Modèle biomimétique in vitro tridimensionnel de neuroblastome à l’aide d’échafaudages à base de collagène

Cet article énumère les étapes nécessaires pour ensemencer des lignées cellulaires de neuroblastome sur des échafaudages tridimensionnels à base de collagène décrits précédemment, maintenir la croissance cellulaire pendant une période prédéterminée et récupérer des échafaudages pour plusieurs analyses de croissance cellulaire et de comportement cellulaire et applications en aval, adaptables pour répondre à une gamme d’objectifs expérimentaux.

Notre protocole propose un modèle 3D de bio-ingénierie qui affecte étroitement le tissu natif. Cela peut potentiellement être utilisé pour découvrir de nouvelles thérapies et de nouveaux biomarqueurs pour le traitement et le diagnostic du neuroblastome. Le principal avantage est qu’il crée des conditions expérimentales plus pertinentes sur le plan physiologique pour étudier le microenvironnement tumoral à l’aide d’une technique reproductible qui permet d’obtenir une cohérence d’un lot à l’autre.

Notre méthode d’échafaudage peut être utilisée d’une part pour identifier de nouvelles thérapies pour le neuroblastome, et d’autre part, pour incorporer des cellules dérivées du patient afin de mieux prédire la réponse individuelle du patient. Pour commencer, placez l’échafaudage stocké dans le PBS dans la hotte à flux laminaire. Utilisez une pince à épiler stérile pour soulever doucement l’échafaudage du coin et appuyez contre la paroi latérale pour éliminer l’excès de PBS.

Placez ensuite l’échafaudage avec la couche brillante vers le bas au centre du puits d’une plaque non adhérente à 24 puits. Étiquetez la plaque avec les détails de la lignée cellulaire, de la densité d’ensemencement et des points temporels. Travaillez avec les cellules d’une densité de semis à la fois et gardez les cellules restantes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur, jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées.

Pour la fixation des cellules dans l’échafaudage, utilisez une pipette P20 avec des pointes stériles pour bien mélanger la suspension cellulaire et ajoutez 20 microlitres de la suspension cellulaire correspondante au centre de chaque échafaudage, en veillant à ce que la suspension cellulaire reste sur le dessus de l’échafaudage et non sur la paroi latérale ou la base du puits. Laissez les cellules se fixer pendant trois à cinq heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité. À la fin de l’incubation, utilisez une pipette P1000 pour ajouter lentement un millilitre de milieu de culture préchauffé dans chaque puits, empêchant le déplacement des échafaudages, et incubez la plaque pendant la nuit.

Observez les échafaudages, dans un premier temps, tous les deux à trois jours pour les changements de couleur du milieu de culture au fur et à mesure que les cellules prolifèrent dans l’échafaudage. Utilisez un pistolet à pipette de 10 millilitres en mode lent pour retirer et éliminer un millilitre du milieu épuisé du puits. Lorsque le milieu conditionné est utilisé pour l’expérience, recueillir le milieu usé des répétitions biologiques dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et déposer les débris cellulaires par centrifugation.

Transférez le surnageant dans un tube frais et conservez le tube à moins 80 degrés Celsius. Après avoir réglé le pistolet à pipette sur le mode goutte à goutte, ajoutez doucement deux millilitres de milieu de culture préchauffé dans les échafaudages. Incuber la plaque contenant l’échafaudage et reconstituer le milieu frais pendant la durée de la période de croissance souhaitée, comme démontré.

Dans la hotte à flux laminaire, stériliser le réactif de test de viabilité cellulaire approprié par filtration à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre dans un tube à centrifuger. Préchauffer la solution stérile, le milieu de culture complet et le PBS stérile au bain-marie, à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transférez les échafaudages à analyser dans une nouvelle plaque à 24 puits et étiquetez la plaque avec tous les détails pertinents.

Ajoutez 900 microlitres de milieu de culture préchauffé dans chaque puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de réactif de viabilité cellulaire stérile dans chaque puits. Pour un contrôle négatif, ajouter 900 microlitres de milieu et 100 microlitres de réactif de viabilité cellulaire stérile dans un puits sans échafaudage.

Replacez le couvercle sur la plaque et secouez doucement la plaque pendant environ trois minutes pour répartir le réactif de viabilité cellulaire dilué dans tout le puits. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, balancez-la doucement pendant quelques secondes et générez les triples, comme le montre le manuscrit du texte.

Générez les triplets techniques en transférant 100 microlitres du milieu incubé et du réactif d’un puits de la plaque à 24 puits dans un puits de la plaque translucide à 96 puits, et effectuez cette étape trois fois au total pour un puits. Couvrez la plaque à 96 puits avec du papier d’aluminium pour protéger le réactif de viabilité de la cellule de la lumière. Retirez et jetez les 700 microlitres restants de milieu et de réactif des échafaudages dans la plaque à 24 puits.

Lavez chaque échafaudage deux fois avec un millilitre de PBS stérile. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance à 570 et 600 nanomètres et calculer le pourcentage de réduction des réactifs de viabilité cellulaire selon les recommandations du fabricant. Analyser statistiquement les résultats de viabilité cellulaire, à l’aide d’un logiciel approprié.

Entrez les valeurs biologiques triples pour produire des barres d’erreur et indiquer la variabilité de l’essai. Effectuer un test d’analyse de variance à un facteur pour examiner les changements dans la viabilité cellulaire au cours de la période expérimentale à l’aide d’un logiciel biostatistique approprié. Indiquez les différences significatives entre les points temporels sur les graphiques, comme décrit dans le manuscrit du texte.

La viabilité de deux lignées cellulaires de neuroblastome, KellyLuc et IMR32, cultivées sur les échafaudages, a été évaluée. L’augmentation de la densité cellulaire a entraîné une réduction plus importante du réactif de viabilité cellulaire avec le temps. La croissance cellulaire sur les échafaudages a été mesurée indirectement en quantifiant l’ADN extrait des échafaudages, et les cellules par échantillon ont été calculées.

Les cellules IMR32 ont montré une croissance accrue, puis les cellules KellyLuc, avec le temps. La morphologie de croissance et la distribution des cellules sur les échafaudages ont été évaluées visuellement par coloration à l’hématoxyline, à l’éosine et à l’immunohistochimie. Les cellules KellyCis83 se sont développées plus rapidement et se sont infiltrées plus profondément dans les deux compositions d’échafaudage que la lignée cellulaire Kelly moins invasive.

L’IMR32 cultivé sur de la nano-hydroxyapatite a montré un schéma de croissance contrasté avec de grandes grappes densément tassées, pendant 14 jours. Les caractères spécifiques des cellules ont été surveillés par coloration immunohistochimique, suivie d’une coloration de la phalloïdine et du DAPI, et l’abondance de l’actine a été observée dans les cellules Kelly et KellyCis83 sur des échafaudages de collagène-glycosaminoglycane. Pour l’évaluation de l’activité cellulaire in vitro, les niveaux sécrétés de chromogranine A ont été mesurés, et les cellules cultivées sur des échafaudages de collagène-glycosaminoglycane et de nano-hydroxyapatite de collagène ont produit plus de chromogranine A par rapport à la croissance sur culture 2D conventionnelle.

La lignée cellulaire KellyCis83 chimiorésistante a sécrété plus de chromogranine A que la lignée cellulaire Kelly. Après la fixation des cellules, les cellules peuvent être traitées avec diverses thérapies. Cela fournirait des résultats physiologiquement plus pertinents pour la réponse des cellules aux médicaments que la culture 2D conventionnelle.

Cette technique permet aux chercheurs de mieux explorer comment les cellules cancéreuses se comportent et réagissent à un stimulus dans le microenvironnement tumoral, allant de la réponse à la thérapeutique ou des interactions avec d’autres types de cellules.