédronique inhibe la farnésyl diphosphate synthase (FDPS) dans les monocytes, ce qui, à son tour, conduit à l’accumulation de pyrophosphate d’isopentenyl (IPP), qui a été corrélée à une augmentation significative de la prolifération des cellules T et des cellules NK naturelles7,8,9. Cette augmentation de la population de NK entrave la 2ème phase d’expansion avec les APAC, car les APAC ne feront que contribuer à l’expansion ultérieure des cellules NK. Pour cette raison, les critères des donneurs ont été modifiés pour exclure les donneurs ayant des populations élevées de NK. Après épuisement des lymphocytes T αβ, les lymphocytes T γδ ont été enrichis à 76,61 ± 27,51 %. Ce protocole unique comprend une deuxième expansion utilisant les APAC fabriqués par Moffit pour cibler les récepteurs CD8, CD28 et CD127L dans les cellules T γδ. Cette deuxième phase d’expansion avec les APAC a donné un DP avec ≥65% pour les cellules T CD3+TCR γδ+, ≤1% TCRαβ T et <35% cd3-CD16+CD56+ NK. En raison de l’utilisation d’APC dérivés du K562, il était nécessaire de démontrer que ces APAC représentaient <1 % du produit final.
Le CTF Moffit a mis au point un test cytométrique en flux utilisé pour les critères de libération afin de mesurer le pourcentage de cellules K562 résiduelles dans le DP final. Ce test cytométrique en flux atténue tous les problèmes liés à l’utilisation d’antigènes de surface cellulaire pour identifier les cellules K562. Comme les lymphocytes T activés peuvent exprimer CD71, nous avons conçu une stratégie pour exclure tous les lymphocytes T et les cellules NK en examinant les populations CD3-CD56- et CD16-, puis en examinant les cellules CD71+, qui seraient exclusivement des cellules K562. Ce protocole démontre que le DP des lymphocytes T γδ produit 0,48 ± 0,42% des cellules K562 résiduelles et répond à tous les critères de libération de ≥70% de viabilité, de négativité de Mycoplasma par PCR, d’absence d’organismes vus par coloration au gramme, de ≤2 EU/mL d’endotoxine et d’absence de stérilité d’hémoculture finale de croissance (14 jours).

La rechute de la leucémie est la principale cause de mortalité après greffe de cellules hématopoïétiques (HCT) chez les patients atteints de LAM1,2,3. Une meilleure survie sans leucémie a été rapportée avec une récupération accrue des lymphocytes T γδ sanguins après HCT sans risque accru de maladie du greffon contre l’hôte (GVH)4. La capacité des lymphocytes T γδ à reconnaître les antigènes indépendamment du CMH et à développer de fortes fonctions effectrices cytolytiques et de type Th1 rend cette sous-population mineure de lymphocytes T idéale pour le traitement des patients atteints de LAM subissant une transplantation allogénique à risque de rechute5. Étant donné que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 sont un sous-ensemble mineur de lymphocytes T allant de 0,5 % à 5 % des lymphocytes T de la périphérie6, nous avons entrepris d’établir un système robuste pour élargir cette population rare de cellules sanguines afin d’obtenir des doses potentiellement thérapeutiques pour les essais cliniques.
Bien que d’autres aient réussi à étendre les lymphocytes T γδ en utilisant de l’acide zolédronique et même des aPAC, nous avons développé un processus qui peut potentiellement multiplier par 229 749 les lymphocytes T γδ. L’expansion est biphasique : tout d’abord, les lymphocytes sont obtenus par élutriation à l’aide de l’instrument de séparation. L’équipement fournit un système fermé qui permet la séparation des cellules en fonction de leur taille, de leur forme et de leur densité par centrifugation à contre-courant. Après enrichissement pour les lymphocytes, l’expansion sélective des lymphocytes T Vγ9Vδ2 est obtenue par traitement à l’acide zolédronique et à l’IL-2 pendant 7 jours. Immédiatement après ce traitement, les lymphocytes TCR-αβ sont épuisés à l’aide de la technologie des microbilles, ce qui permet une expansion ultérieure des lymphocytes T γδ avec des APAC dérivés de K562.
Pour la validation du procédé, seulement 5 × 106 lymphocytes T γδ expansés par l’acide zolédronique ont été utilisés pour l’expansion de la co-culture de phase 2 avec les aPAC. Dans cette deuxième phase d’expansion, les lymphocytes T γδ sont activés à l’aide d’une banque de cellules de travail (BOC) conforme aux bonnes pratiques de fabrication (CGF) actuellement conforme aux BPC dérivés de K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fabriquée à Moffitt. La raison d’être de cette expansion biphasique est basée sur la capacité de l’acide zolédronique à inhiber la farnésyl diphosphate synthase (FDPS) dans les monocytes, conduisant à l’accumulation de pyrophosphate d’isopentenyl, qui stimule directement les cellules Vγ2Vδ2. Dans la deuxième phase d’expansion, les APAC dérivés de K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fournissent une stimulation robuste à tous les lymphocytes T. Cependant, le produit cellulaire a déjà été enrichi pour les cellules T γδ, ce qui a entraîné une expansion robuste des cellules T γδ.
Avec l’utilisation d’équipements et de flacons spécifiques, le processus est un système fonctionnellement fermé, réduisant ainsi le risque de contamination. De plus, le bioréacteur à système fermé de 1 L facilite la croissance et l’expansion maximales des cellules dans un volume total de 1 L de milieu avec un besoin minimal d’alimentation. L’avantage de la méthode Moffitt est qu’elle fournit un système GMP rapide, reproductible et hautement réalisable pour produire un produit de cellules T γδ très pur, dérivé d’un donneur, pour une administration allogénique. Cette méthode peut être appliquée à tout essai clinique visant à utiliser des lymphocytes T γδ humains exprimant des récepteurs de lymphocytes T Vγ2Vδ2 comme immunothérapie adoptive pour médier l’immunité contre les microbes et les tumeurs chez les patients cancéreux présentant une rémission partielle et complète. En outre, il fournit une plate-forme robuste pour le développement et la production de cellules T à récepteur d’antigène chimérique γδ positif (CAR+).

<table><tbody><tr><td>Hanks Solution Saline Équilibrée</td><td>R& D</td><td>285-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Albumine humaine 25 %</td><td>Grifolis</td><td>65483-16-071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte A</td><td>Fisher</td><td>2B2543Q</td><td></td></tr><tr><td>Acide zolédronique (Zometa)</td><td>Hos pira</td><td>4215-04--8</td><td>Médicament approuvé par la FDA</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>CS10</td><td>BIOLIFE SOLUTIONS</td><td>210374</td><td></td></tr><tr><td>3 mL seringue</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 mL seringue</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 20 mL</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 100 mL</td><td>JMS</td><td>992861</td><td></td></tr><tr><td>18g Aiguille</td><td>Fisher</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials 1,8 mL</td><td>Fisher</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 5 mL</td><td>Fisher</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 50 mL</td><td>Fisher</td><td>1367610Q</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10 mL</td><td>Fisher</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 100 mL</td><td>Fisher</td><td>07-200-620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conique</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conique</td><td>Fisher</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>250 mL conique</td><td>Fisher</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Paquet de transfert de 600 mL</td><td>TERUMO BCT INC</td><td>1BBT060CB71</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de transfert de plasma de 4 po</td><td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td><td>03-220-90</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de tubulures Elutra</td><td>TerumoBCT</td><td>70800</td><td></td></tr><tr><td>100 MCS GREX</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td>81100-CS</td><td></td></tr><tr><td>Système de</td> <td>distribution de liquide Pumpmatic stérile AshtonFisher Scientific</td><td>22-246660</td><td></td></tr><tr><td>Acacia Pump boot</td><td>MPS Medical In</td><td>17789HP3MLL</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-070-525</td><td></td></tr><tr><td>Dornase Alpha</td><td>Genentech, Inc</td><td>50242-100-40/186-0055</td><td>Médicament approuvé par la FDA</td></tr><tr><td>1000 mL 0.22 um Filtre</td><td>Fisher</td><td>157-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à sang 170um</td><td>B. Braun</td><td>V2500</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACs Ensemble de tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-090-719</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS TCR&alpha ;/&beta ; Kit</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-021-301</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble sanguin de type Y</td><td>Fenwal</td><td>FWL4C2498H</td><td></td></tr><tr><td>75 mL Flacon</td><td>Fisher</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Prometheus</td><td>65483-116-071</td><td>Médicament approuvé par la FDA</td></tr><tr><td>AIM-V</td><td>Fisher</td><td>0870112BK</td><td></td></tr><tr><td>Sérum AB humain</td><td>Gemini Bio-Produit</td><td>100H41T</td><td></td></tr><tr><td>Pack de transfert de 3 litres</td><td>Independent Medical Associates</td><td>T3109</td><td></td></tr><tr><td>1000 pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>5991040</td><td></td></tr><tr><td>CF-250</td><td>KOLBio</td><td>CF-250</td><td></td></tr><tr><td>Elutra</td><td>TERUMOBCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GatheRex Liquid Handling, Pompe de récolte de cellules</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell Vios Incubateur CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expansion et enrichissement des lymphocytes t gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Bien que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 soient un sous-ensemble mineur des lymphocytes T, cette population est recherchée pour sa capacité à reconnaître les antigènes d’une manière indépendante du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et à développer une forte fonction effectrice cytolytique qui en fait un candidat idéal pour l’immunothérapie du cancer. En raison de la faible fréquence des lymphocytes T Gamma-Delta (γδ) dans le sang périphérique, nous avons développé un protocole efficace pour développer considérablement un produit médicamenteux à base de lymphocytes T γδ très pur pour la première utilisation chez l’homme de lymphocytes T γδ allogéniques chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM). En utilisant l’aphérèse de donneur sain comme source de cellules allogéniques, les lymphocytes sont isolés à l’aide d’un dispositif validé pour une méthode de centrifugation à contre-courant de séparation des cellules par taille et densité. 
La fraction riche en lymphocytes est utilisée et les lymphocytes T γδ sont activés préférentiellement avec de l’acide zolédronique (approuvé par la FDA) et de l’interleukine (IL)-2 pendant 7 jours. Suite à l’expansion préférentielle des lymphocytes T γδ, un dispositif de séparation magnétique des cellules de qualité clinique et des billes TCRαβ sont utilisés pour épuiser les cellules T contaminantes du récepteur des lymphocytes T (TCR)αβ. Les lymphocytes T γδ hautement enrichis subissent ensuite une deuxième expansion à l’aide de cellules artificielles présentatrices d’antigènes (APAC) modifiées à partir de cellules K562 génétiquement modifiées pour exprimer un fragment variable à chaîne unique (scFv) pour CD3 et CD28, 41BBL (CD137L) et IL15-RA- avec de l’acide zolédronique et de l’IL-2. L’ensemencement de tous les lymphocytes T γδ enrichis jour-7 en co-culture avec les aPAC facilite la fabrication de lymphocytes T γδ très purs avec une expansion moyenne du pli de 229 000 fois > à partir de sang de donneur sain.

Le processus des lymphocytes T γδ a été caractérisé et optimisé pour la production du produit médicamenteux à base de lymphocytes T γδ. L’optimisation du processus comprenait 1) l’enrichissement des lymphocytes par élutriation, 2) l’expansion spécifique des cellules cellulaires γδ T (DS) avec de l’acide zolédronique, 3) l’épuisement du TCRαβ par les cellules T γδ, 4) l’expansion secondaire de la cellule T γδ DS à l’aide d’APC dérivés de K562, et 5) la récolte finale de DP et la formulation du produit pour administration ou cryoconservation. Après l’optimisation du processus, des cycles de confirmation ont été effectués à grande échelle en utilisant le matériel dérivé de trois donneurs sains pour confirmer l’adéquation du traitement cellulaire. Toutes les données ont été analysées et sont résumées dans les tableaux 1, 2 et 3. Les cellules séparées de la fraction 2 (F2) de centrifugation post-contre-courant ont donné une population de lymphocytes purs avec une moyenne de 99,23 % de cellules CD45+ (rapportées comme la fréquence de la porte vivante totale) et une excellente viabilité moyenne de 95,80 % (tableau 1).
L’expansion spécifique des lymphocytes T γδ avec l’acide zolédronique dépendait du pourcentage initial de cellules tueuses naturelles (NK) présentes dans la fraction lymphocytaire (F2) après élution. L’enrichissement des lymphocytes T γδ DS avec épuisement TCRαβ était cohérent (tableau 2). Le DP des lymphocytes T γδ fabriqué à partir de trois donneurs sains avait en moyenne 0,11 % ± 0,05 % de lymphocytes B CD20+ et 0,00 % ± 0,00 % de lymphocytes TCR αβ+, répondant ainsi au critère de libération de ≤1 % des lymphocytes T TCR αβ+. Le pourcentage moyen de cellules NK dans le produit final est de 17,06% ± 26,19% et répond au critère de libération de &lt;35%. De plus, le pourcentage moyen de cellules négatives de lymphocytes T et de cellules de lignée NK dans le produit final était de 0,48 % ± de 0,42 % (tableau 3). La coloration de la surface cellulaire et l’analyse cytométrique en flux ont été utilisées pour caractériser l’identité, la pureté et les impuretés de processus du DS et du DP, comme le montre la figure 2A-D.
L’expansion secondaire, obtenue à partir de la co-culture de l’aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB et de la cellule T γδ DS à un rapport de 10:1, a généré une DP de cellule T γδ qui répondait à tous les critères de libération, comme le montre le tableau 4. En outre, les cellules ont été colorées et évaluées par cytométrie en flux au jour 0-centrifugation à contre-courant F2 cellules, jour 7-cellules T dilatées par l’acide zolédronique, jour 7-TCR épuisement des cellules T αβ, jour 17-final DP pour le groupe de biomarqueurs de différenciation (CD)3 suivant, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC chemokine receptor 7 (CCR7), programmable cell death protein-1 (PD-1), la protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (CTLA4), le gène 3 activant les lymphocytes (LAG3) et la protéine 3 contenant les immunoglobulines et les mucines des lymphocytes T (TIM3). Les données présentées à la figure 3 sont calculées en moyenne à partir de trois séries indépendantes et démontrent que les cellules n’ont pas atteint l’épuisement. Le CTF Moffitt a également mis au point un test K562 résiduel pour déterminer les impuretés DP liées aux APAC dérivés de K562 (Figure 4).
La stratégie de contrôle cytométrique en flux utilisée pour caractériser les pourcentages des types de cellules était la suivante : 1) contrôle sur la population négative de lignée cellulaire T et NK (CD3-CD56-CD16-); 2) porte sur CD71+ (récepteur de la transferrine exprimé en lignée érythroïde et LAM permettant la détection des cellules K562 résiduelles). Cette stratégie de contrôle a permis d’évaluer les cellules CD3-CD16-CD56-CD71+, qui sont les WCB aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) (appelé « K562 résiduel » à la figure 4).<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig04large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="11"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="15"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="8"></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="7"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Présenté est un protocole pour l’expansion du produit médicamenteux Gamma-Delta (γδ) T cell. Les lymphocytes sont isolés par élutriation et enrichis en γδ en acide zolédronique et en interleukine-2. Les lymphocytes T alpha-bêta sont épuisés à l’aide d’un dispositif de séparation magnétique de qualité clinique. Les cellules γδ sont co-cultivées avec des cellules productrices d’antigènes artificiels dérivées de K562 et expansées.

Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Les lymphocytes T Gamma-Delta ont une puissante activité cytotoxique contre de nombreux types de cancer, y compris la leucémie myéloïde aiguë. Cependant, les lymphocytes T Gamma-Delta circulants dans le sang sont relativement rares, en particulier chez les patients malins. La perfusion de lymphocytes T Gamma-Delta expansés X-vivo dérivés du donneur est prometteuse pour réduire la récurrence de la leucémie et améliorer la survie des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë.La méthode proposée permet d’obtenir plus de 200 000 fois l’expansion des lymphocytes T Gamma-Delta, atteignant des doses thérapeutiquement pertinentes d’un produit de cellules T Gamma-Delta très pur, en trois étapes faciles. Donc, ligaturant un IEL à l’expansion, l’épuisement des cellules alpha bêta T par tri magnétique et l’expansion secondaire de prime avec des APAC. La méthode proposée élargit l’utilité des lymphocytes T Gamma-Delta pour des maladies telles que le cancer et les maladies auto-immunes en créant rapidement un grand nombre de cellules qui peuvent être utilisées sur étagère.Ce processus pourrait être adapté pour étendre les cellules Gamma-Delta en utilisant différentes méthodes d’enrichissement et en ajoutant des manipulations supplémentaires telles que la transduction. La démonstration de la procédure sera lithée à LA, un technologue en thérapie cellulaire, trois de mon laboratoire. Commencez par l’élutriation de l’échantillon de produit d’effervescence, sur le dispositif de centrifugation à contre-courant, en utilisant un milieu primaire de solution saline équilibrée de Hanks, avec 1% d’albumine sérique humaine et le milieu secondaire de solution saline ou DPBS.Avec la vitesse de centrifugation d’élutriation à 900 fois G, collectez des fractions en fonction du débit et du temps. Prélever les échantillons de la fraction deux pour effectuer les tests de stérilité, le comptage cellulaire et le phénotypage cellulaire par cytométrie en flux. À partir de la fraction deux, développez une fraction lymphocytaire pure des cellules en culture à 10 fois 10 jusqu’à la sixième cellule par centimètre carré, avec cinq micromoles par litre d’acide zolédronique et 300 unités par millilitre d’interleukine-2 dans un bioréacteur à système fermé d’un litre.Incuber le système pendant sept jours à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone. Après l’incubation, récoltez les cellules de la fiole de bioréacteur à système fermé d’un litre. Pour ce faire, soudez stérilement un paquet de transfert d’un litre à la ligne rouge du bioréacteur et utilisez la pompe pharmaceutique appropriée pour transférer les cellules dans le pack de transfert.Prélever les échantillons pour tester la stérilité du milieu usé, le nombre de cellules et le phénotypage cellulaire par cytométrie en flux. À partir de l’échantillon restant, remettez les cellules en suspension à cinq fois 10 à la huitième cellule par millilitre, dans un tampon PBS-EDTA contenant 0,5% de HSA et un récepteur de lymphocytes T biotinylés, anticorps spécifique alpha bêta. Et incuber les cellules à deux à huit degrés Celsius en secouant.Après 15 minutes, laver les cellules avec 600 millilitres de tampon PBS-EDTA contenant 0,5 HSA et centrifuger à 200 à 500 fois G pendant 15 minutes, à deux à huit degrés Celsius, pour éliminer l’anticorps non lié. Ensuite, remettez les cellules en suspension à environ cinq fois 10 à la huitième cellule par millilitre, dans un tampon PBS-EDTA contenant 0,5% de HSA et 7,5 millilitres par flacon de microbilles spécifiques à l’anti-biotine. Comme décrit précédemment, incuber les cellules en les agitant, avant de centrifuger la suspension cellulaire pour éliminer les microbilles non liées.Remettez en suspension six fois 10 à la septième cellule par millilitre dans un tampon PBS-EDTA avec 0,5% HSA. Rassemblez-les dans un sac de transfert. Piquez-le lorsque l’instrument l’indique.Ensuite, installez un ensemble de tubes dans le dispositif de séparation des cellules magnétiques de qualité clinique. Placez les emballages avec le tampon PBS-EDTA et le pack de transfert avec le produit cellulaire dans l’instrument. Pour l’épuisement des lymphocytes T alpha bêta étiquetés, sélectionnez le protocole d’épuisement 1.2 dans le logiciel.Ensuite, centrifugez le produit cellulaire pour recueillir la fraction cible enrichie en lymphocytes T Gamma-Delta. Re-suspendre les cellules collectées dans le milieu, complété par 10% de sérum AB humain. Effectuer une viabilité du comptage cellulaire et une phénotypage par cytométrie en flux après épuisement.Amener les cellules à une concentration finale d’environ une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Irradier cinq fois 10 à la septième cellule présentatrice d’antigène artificiel ou APAC par flacon, à 100 gris sur l’instrument générateur de rayons X. Préparer une co-culture, en plaçant les APAC irradiés et les lymphocytes T Gamma-Delta au rapport de 10 pour un, dans des flacons de bioréacteur à système fermé d’un litre.Avec un litre de milieu de culture, complété par 10% de sérum AB humain, semez jusqu’à 10 flacons. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 10 jours, avec un dépistage des niveaux de glucose et de lactate tous les trois à quatre jours à l’aide de bandelettes, de glucose et d’un compteur de lactate. Si le taux de glucose tombe à 215 milligrammes par décilitre, réduisez le volume dans la fiole à 200 millilitres.Mélanger les cellules dans les 200 millilitres restants de milieu et prélever un échantillon de 0,5 millilitre pour le comptage cellulaire et la mesure de la viabilité par coloration à l’orange acridine ou à l’iodure de propidium. Si le nombre de cellules est égal ou supérieur à 10 à la neuvième, divisez le contenu d’une fiole en deux et remplissez chaque fiole jusqu’à un litre avec un milieu AIM-V, complété par du sérum AB humain à 10%. Si le nombre de cellules est inférieur à 10 à la neuvième, nourrissez les cellules avec un milieu de culture frais d’un litre, complété par du sérum AB humain à 10%, et retournez les flacons à l’incubateur.Au bout de 10 jours en co-culture, récoltez les flacons du bioréacteur un à la fois et tirez toutes les cellules dans un paquet de transfert de taille appropriée. Après avoir retiré les échantillons de contrôle de la qualité, centrifuger les cellules à 200 à 500 fois G pendant 15 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Laver les cellules dans une solution de solution cristalloïde équilibrée, complétée par 0,5% de HSA à 200 à 500 fois G pendant 15 minutes à température ambiante.Remettez-les en suspension dans un volume cible de 100 à 300 millilitres de solution cristalloïde équilibrée avec 0,5% de HSA. Les cellules se sont séparées de la fraction de centrifugation post-contre-courant. Deux ont donné une population de lymphocytes purs, avec une excellente viabilité moyenne de 95,80% L’expansion spécifique des lymphocytes T Gamma-Delta, avec l’acide zolédronique dépendait du pourcentage initial de cellules tueuses naturelles présentes dans la fraction lymphocytaire après élutriation.L’enrichissement de la substance médicamenteuse à cellules T Gamma-Delta, avec épuisement alpha bêta des récepteurs des lymphocytes T, était cohérent. Le médicament Gamma-Delta T-cell fabriqué à partir de trois donneurs sains répondait au critère de libération de moins de 1 % des lymphocytes T alpha bêta positifs du récepteur des lymphocytes T, avec une moyenne de 0,11 % de lymphocytes B CD20 positifs et de 0,00 % de lymphocytes T alpha bêta positifs. Le pourcentage moyen de cellules tueuses naturelles dans le produit final était d’environ 17,06%, ce qui répondait au critère de libération de moins de 35% de coloration de la surface cellulaire et d’analyse cytométrique en flux, ont été utilisés pour caractériser l’identité, la pureté et les impuretés de processus de la substance médicamenteuse et du produit pharmaceutique.La deuxième réextension obtenue à partir de la co-culture de la substance médicamenteuse à cellules T AAPC et Gamma-Delta a généré un produit médicamenteux à cellules T Gamma-Delta qui répondait à tous les critères de libération. Les pathons qui enrichissent la population de lymphocytes T ont un impact sur l’expansion et les caractéristiques du produit. Il est nécessaire d’examiner et d’étudier suffisamment les méthodes d’enrichissement avant le lancement de leur processus d’enrichissement.

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