Reconstruire le rétinoblastome humain in vitro

Le rétinoblastome humain est le type de cancer intraoculaire le plus courant chez les enfants. Les échantillons cliniques sont difficiles à obtenir et les modèles de souris ne peuvent pas former le rétinoblastome. Par conséquent, la génération in vitro de rétinoblastome est essentielle pour observer la genèse, la prolifération et la croissance du rétinoblastome, et pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.

L’efficacité de ce protocole peut atteindre environ 100%, bien que la durée de génération du rétinoblastome varie du jour 45 au jour 120. Pour le maintien du rétinoblastome un ou RB one knockout cellules souches embryonnaires humaines, culture du gène modifié H neuf cellules dans une plaque à six puits recouverte d’une matrice membranaire basale réduite par facteur de croissance et changer le milieu tous les jours. Pour faire passer les cellules, incuber dans un tampon EDTA pendant 3,5 minutes à 37 degrés Celsius ou cinq minutes à température ambiante.

Culture des cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence. Ensuite, pour initier la différenciation des cellules rétiniennes, retirez le milieu et rincez les cellules avec un millilitre de DPBS. Ensuite, élevez les colonies cellulaires en ajoutant un millilitre de tampon Dispase et en incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Observez les colonies cellulaires au microscope. Une fois que les bords des colonies commencent à se dérouler, aspirez le tampon Dispase et rincez doucement les cellules une fois avec un millilitre de DPBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu un dans le puits et, à l’aide d’une pointe de pipette standard de 10 microlitres, coupez les colonies en morceaux.

Utilisez un grattoir de cellules pour gratter les cellules restantes dans le milieu. Récoltez les cellules par centrifugation dans un tube de 15 millilitres. Après centrifugation, laisser environ 50 microlitres du surnageant disperser les cellules dans le milieu.

Ajoutez ensuite 250 microlitres de matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit et mélangez par agitation douce. Après mélange, placez le tube de 15 millilitres avec les cellules en suspension dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après une incubation de 20 minutes, les cellules et la matrice membranaire basale réduite en facteur de croissance devraient former un gel solidifié.

Ensuite, ajoutez un millilitre de moyen au tube de 15 millilitres. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, pipeter le gel solidifié deux à trois fois pour disperser l’amgot. Ajoutez ensuite neuf millilitres supplémentaires de milieu un et transférez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres.

Incuber le plat à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ceci est considéré comme le jour zéro. Le premier jour, examinez les cellules à l’aide d’un microscope.

En moyenne, trois à quatre kystes sont observés dans un morceau de gel. Le cinquième jour, changez le milieu en recueillant le surnageant dans un tube de 15 millilitres, permettant aux kystes de se déposer au fond et remplaçant le surnageant par un milieu frais. Dispersez les kystes dans le tube en deux boîtes de 10 centimètres, en assurant au moins 300 kystes dans chaque boîte.

Le septième jour, la plupart des kystes attachés au plat s’étendent et forment des colonies adhérentes. Le jour 10, changez le milieu avec un milieu frais, en veillant à ce que tous les kystes restent attachés au plat. Observez les cellules au microscope du 13e au 17e jour pour vous assurer qu’elles s’étendent.

Le jour 15, après avoir rincé les cellules une fois avec un millilitre de DPBS, ajoutez un millilitre de solution de Dispase et incuber à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, retirez le tampon Dispase et rincez doucement les cultures avec un millilitre de DPBS. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu deux à chaque plat de 10 centimètres et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, les cultures adhérentes se détachent spontanément et s’assemblent en organoïdes rétiniens. Trois jours après le détachement, recueillir les cellules de la boîte de culture cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Lorsque les organoïdes se déposent, retirez le surnageant du tube et transférez-les dans une nouvelle boîte de Petri non adhérente avec 10 millilitres de milieu deux pendant les quatre jours suivants.

Une semaine après le détachement, changer le milieu à milieu trois et à partir de ce jour, cultiver les organoïdes en milieu trois. Au jour 27 de la culture organoïde rétinienne, l’architecture des vésicules optiques est évidente et environ 90% des organoïdes présentent cette structure. La première détection du rétinoblastome a lieu au jour 45 et il devient palpable au jour 50.

Lorsqu’il atteint le 90e jour, les structures des vésicules optiques sont principalement enveloppées par le rétinoblastome. Le rétinoblastome peut maintenant être isolé et cultivé sous forme de lignée cellulaire. Au jour 105, plus de 80% des organoïdes rétiniens sont complètement enveloppés par le rétinoblastome.

Ces organoïdes expriment fortement le marqueur de prolifération Ki67 et le marqueur oncogène SYK par rapport aux neuf organoïdes rétiniens dérivés de H, indiquant une tumorigenèse. De plus, la forte expression du marqueur de précurseur de cône ARR3 et du marqueur de précurseur de photorécepteur CRX dans les organoïdes du rétinoblastome démontre qu’ils proviennent de cellules précurseurs de cônes. Les résultats inférieurs et supérieurs au cours des trois stades morphologiques de la génération du rétinoblastome sont décrits ici.

Les cellules souches embryonnaires humaines différenciées et indifférenciées peuvent être facilement distinguées en fonction de leur morphologie. Les cellules indifférenciées sont choisies pour la formation du rétinoblastome. Le cinquième jour, la sphère générée devrait être creuse plutôt que solide.

Le rétinoblastome est dérivé des organoïdes rétiniens qui présentent une architecture de vésicule optique. Aucun rétinoblastome n’est généré à partir des organoïdes inférieurs. Pendant l’exécution de la procédure, toutes les pointes doivent être refroidies et la matrice de membrane basale doit être fondue à quatre degrés avant de l’ajouter dans le tube.

Il s’agit d’une étape clé pour ce protocole de différenciation.