Name: Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Apprenez à implanter une fenêtre crânienne chronique chez des souris éveillées pour l'imagerie répétée de neurones et d'astrocytes. Cette méthode permet d'étudier la plasticité cérébrale et les altérations dans les maladies neurologiques.

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Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives approuvées par l’IACUC au Centre médical de l’Université du Nebraska.
1. Avant la chirurgie
<ol><li>Préparez des pipettes pour les injections virales. Tirez les capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur de pipette et biseautez la pipette à un angle de 20°. Stériliser les pipettes pendant la nuit.</li>
	<li>Préparez des morceaux frais de mousse de gel stérile en les coupant en petits carrés. Immergez la mousse de gel dans un tube de microfuge stérile contenant 0,5 mL de solution saline. Faire tremper la mousse de gel dans une solution saline pendant au moins 30 minutes avant utilisation.</li>
	<li>Préparez des morceaux frais de lanières d’éponge en les coupant en fines lanières.</li>
	<li>Vingt minutes avant la chirurgie, injecter par voie intrapéritonéale de 4 à 6 semaines de GLAST-CreER/GCaMP6f des souris de 0,2 mg/kg de dexaméthasone pour prévenir l’enflure du cerveau et 5 mg/kg de carprofène pour réduire l’inflammation. REMARQUE: Pour induire la recombinaison et l’expression de GCaMP6f dans environ 40% des astrocytes, des souris GLAST-CreER / GCaMP6f ont été injectées avec 100 mg / kg de tamoxifène à 3 semaines pendant 5 jours consécutifs.</li>
</ol>2. Début de la chirurgie
<ol><li>Après 20 min, anesthésier les souris avec 3% d’isoflurane avec de l’oxygène à un débit de 1 L/min pendant environ 1,5 min.</li>
	<li>Une fois anesthésiée, placez la souris sur un cadre stéréotaxique qui repose sur une couverture de recirculation d’eau pour maintenir une température corporelle de 37 ° C tout au long de la chirurgie. Fixez la souris au cadre à l’aide de la pince à museau et des barres d’oreille. Assurez-vous que la pince à museau et les barres d’oreille sont suffisamment stables pour que la tête ne bouge pas pendant la procédure, mais pas si serrées que le crâne soit endommagé.</li>
	<li>Maintenir l’anesthésie avec 1-1,5% d’isoflurane avec de l’oxygène à un débit de 1-2 L / min. Notez que certains animaux peuvent avoir besoin de plus ou moins d’isoflurane pour maintenir la sédation. Surveillez la respiration de l’animal ainsi que ses réflexes aux pincements des orteils et de la queue, et ajustez l’isoflurane de manière appropriée.</li>
	<li>Appliquez une pommade pour les yeux sur chaque œil à l’aide d’un applicateur à pointe de coton pour empêcher les yeux de se dessécher pendant la procédure.</li>
	<li>À l’aide de coupe-rongeurs, rasez les cheveux du cou jusqu’au-delà des yeux. Soyez prudent pour vous assurer que les moustaches de l’animal ne sont pas coupées accidentellement.</li>
	<li>Nettoyez la zone rasée avec un tampon de préparation à l’iode, suivi d’un tampon de préparation à l’alcool.</li>
	<li>À l’aide de pinces en tissu stérile et de ciseaux chirurgicaux, coupez et retirez la peau des sutures frontales antérieures à la bregma jusqu’au lambda.</li>
	<li>Une fois la peau enlevée, ajoutez environ 0,1 mL de xylocaïne à 1 % (lidocaïne avec épinéphrine 1:200 000) au crâne pour minimiser les saignements du crâne.</li>
	<li>À l’aide d’une lame chirurgicale stérile en acier au carbone de taille 11 attachée à un manche, grattez doucement le tissu conjonctif du crâne. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous retirez le tissu conjonctif près du bord du crâne, car tout tissu restant pourrait empêcher une forte adhérence du verre ou de la plaque de tête plus tard.</li>
	<li>Utilisez des pinces à tissu stérile pour enlever le tissu conjonctif lâche du crâne.</li>
	<li>À l’aide d’applicateurs de pointe en coton stériles, nettoyez toute xylocaïne restante du crâne.</li>
	<li>Une fois terminé, dégraissez soigneusement le crâne à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton trempé dans de l’acétone. Utilisez de l’air comprimé pour sécher immédiatement le crâne.</li>
</ol>3. Craniotomie
<ol><li>À l’aide d’un marqueur de point fin et d’une règle, mesurez la taille appropriée pour l’ouverture à l’emplacement souhaité. Confirmer la taille de l’ouverture en la comparant à la taille du verre de couverture (3 ou 5 mm de diamètre); assurez-vous que l’ouverture est légèrement plus petite que la taille du verre de couverture.</li>
	<li>À l’aide d’une perceuse dentaire, tracez progressivement le contour de l’ouverture, en amincissant l’os. Percez lentement pour éviter de percer l’os et percez en cercles concentriques pour faciliter même l’amincissement de l’os.</li>
	<li>Après chaque passage concentrique, ajoutez une goutte ou deux de solution saline stérile à la zone percée. Laissez la solution saline reposer pendant au moins 10 s pour empêcher l’os de surchauffer et d’endommager la dure-mère sous-jacente.</li>
	<li>Utilisez un applicateur de pointe en coton stérile pour absorber toute solution saline restante. Soufflez de l’air comprimé sur la zone pour vous assurer que toute la solution saline restante s’est évaporée avant de reprendre le forage. Faites-le pour souffler les débris osseux qui restent.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.2 à 3.4 jusqu’à ce que l’os soit correctement aminci pour être enlevé.</li>
	<li>Assurez-vous que l’os est correctement aminci pour être retiré en poussant doucement sur la zone centrale de l’os avec une pince fine pour vérifier que le crâne aminci bouge. La vascularisation sous-jacente doit être visible à l’endroit où le forage a eu lieu. Observez que l’os peut sembler se fissurer là où l’amincissement s’est produit. REMARQUE: L’entraînement à ce stade est crucial pour identifier quand l’os a été aminci de manière appropriée.</li>
	<li>Avant d’essayer de retirer l’os, vérifiez la souris pour vous assurer qu’elle est complètement sous sédation. Sinon, augmentez progressivement l’entretien de l’isoflurane pour prévenir l’enflure du cerveau lors de l’ablation de l’os.</li>
	<li>Ajouter un petit morceau de mousse de gel saturé de solution saline au crâne aminci. Ajouter une ou deux gouttes supplémentaires de solution saline au crâne aminci. REMARQUE: Avoir beaucoup de solution saline sur le crâne aminci aide à réduire les saignements et à protéger la dure-mère lors du retrait du lambeau osseux.</li>
	<li>À l’aide d’une lame miniature pointue à 15°, insérez soigneusement la lame dans l’os aminci et coupez-la le long de l’os aminci. Gardez la mousse de gel imbibée de solution saline, prête à arrêter les saignements qui peuvent survenir.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, soulevez et retirez soigneusement l’os. Soyez aussi doux que possible pour éviter d’endommager les tissus et le système vasculaire sous-jacents. Prenez un soin extrême à ne pas endommager la dure-mère.</li>
	<li>Une fois le lambeau osseux retiré, ajoutez un morceau frais de mousse de gel saturé de solution saline au cortex. Ajoutez quelques gouttes de solution saline pour empêcher la mousse de gel de se dessécher, car cela endommagerait le tissu sous-jacent.</li>
</ol>4. Injections virales
<ol><li>Effectuer des injections virales à l’aide d’un appareil stéréotaxique.<ol>
<li>Préparez AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titre de 3 × 1013 copies du génome (GC)/mL) à 1:5 000 par dilutions en série dans une solution saline.</li>
		<li>Préparez le mélange d’AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5 000) et AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titre de 5 × 1012 GC/mL) sur un petit morceau de parafilm.</li>
		<li>Remplissez une pipette en verre biseauté stérile d’une taille de pointe de 20 μm avec le mélange de virus en plaçant doucement la pipette sur la solution.</li>
		<li>Abaissez la pipette de sorte qu’elle touche simplement la surface du cerveau et continuez à baisser pendant 200 à 300 μm supplémentaires pour les injections de L2/3. À l’aide d’un système de distribution de micro-injection intracellulaire (voir le tableau des matériaux), injectez sous pression 12 à 15 fois sur 2 min (20 psi, durée d’impulsion de 9 ms). Observez le ménisque dans la pipette tomber à chaque injection pour s’assurer que la pipette n’est pas bloquée.</li>
		<li>Une fois injecté, laissez la pipette dans le cerveau pendant 4 à 5 minutes pour éviter tout reflux. Rétractez lentement la pipette.</li>
		<li>Répétez les injections à 2-3 sites (à environ 500 μm d’intervalle).</li>
		<li>Jetez les pipettes en verre, le parafilm, les embouts de pipette et les tubes de microfuge utilisés pour les dilutions en série du virus Cre dans de l’eau de Javel à 10%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Implantation de la fenêtre crânienne
<ol><li>Retirez toute mousse de gel et utilisez une petite bande de bandes d’éponge pour absorber toute solution saline restante.</li>
	<li>Ajouter quelques gouttes de l’antibiotique enrofloxacine (22,7 μg/mL) à l’ouverture et laisser y rester pendant 1 min. Après 1 min, utilisez un morceau frais de bande d’éponge pour absorber l’enrofloxacine restante. Répétez ce processus deux fois de plus.</li>
	<li>Après le troisième lavage, ajoutez quelques gouttes de solution saline à l’ouverture et laissez-la y rester pendant 1 min. Après 1 min, utilisez un morceau frais de bande d’éponge pour absorber toute solution saline restante. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus et après le troisième lavage, ajoutez une petite goutte de solution saline à l’ouverture.</li>
	<li>Placez le verre de couverture sur l’ouverture. Utilisez des pinces pour vous assurer que le verre est affleurant sur l’ouverture afin d’obtenir des images de bonne qualité.</li>
	<li>Tout en maintenant doucement le verre en place, appliquez un gel adhésif cyanoacrylate (Table des matériaux) autour du périmètre du verre pour sceller les bords de la fenêtre au crâne. Assurez-vous de ne pas laisser la colle s’infiltrer sous le verre de couverture et gardez autant de colle que possible sur la surface du verre de couverture.</li>
	<li>Appliquez une couche de super colle sur le gel adhésif. Ajouter une couche de liquide de ciment dentaire sur la colle pour lui permettre de durcir.</li>
	<li>Prenez une plaque de tête de type hélicoptère de taille appropriée et appliquez une fine couche de colle autour de l’ouverture centrale. Placez la plaque de tête sur le verre de couverture et laissez la colle sécher brièvement.</li>
	<li>Dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter de la poudre de ciment dentaire à la marque de 0,1 mL sur le tube. Ajouter 7 à 8 gouttes d’adhésif instantané à durcissement rapide et mélanger. Aspirer dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 19 G qui a été coupée pour créer une plus grande ouverture.</li>
	<li>Injecter le mélange à travers les trous latéraux de la barre de l’hélicoptère jusqu’à ce qu’il s’infiltre de chaque côté. Appliquez le mélange de ciment dentaire et d’adhésif sur le reste du crâne exposé pour fixer la plaque frontale au crâne, ce qui réduira les artefacts de mouvement pendant l’imagerie.</li>
	<li>Laisser sécher le mélange à l’air libre pendant au moins 15 min.</li>
	<li>Injecter à la souris 0,5 mL de solution saline par voie sous-cutanée pour aider à la récupération.</li>
</ol>6. Après l’opération
<ol><li>Retirez la souris du cadre stéréotaxique et retournez-la dans sa cage.</li>
	<li>Placez une partie de la cage sur une couverture de recirculation d’eau, des coussins chauffants en gel d’espace ou des coussinets isothermes pour aider à la récupération.</li>
	<li>Fournissez à l’animal une petite aide de granulés alimentaires et de nourriture humide, en plus de son régime alimentaire régulier, pour aider davantage à la récupération. Ajoutez de nouveaux granulés alimentaires et des aliments humides chaque jour après la chirurgie pendant toute la durée de la récupération.</li>
	<li>Le lendemain de la chirurgie, injectez une fois aux souris 5 mg / kg de carprofène et 5 mg / kg d’enrofloxacine.</li>
	<li>Aux jours 2 à 6, injecter aux souris une fois 5 mg/kg de carprofène et deux fois 5 mg/kg d’enrofloxacine, en attendant l’approbation de l’IACUC local. Séparer les injections d’enrofloxacine d’au moins 8 h.</li>
	<li>Les jours 7 à 20, injecter quotidiennement aux souris 5 mg / kg de carprofène.</li>
</ol>7. Habituation des animaux pour l’imagerie
<ol><li>Le jour 14 après la chirurgie, examinez la fenêtre crânienne pour la clarté optique. N’utilisez pas de souris dont les fenêtres ne sont pas claires ou autrement endommagées (c.-à-d. angiogenèse excessive).</li>
	<li>Vérifiez l’expression de tdTomato au microscope à fluorescence. Si des cellules marquées peuvent être identifiées, procédez à l’accoutumance animale.</li>
	<li>Premier jour d’accoutumance (manipulation)<ol>
<li>Tenez la souris pendant quelques minutes et retournez-la dans sa cage après l’avoir manipulée. Répétez la manipulation trois fois avec un intervalle de 15 minutes entre les séances.</li>
		<li>Après le troisième essai, habituez la souris en l’enveloppant dans un petit morceau de tissu.</li>
		<li>Tenez la souris enveloppée dans un chiffon pendant environ 1 min.</li>
		<li>Après l’essai, ramenez la souris dans sa cage. Répétez ce processus deux fois de plus, en permettant un intervalle de 15 minutes entre chaque essai.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deuxième jour d’accoutumance<ol>
<li>Pesez et enregistrez le poids de la souris.</li>
		<li>Enveloppez la souris dans un chiffon et fixez-la via sa plaque de tête au bras de fixation de la tête de la cage domestique soulevée par air.</li>
		<li>Laissez la cage de la maison exposée à la lumière.</li>
		<li>Laissez la souris rester sécurisée dans la cage du mobil-home pendant 15 min.</li>
		<li>Après l’accoutumance, retirez la souris de la cage de la maison et éteignez le flux d’air.</li>
		<li>Pesez la souris et retournez-la dans sa cage. Prenez soin de n’inclure que les souris qui ne perdent pas plus de 10% de leur poids corporel. Exclure les souris qui perdent plus de 10% de leur poids au cours de n’importe quelle journée d’accoutumance des expériences d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Troisième jour d’accoutumance et au-delà<ol>
<li>Pesez et enregistrez le poids de la souris avant de la fixer à la cage domestique soulevée par air.</li>
		<li>Fixez la souris à la cage de la maison soulevée par air.</li>
		<li>Couvrez la cage de la maison avec quelque chose qui fournira un intérieur sombre, comme une boîte, et laissez la souris rester sécurisée pendant 30 minutes.</li>
		<li>Après 30 minutes, découvrez la cage de la maison, retirez la souris et coupez le flux d’air.</li>
		<li>Pesez et enregistrez le poids de la souris après l’accoutumance.</li>
		<li>Répétez ce processus tous les jours, en augmentant de 15 minutes la durée pendant laquelle la souris est fixée à la cage de la maison. Continuez ce processus jusqu’à ce que la souris puisse être fixée à la cage domestique pendant 1,5 h, car il s’agit de la durée approximative d’une séance d’imagerie à deux photons.</li>
		<li>Pour habituer la souris au bruit, effectuez quelques séances d’accoutumance sur le microscope pour acclimater la souris aux sons des miroirs à balayage laser. Exclure les souris qui ne s’habituent pas suffisamment (c.-à-d. vocalisations et défécation induite par le stress).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Imagerie multiphotonique
<ol><li>Commencez l’imagerie 3 semaines après la chirurgie pour permettre à la fenêtre de se dégager.</li>
	<li>Effectuez des images sur un microscope multiphoton sur mesure ou disponible dans le commerce équipé d’un laser Ti:Sapphire. Acquérir des images à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (NA). REMARQUE: L’imagerie à deux canaux est obtenue à l’aide d’un miroir dichroïque de 565 nm et de deux tubes photomultiplicateurs externes. Un filtre passe-bande 535/50 est utilisé pour détecter les émissions GCaMP6f, et un filtre passe-bande 610/75 est utilisé pour détecter tdTomato. Un objectif d’immersion dans l’eau 25x (1,05 NA) et des scanners résonants ont été utilisés pour acquérir les images illustrées aux figures 1 et 2. Chaque région d’intérêt consistait en une pile d’images séparées axialement par 1 μm. Chaque section optique a été collectée à 512 x 512 pixels, 0,18 μm/pixel. Les images ont été acquises à partir de la région du membre antérieur du cortex moteur primaire déterminée par les coordonnées stéréotaxiques.</li>
	<li>Réglez la longueur d’onde du laser à 920 nm (990 nm si un GECI décalé vers le rouge est utilisé).</li>
	<li>Placez la souris sur la cage de la maison mobile et fixez la plaque frontale au bras de fixation de la tête.</li>
	<li>Ajoutez quelques gouttes d’eau au centre de la fenêtre.</li>
	<li>En utilisant le mode grand champ du microscope, sélectionnez 2-3 positions de vascularisation facilement identifiable. Enregistrez les images de ces vaisseaux sanguins et enregistrez les coordonnées X et Y qui apparaissent sur le contrôleur moteur pour déplacer les dendrites marquées tdTomato pour les séances d’imagerie ultérieures. Ajustez les coordonnées X et Y à chaque fois pour les réaligner avec les images enregistrées des vaisseaux sanguins.</li>
	<li>Une fois la vascularisation imagée et les positions enregistrées, localisez les régions avec des neurones exprimant tdTomato (Figure 1). Image des structures synaptiques (dendrites et axones) des neurones et de l’activité de GCaMP6f dans les astrocytes. REMARQUE: Les dendrites serviront de repères pour revenir de manière fiable dans les mêmes régions et imager les mêmes dendrites et astrocytes sur des jours répétés. Aucun décalage détectable dans le plan d’imagerie n’a été observé avec une fixation stable de la tête et après accoutumance à la fixation de la tête. Le déplacement qui se produit dans les directions X et Y est corrigé du mouvement.</li>
	<li>Après l’imagerie, ramenez la souris dans sa cage. REMARQUE: Les souris sont généralement maintenues sur la portée pendant un maximum de 2 h. Lorsque l’imagerie dure longtemps, l’eau sous l’objectif peut sécher. De l’eau doit être ajoutée pendant les expériences. Alternativement, un gel à ultrasons peut être utilisé à la place de l’eau.</li>
</ol>

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<li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422(2014).</li>
</ol>

Ici, nous avons présenté un protocole pour l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques pour l’imagerie in vivo d’astrocytes corticaux et de neurones chez des souris éveillées et retenues sur une cage domestique soulevée par air. Des exemples spécifiques ont été fournis de l’application de la fenêtre crânienne pour l’imagerie des astrocytes qui expriment les GECI et les structures synaptiques neuronales. Avec l’utilisation de la microscopie multiphotonique, la dynamique de signalisation du calcium astrocytai...

La capacité d’effectuer une microscopie à fluorescence multiphotonique in vivo dans le cortex de souris est primordiale pour l’étude de la signalisation cellulaire et de la structure 1,2,3,4,5,6,7,8,9, de la pathologie de la maladie 10,11 et du développement cellulaire12,13 . Avec l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques, l’imagerie longitudinale est possible, permettant une imagerie répétée des zones corticales pendant des jours, des semaines oudes mois 13,14 chez des animaux vivants. La microscopie multiphotonique est idéale pour l’imagerie in vivo et répétée en raison de l’amélioration du sondage en profondeur et de la réduction des photodommages associés au laser infrarouge utilisé. Cela permet d’étudier la dynamique moléculaire et cellulaire de cellules spécifiques dans diverses régions corticales.
La microscopie multiphotonique a été utilisée pour l’imagerie in vivo de cellules neuronales et gliales chez des souris 15,16,17,18,19,20. Diverses stratégies peuvent être mises en œuvre pour étiqueter des types de cellules et des domaines d’intérêt particuliers. Une approche courante consiste à stimuler l’expression de protéines fluorescentes génétiquement codées d’une manière spécifique à la cellule en utilisant le système de recombinaison Cre-Lox. Cela peut être effectué avec des souris génétiquement modifiées, par exemple en croisant une souris tdTomato « floxed » (Ai14) avec une souris exprimant la Cre-recombinase sous un promoteur d’intérêt21. Alternativement, le marquage spécifique aux cellules et au site peut être réalisé avec des injections virales. Ici, un virus codant pour la Cre recombinase sous un promoteur spécifique à la cellule et un virus codant pour un gène floxé d’intérêt sont injectés dans une région définie. Les types de cellules appropriés recevant les deux vecteurs viraux exprimeront alors le(s) gène(s) souhaité(s). Ces gènes peuvent être des marqueurs structurels, tels que tdTomato, pour visualiser les changements dans la morphologie cellulaire22 ou des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP et / ou RCaMP, pour examiner la dynamiquedu calcium 23. Les méthodes de recombinaison génétique peuvent être appliquées individuellement ou en combinaison pour marquer un ou plusieurs types de cellules. Une troisième approche, ne nécessitant pas de souris transgéniques ou de constructions virales (qui ont une capacité d’emballage limitée), consiste à électroporation in utero des constructions d’ADN24. Selon le moment de l’électroporation, différents types de cellules peuvent être ciblés 25,26,27.
Lors de l’imagerie multiphotonique, les souris peuvent être imagées alors qu’elles sont éveillées ou anesthésiées. L’imagerie des souris éveillées peut être réalisée en sécurisant la souris via une plaque de tête attachée28. Cette approche est rendue moins stressante en permettant un mouvement relativement libre de l’animal à l’aide de méthodes, telles que des balles en polystyrène flottant librement et soutenues par air29, des tapis roulants flottantlibrement 1 ou un système de cage domestique soulevé par air où les souris sont fixées par une plaque de tête attachée et autorisées à se déplacer dans une chambre ouverte30. Pour chacune de ces conditions d’imagerie, il sera d’abord nécessaire d’habituer les souris à la configuration d’imagerie. Cet article décrit la procédure d’accoutumance et d’imagerie à l’aide d’un système de cage domestique soulevé par air.
Ce protocole décrit l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale in vivo dans le cortex. Ici, nous utiliserons des souris qui expriment conditionnellement GCaMP6f dans les astrocytes pour surveiller la dynamique de signalisation du calcium. En outre, cet article décrit la procédure pour les injections virales en utilisant tdTomato comme étiquette pour les neurones. Cela permet de déterminer les changements dans la structure synaptique neuronale et / ou la disponibilité en tant que marqueur structurel permettant l’imagerie répétée du même astrocyte. Tout au long du protocole, des étapes cruciales seront mises en évidence pour assurer la meilleure qualité possible des images obtenues à partir de la microscopie multiphotonique.

<table><tbody><tr><td>15o Lame pointue</td><td>Surgistar</td><td>6500</td><td>Outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>19 g Aiguilles</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Fournitures de chirurgie</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>Vecteur viral</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>Vecteur viral</td></tr><tr><td>Acteone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Alcool Préparation Tampons</td><td>Fisher Scientific</td><td>Covidien 5750</td><td>Alimentation chirurgicale</td></tr><tr><td>Biseauteur</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement Verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Alimentation chirurgicale</td></tr><tr><td>Fraises carbure SS</td><td>White Dental</td><td>14717</td><td>Outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>Carprofène (Rimadyl), 50 mg/mL</td><td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.Drug</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Compressed Air</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022-523</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Applicateurs d’embout en coton</td><td>Puritan</td><td>836-WC NO BINDER</td> Verre de couverture <td>d’approvisionnement chirurgical</td></tr>, <tr><td>n° 1 épaisseur, 3 mm/5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720, 64-0700</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Foret dentaire</td><td>Équipement d’aseptique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone, 4 mg/mL</td><td>Mylan Institutional, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection de</td> médicaments <td>Nikon</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Duralay Liquid&nbsp ; (ciment dentaire liquide)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-8518</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Duralay Poudre&nbsp ; (poudre de ciment dentaire)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-7932</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Enrofloxacine, 2,27 %</td> <td>Bayer</td><td></td><td>Drug</td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Alimentation chirurgicale</td></tr><tr><td>Fiber Lite Illuminateur à haute intensité</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement Pinces (grande)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td>Outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>Pinces ( Small)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501764</td><td>Surgery Tools</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6 ; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td><td>The Jackson Laboratory N</td><td>° de stock : 024105</td><td>Ligne de souris</td></tr><tr><td>Germinator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>N° de stock : 012586</td><td>Mouse Line</td></tr><tr><td>Plaque de tête</td><td>Neurotar</td><td>Modèle 1, Modèle 3</td><td>Alimentation Chirurgie</td></tr><tr><td>Pince hémostatique</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td>Porte-outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>pour 15o lame pointue</td><td>World Precision Instruments 501247</td><td></td><td>Porte-outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>pour lames de scalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Outils</td></tr> <tr>chirurgicaux<td>Tampons de préparation à l’iode</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>Approvisionnement chirurgical</td><td></td></tr><tr><td>Système de table Isoflurane avec boîte à induction</td><td>Équipement d’appareil</td><td></td><td>Harvard</td></tr><tr><td>Vaporisateur d’isoflurane Équipement</td><td>SurgiVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colle Krazy Dépôt</td><td>de bureau</td><td>KG517</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>40140</td><td>adhésif instantané à durcissement rapide</td></tr><tr><td>Loctite 454</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9194415</td><td>gel adhésif cyanoacrylate</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td> Équipement <td>d’instruments</td><td></td><td>Sutter</td></tr><tr><td>Équipement de microscope</td><td></td><td></td><td></td>multiphotonique</tr><tr><td>Azote</td><td>Matheson</td><td>NI M200</td><td></td></tr><tr><td>Gaz Oxygène</td><td>Matheson</td><td>OX M250</td><td>Gas</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker</td><td></td><td>système de distribution de micro-injection intracellulaire</td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>17014340</td><td>Fournitures de chirurgie</td></tr><tr><td>Tondeuse à poils de rongeurs</td><td>Wahl</td><td></td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Saline (chlorure de sodium à 0,9 %)</td><td>Med Vet International</td><td>RX0.9NACL-30BAC</td><td>Fournitures</td></tr><tr><td>de chirurgie Lames de scalpel, taille 11</td><td>Integra</td><td>4-111</td><td>Outils chirurgicaux</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>503667</td><td>Outils chirurgicaux Instruments</td></tr><tr><td>stéréotaxiques</td><td>Équipement de stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sugi Sponge Strips (bandes d’éponge)</td><td>Kettenbach Dental</td><td>31002</td><td>Surgical Supply</td></tr><tr><td>SURGIFOAM (mousse de gel)</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>Seringue d’approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>avec aiguille de 26 g</td><td>BD</td><td>309625</td><td>Surgery Supply</td></tr><tr><td>Tamoxifène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Ti :Sapphire Laser Coherent</td><td></td><td>Equipment Pipettes</td><td></td></tr><tr>de<td>transfert</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Surgery Supply</td></tr><tr><td>Couverture d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Xylocaïne MPF avec épinéphrine (1:200 000), 10 mg/ mL</td><td>Fresenius Kabi États-Unis</td><td></td><td>Médicament</td></tr></tbody></table>

implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Pour bien comprendre la physiologie cellulaire des neurones et de la glie chez les animaux qui se comportent, il est nécessaire de visualiser leur morphologie et d’enregistrer leur activité in vivo chez les souris qui se comportent. Cet article décrit une méthode d’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour permettre l’imagerie longitudinale des cellules cérébrales chez des souris éveillées et retenues par la tête. En combinaison avec des stratégies génétiques et des injections virales, il est possible de marquer des cellules et des régions d’intérêt spécifiques avec des marqueurs structurels ou physiologiques. Ce protocole montre comment combiner des injections virales pour marquer les neurones à proximité des astrocytes exprimant GCaMP6 dans le cortex pour l’imagerie simultanée des deux cellules à travers une fenêtre crânienne. L’imagerie multiphotonique des mêmes cellules peut être effectuée pendant des jours, des semaines ou des mois chez des animaux éveillés et se comportant. Cette approche fournit aux chercheurs une méthode pour visualiser la dynamique cellulaire en temps réel et peut être appliquée pour répondre à un certain nombre de questions en neurosciences.

La qualité de la fenêtre crânienne peut être évaluée par la netteté des structures neuronales. Dans une bonne fenêtre, les épines dendritiques sont clairement visibles (Figure 1). Une fois les données structurelles et de position stockées, le même animal peut être imagé à plusieurs reprises pendant des jours, des semaines ou des mois pour examiner les mêmes cellules (Figure 1). Les images de la figure 1 ont été obtenues à partir de ...

Présenté ici est un protocole pour l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale des cellules du cerveau chez des souris éveillées et retenues par la tête.

Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Le protocole décrit comment effectuer des injections virales et implanter une fenêtre crânienne pour l’imagerie des cellules cérébrales chez des souris éveillées et retenues par la tête. L’avantage de cette méthode est que la structure et l’activité des neurones et des astrocytes peuvent être imagées à plusieurs reprises sur plusieurs séances. Cette approche peut être utilisée pour déterminer comment les cellules neurales sont modifiées dans des modèles de troubles neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs, ou si la plasticité dépendante de l’expérience est altérée.Commencez par fixer une souris anesthésiée à un cadre stéréotaxique à l’aide de la pince à museau et des barres d’oreille. À l’aide d’outils chirurgicaux stériles, coupez et retirez la peau des sutures frontales antérieures au bregma à postérieurement au lambda. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile en acier au carbone de taille 11, grattez doucement tout le tissu conjonctif du crâne.À l’aide d’une perceuse dentaire, percez progressivement l’os du crâne le long du contour de l’ouverture en cercles concentriques pour faciliter l’amincissement uniforme de l’os. Après chaque passage concentrique, ajoutez une goutte ou deux de solution saline à la zone forée et laissez la solution saline reposer pendant au moins 10 secondes avant de reprendre le forage. Appuyez doucement sur la zone centrale de l’os du crâne avec une pince fine pour vérifier que le crâne est correctement aminci et bouge.Assurez-vous que le système vasculaire sous-jacent où le forage a eu lieu est intact et que l’os n’est pas fissuré. Insérez soigneusement une lame pointue miniature à 15 degrés dans l’os aminci et coupez et utilisez la mousse de gel imbibée de solution saline pour arrêter tout saignement qui pourrait survenir. À l’aide de pinces, soulevez et retirez soigneusement l’os, en prenant soin de ne pas endommager la dure-mère.Pour l’injection, remplissez une pipette en verre biseauté stérile avec une pointe de 20 micromètres avec le mélange de virus. Ensuite, abaissez la pipette pour toucher la surface du cerveau et continuez à baisser pendant 200 à 300 micromètres supplémentaires pour les injections de couche 2/3. À l’aide d’un système de distribution de micro-injection intracellulaire, injectez de la pression dans le système 12 à 15 fois en deux minutes.Pour l’implantation de la fenêtre crânienne, placez le verre de couverture sur l’ouverture dans le crâne. Utilisez des pinces pour vous assurer que le verre est au ras de l’ouverture. Pour sceller les bords de la fenêtre en verre au crâne, appliquez un gel adhésif cyanoacrylate autour du périmètre de la surface du verre.Sur le gel adhésif, appliquez une couche de colle. Ajoutez ensuite une couche de liquide de ciment dentaire. Lorsque le ciment dentaire durcit, appliquez une fine couche de colle autour de l’ouverture centrale de la plaque de tête de type hélicoptère et placez la plaque de tête de type hélicoptère de la taille appropriée sur le verre de couverture.Laissez sécher la colle. Ajouter la poudre de ciment dentaire dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre jusqu’à la marque de 0,1 millilitre. Mélangez sept à huit gouttes d’adhésif instantané à durcissement rapide dans la poudre et aspirez le mélange résultant dans une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 19 qui a été coupée pour créer une plus grande ouverture.Injecter le mélange de poudre à travers les trous latéraux de la barre d’hélicoptère jusqu’à ce qu’il s’infiltre de chaque côté. Appliquez le mélange adhésif de ciment dentaire sur le reste du crâne exposé pour fixer la plaque de tête au crâne. Enveloppez la souris dans un chiffon et fixez-la via sa plaque de tête au bras de fixation de la tête de la cage domestique transportée par avion, puis laissez la cage domestique exposée à la lumière.Après un temps d’accoutumance de 15 minutes, retirez la souris de la cage de la maison. En utilisant le mode grand champ du microscope, sélectionnez deux à trois positions de vascularisation facilement identifiable. Enregistrez les images des vaisseaux sanguins et enregistrez les coordonnées x et y qui apparaissent sur le contrôleur du moteur.Imagez les structures synaptiques des neurones et l’activité de GCaMP6f dans les astrocytes. Dans l’analyse représentative, la qualité de la fenêtre crânienne a été évaluée avec une imagerie répétée des dendrites et des astrocytes exprimant GCaMP6f au fil des jours. Dans une bonne fenêtre, les structures neuronales semblaient nettes avec des épines dendritiques clairement visibles.Deux nouvelles épines sont apparues le deuxième jour de l’imagerie. Une seule colonne vertébrale a persisté et était visible le cinquième jour. L’activité calcique a été étudiée dans les astrocytes exprimant GCaMP6f à différents moments.Un événement mondial englobant toute la cellule a été observé lors d’un combat de locomotion. Les deux étapes critiques de ce protocole sont que l’os doit être correctement aminci avant le retrait de l’os et le placement approprié du verre de couverture sur l’ouverture. L’imagerie peut être combinée à l’analyse comportementale, soit pendant l’imagerie, soit après le comportement, comme l’apprentissage d’une nouvelle habileté motrice, pour déterminer comment la structure et la fonction neuronales et astrocytaires sont modulées par l’apprentissage.

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En combinant une poli et renforcé vulnérabilité de la victime (ports) crânienne injection fenêtre et le glioblastome cellule (GBM), on peut observer l'initiation gliome et la croissance des cellules de glioblastome injectées dans le cerveau d'une souris vivante longitudinalement.

Imagerie gliome Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Grâce à une poli et renforcé mince crâne fenêtre crânienne

Cette vidéo présente une procédure chirurgicale visant à implanter une fenêtre crânienne dans un modèle de souris pour un accès optique stable à différentes régions du cerveau.

Implantation d’une fenêtre d’imagerie crânienne dans un modèle murin : une procédure chirurgicale pour implanter une lamelle à base de verre pour un accès optique stable aux régions du cerveau murin

Cette vidéo démontre l'enregistrement de l'activité neuronale du cerveau à travers une fenêtre optique chez des souris transgéniques. Les souris expriment une protéine fluorescente qui permet de détecter les activités neuronales. Une petite partie du crâne est soigneusement retirée pour installer une fenêtre optique, puis le crâne est recouvert de ciment noir pour bloquer la lumière avant l’imagerie.

Installation de fenêtres optiques dans le cerveau de souris transgéniques pour imager les activités neuronales

Source : Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomie et implantation de la fenêtre de la moelle épinière chez la souris. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre l’implantation d’une fenêtre de la moelle épinière chez une souris anesthésiée pour l’imagerie in vivo. Le protocole stabilise la moelle épinière exposée à l’aide d’un verre de couverture en borosilicate et d’une plaque arrière imprimée en 3D. Cette méthode permet la microscopie à deux photons à haute résolution pour étudier la dynamique de la...

Implantation d’une fenêtre de moelle épinière chez une souris pour l’imagerie in vivo

Ce protocole décrit une technique chronique d’implantation de fenêtre crânienne qui peut être employée pour l’imagerie longitudinale des structures neuro-glio-vasculaires, des interactions, et de la fonction dans les conditions saines et malades. Il sert d’alternative complémentaire à l’approche d’imagerie transcrânienne qui, bien que souvent préférée, possède certaines limites critiques.

Cartographie précise du cerveau pour effectuer l’imagerie in vivo répétitive de la dynamique neuro-immune chez les souris

Ce protocole décrit une nouvelle fenêtre d’imagerie mammaire avec un couvercle remplaçable (R.MIW). La microscopie intravitale après implantation du R.MIW permet une imagerie longitudinale et multi-jours de la glande mammaire saine et malade avec une résolution cellulaire au cours des différents stades de développement.

Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Le présent protocole décrit la fabrication d’une grande fenêtre crânienne (6 x 3 mm2) à l’aide d’une pellicule alimentaire, de silicone transparent et de verre de couverture. Cette fenêtre crânienne permet des expériences in vivo d’imagerie calcique à grand champ et à deux photons chez la même souris.

In vivo Imagerie calcique à grand champ et à deux photons d’une souris utilisant une grande fenêtre crânienne

Cette étude démontre l’administration d’un traumatisme crânien répétitif à des souris et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale ultérieure d’un EGFP exprimé par neurone à l’aide de la microscopie à deux photons.

Imagerie intravitale de l’expression de protéines fluorescentes chez des souris présentant un traumatisme crânien à crâne fermé et une fenêtre crânienne à l’aide d’un microscope à deux photons

Ce protocole contient une description détaillée d’une approche étape par étape pour un modèle murin à fenêtre crânienne chronique et embolie microvasculaire, optimisé pour l’imagerie in vivo à deux photons utilisant des microsphères fluorescentes en polystyrène.

Modèle murin d’embolie microvasculaire pour microscopie à deux photons in vivo utilisant des microspheres en polystyrène fluorescent

Ce protocole décrit une méthode chirurgicale en deux phases pour créer une grande fenêtre crânienne re-scellable et conservatrice de la dure-mère chez la souris. Cette technique permet des enregistrements électrophysiologiques chroniques et multimodaux à partir de réseaux transmis et profonds du cerveau, tels que le Default Mode Network, sur plusieurs semaines.

Protocole chirurgical pour une grande fenêtre crânienne refermable permettant des enregistrements électrophysiologiques longitudinaux et multimodaux du réseau en mode par défaut de la souris

Apprenez à implanter une fenêtre crânienne chronique chez des souris éveillées pour l'imagerie répétée de neurones et d'astrocytes. Cette méthode permet d'étudier la plasticité cérébrale et les altérations dans les maladies neurologiques.

Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

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